CN105112542B - 一种用srap分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法，利用14对SRAP引物(SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.28)，对10个常用的扁穗雀麦品种进行PCR扩增，产生的99个差异位点经过“1”和“0”赋值来构建品种指纹图谱，并用以品种真实性的鉴定。本发明应用SRAP分子标记技术以更灵敏和高效的鉴定手段对扁穗雀麦品种进行准确鉴定，与常规的形态检验相比，结果更稳定、可靠，且具有快速简单、直观实用等特点。

Description

一种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学分子标记领域，具体地说涉及一种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法。
背景技术
扁穗雀麦(BromuscatharticusVahl.)属于禾本科雀麦属植物，冷季型一年生或越年生优质禾草，在我国西南、华中、华北等地大多作为一年生或越年生牧草加以利用。该草种具有产量高、冬春季生长快、分蘖多、适应性强的特性，是冬春季的优良补饲牧草，还具有营养价值较高、叶量丰富、适口性好、种子成熟后仍能保持青绿等特点，是冬春季的优良补饲牧草，同时由于其根系发达还被广泛用于水土流失治理。基于上述原因，扁穗雀麦在长江中上游地区愈来愈受到育种家和牧草种植者的重视。扁穗雀麦为自花授粉植物，种质群体内部的一致性较高，目前国内外育种主要是对野生或逸生种质资源利用混合选择，选育出表现优良后代群体，如国审品种“黔南”和“江夏”等，国外利用混合选择或综合品种选育法登记的品种约为26个。近年来草地畜牧业的不断发展和壮大，扁穗雀麦等一年生饲草品种在南方农区得以大面积推广，草种子需求量日益增加。由于生产、管理、经营不规范，不合格种子甚至假种频繁混入市场，不仅对养殖场和农户造成了一定损失，同时损害了品种权拥有者的利益和广大农民的经济利益，破坏了市场秩序。因此，建立扁穗品种快速可靠的鉴定技术体系对于其品种和种质资源的研究与保护及草种和畜牧业的持续发展均具有重要的意义。
目前对于扁穗雀麦等牧草品种的鉴定仍只是传统形态鉴定法，这依赖于品种之间的表型差异，而形态性状受到气候、环境、营养状态和物候期等多种因素影响，且形态鉴定法工作量大、鉴定周期长、成本很高。而同工酶和种子贮藏蛋白多态性不够丰富，且同工酶有组织特异性、稳定性差，这对于扁穗雀麦品种鉴定、推广利用和育种等工作造成不利影响。
分子标记能反映生物个体或种群基因组中具有差异特征的DNA片段，具有丰富的多态性和环境稳定性，且操作简便，近年来已经广泛应用到植物品种鉴定和种质资源分类等研究领域。目前，应用较多的是ISSR、SSR、AFLP和SRAP等分子标记。相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)是由美国加州大学Li和Quiros于2001年提出的一种基于PCR的通用型分子标记方法。SRAP通常为显性标记，呈Mendel式遗传，具有很好的稳定性和多态性，因而是非常理想的分子标记。其技术的原理是使用一个17碱基正向引物和一个18碱基反向引物扩增基因的开放阅读框(open readingframe，ORF)。因为正反引物分别扩增基因组的不同区域，充分利用了非编码区和编码区的碱基序列差异，因此SRAP标记在基因组中是均匀分布，可以覆盖整个基因组，利用少数的引物就可以进行不同组合的扩增，这将大大提高引物的多态性扩增丰富度和使用率，同时也节约合成引物的成本。由于SRAP标记具备RAPD标记操作的简易性和AFLP分子标记的高扩增多态性，目前SRAP分子标记已经在各个领域已有广泛的应用，如植物的遗传多样性、品种鉴定、指纹图谱绘制、连锁图谱构建等方面。。但在扁穗雀麦中，应用SRAP分子标记技术进行品种或种质资源鉴定、构建品种指纹图谱的方法尚未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法使该方法能够利用SRAP分子标记技术准确、简便的鉴定扁穗雀麦品种和其它种质资源。
为实现上述目的，本发明技术方案如下：
一种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法，包括如下步骤：
S1、以10个常用的扁穗雀麦品种幼苗植株为材料，每个品种选取10株，每株选取无病害幼嫩叶片1片，将10片分别来自不同植株的叶片等重量混合，提取每个品种的总DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测各品种总DNA纯度以及完整性，用紫外分光光度计测定各品种总DNA在260nm和280nm处的吸光值，确定DNA的纯度及浓度。取各品种少量原始DNA溶液稀释至10ng/uL，于-20℃保存备用；
S2、以步骤S1所得的DNA进行SRAP-PCR扩增，扩增产物用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；200V电压预电泳30min，每孔上样6μL，400V恒压电泳，直至指示带距胶底部3-5cm，停止电泳；用0.1％AgNO3染色，在NaOH溶液中显影，照相观察并记录结果；
S3、根据每对引物扩增产物的凝胶电泳结果建立指纹图谱，以扁穗雀麦品种编号为横行，以每条谱带的位点编号及其分子量为纵行，在每一横纵坐标交结处，有扩增谱带就标记为“1”，无扩增谱带就标记为“0”，分别绘制每对引物对供试品种的DNA指纹图谱表；
S4、利用Freetree软件计算供试扁穗雀麦品种之间的Dice遗传距离系数，进行类平均法(UPGMA)聚类分析，获得能反映获知供试品种间的亲缘关系的树状图(含bootstrap支持率)，获知供10个常见扁穗雀麦新品种间的亲缘关系。
其中，所述扁穗雀麦品种包括国内审定的2个品种-“黔南”和“江夏”。
其中，所述的步骤S2中SRAP-PCR扩增采用15μL PCR反应体系，2×Taq PCR Mix(400μM dNTPs、15mMTris-HCl、75mMKCl、2.0mM MgCl2)7.5μl、模板DNA 3μl(10ng/μL)、上下游引物均为0.9μL(5μM)、Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，灭菌水补足15μL；
其中，所述的步骤S2中PCR扩增程序为：94℃变性5min，1个循环；94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸90s，共5个循环；之后35个循环：94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸90s；最后72℃延伸10min；4℃保存。
其中，所述SRAP-PCR扩增中采用的引物共14对，28条，包括SEQ ID NO.1～NO.28。
上述方法可用于获知未知材料与已知常见的扁穗雀麦品种之间的亲缘关系，鉴定扁穗雀麦种子的真假。
本发明选取10个在生产中常用的扁穗雀麦品种为供试材料，采用400对SRAP引物(上下游各20条)分别扩增上述扁穗雀麦品种的DNA，根据10个扁穗雀麦品种的SRAP-PCR扩增谱带的特异性、多态性以及带型的易区分程度进行筛选，筛选出在不同品种间能够扩增出多态性丰富、带型清晰而且能够稳定重复的特征谱带的引物对，共计14对，28条，并经Freetree软件检验无重合。在本发明所述方法的指纹图谱构建过程中，所述将有扩增条带标记为1、无扩增条带标记0，以便用于相关分析软件，提高数据分析效率。此外，品种编号为横坐标、条带编号为纵坐标，或者采取相反的做法，这属于数据格式的不同，本发明不做具体限制。采用本发明构建的扁穗雀麦DNA指纹图谱，可以根据扁穗雀麦品种数量增加及品种的更新换代等需要不断增加和更新，以满足草地畜牧业生产中扁穗雀麦品种真实性鉴定的需要。除此之外，按照本发明所述方法还可以将表1常用扁穗雀麦品种外的其他种质资源构建SRAP指纹图谱，如此便可鉴定更多的待测扁穗雀麦品种或种质。同时，待测扁穗雀麦品种SRAP指纹图谱与已经构建的SRAP指纹图谱比对时，需要计算出品种间的遗传距离或相似系数，来判定品种间的亲缘关系和区分品种。
本发明的有益效果在于：
本发明选取适合于扁穗雀麦的高多态性SRAP引物，应用SRAP分子标记技术构建常用扁穗雀麦品种的DNA指纹图谱，有利于对扁穗雀麦品种及种质资源进行快速、准确的鉴定，且操作简单实用，结果稳定可靠，为扁穗雀麦品种和其它种质资源的准确鉴定、育种利用和新品种知识产权保护提供了重要依据，为扁穗雀麦种质资源标准指纹库的构建初步奠定了技术基础。
附图说明
图1为引物组合11F6R(No.9和No.10)对10个国内外主要扁穗雀麦品种的扩增结果电泳图(M：marker50bp；1-10：表1中所列的10个扁穗雀麦品种)。
图2为引物组合18F10R(No.21和No.22)对10个国内外主要扁穗雀麦品种的扩增结果电泳图(M：marker50bp；1-10：表1中所列的10个扁穗雀麦品种)。
图3为本发明实施例1中构建的品种间的亲缘关系的树状图。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法，包括如下步骤：
S1、DNA提取：以扁穗雀麦品种幼苗植株为材料，每个品种选取10株，每株选取无病害幼嫩叶片1片，将10片分别来自不同植株的叶片等重量混合，提取每个品种的总DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测各品种总DNA纯度以及完整性，用紫外分光光度计测定各品种总DNA在260nm和280nm处的吸光值，确定DNA的纯度及浓度。取各品种少量原始DNA溶液稀释至10ng/uL，于-20℃保存备用；
S2、SRAP-PCR扩增及电泳检测：
15μL PCR反应体系中，2×Taq PCR Mix(400μM dNTPs、15mMTris-HCl、75mMKCl、2.0mM MgCl2)7.5μl、模板DNA 3μl(10ng/L)、上下游引物均为0.9μL(5μM)、Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，灭菌水补足15μL。
PCR扩增程序：94℃变性5min，1个循环；94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸90s，共5个循环；之后35个循环：94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸90s；最后72℃延伸10min；4℃保存。
PCR扩增产物用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。200V电压预电泳30min，每孔上样6μL，400V恒压电泳，直至指示带距胶底部3-5cm，停止电泳；用0.1％AgNO3染色，在NaOH溶液中显影；照相观察并记录结果。
S3、DNA指纹图谱构建：根据每对引物扩增产物的凝胶电泳结果建立指纹图谱，即以扁穗雀麦品种编号为横行，以每条谱带的位点编号及其分子量为纵行，在每一横纵坐标交结处，有扩增谱带就标记为“1”，无扩增谱带就标记为“0”，分别绘制每对引物对供试品种的DNA指纹图谱表。
S2、以表2所列10个品种为例，利用14对，28条引物的扩增结果构建的指纹图谱表，如下(以6f6r-358为例，“6f6r”表示上下游引物标号，“-358”表示多态性谱带的分子量为358bp)。
指纹图谱表中的二元数据，利用Freetree软件计算供试扁穗雀麦品种之间的Dice遗传距离系数，进行类平均法(UPGMA)聚类分析，获得能反映获知供试品种间的亲缘关系的树状图，含bootstrap支持率。
根据供试品种间的Dice遗传距离系数获得的聚类树形图。该图能够区分所有供试品种，说明本方法构建的品种DNA指纹图谱是有效的。
S4、利用构建的DNA指纹图谱进行扁穗雀麦新品种或种质鉴定：
用步骤S2中所述14对，28条引物对待鉴定的未知扁穗雀麦品种或种质材料的基因组DNA进行SRAP-PCR扩增、电泳，将得到的电泳图谱与步骤三中所构建的指纹图谱比较，获知未知材料与已知常见的扁穗雀麦品种之间的亲缘关系。待鉴定的品种如果声称是在上述条件下构建指纹图谱的10个主要扁穗雀麦品种之一，但待鉴定品种的指纹图谱却与声称的原品种不一致，即可判定即为假种子。
所述SRAP-PCR扩增中采用的引物组合共计14对，28条，具体见表1，品种的DNA指纹图谱表是以这14对，28条SRAP引物组合的扩增谱带信息构建的。
表1引物序列表如下：
引物序号 引物编号 上游引物(5′→3′) 引物序号 引物编号 下游引物(5′→3′)
NO.1 6F6R taggtccaaaccggcac NO.2 6F6R gactgcgtacgaattcac
NO.3 7F7R taggtccaaaccggcca NO.4 7F7R gactgcgtacgaattcca
NO.5 9F1R taggtccaaaccggcgg NO.6 9F1R gactgcgtacgaattaag
NO.7 9F18R taggtccaaaccggcgg NO.8 9F18R gactgcgtacgaatttcg
NO.9 11F6R taggtccaaaccggctt NO.10 11F6R gactgcgtacgaattcac
NO.11 13F9R taggtccaaaccgggga NO.12 13F9R gactgcgtacgaattcgg
NO.13 13F19R taggtccaaaccgggga NO.14 13F19R gactgcgtacgaatttct
NO.15 14F3R taggtccaaaccggggt NO.16 14F3R gactgcgtacgaattact
NO.17 17F7R taggtccaaaccggtat NO.18 17F7R gactgcgtacgaattcca
NO.19 18F4R taggtccaaaccggtcg NO.20 18F4R gactgcgtacgaattaga
NO.21 18F10R taggtccaaaccggtcg NO.22 18F10R gactgcgtacgaattctc
NO.23 18F17R taggtccaaaccggtcg NO.24 18F17R gactgcgtacgaatttat
NO.25 18F18R taggtccaaaccggtcg NO.26 18F18R gactgcgtacgaatttcg
NO.27 20F10R taggtccaaaccggttc NO.28 20F10R gactgcgtacgaattctc
所述DNA指纹图谱是以扁穗雀麦品种编号、扩增谱带编号(引物名称+条带分子量)及“1”“0”阵列为基本信息，便于检索和鉴定。DNA指纹图谱中，每个扁穗雀麦品种都有其特异的DNA指纹，能将供试品种逐个鉴别开来。
实施例1
本实施例采用国内外主推的10个扁穗雀麦品种为供试材料，提取幼苗总DNA为模板，进行指定的14对，28条SRAP引物的PCR扩增，对扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据电泳谱带建立各供试样品的SRAP分子标记指纹图谱，将所构建的SRAP指纹图谱用于扁穗雀麦品种的鉴定和种质资源亲缘关系分析。
具体步骤按如下进行：
一、DNA提取：
以10个国内外主推扁穗雀麦品种幼苗植株为材料，每个品种选取10株，每株选取无病害幼嫩叶片1片，将10片分别来自不同植株的叶片等重量混合，提取每个品种的总DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测各品种总DNA纯度以及完整性，用紫外分光光度计测定各品种总DNA在260nm和280nm处的吸光值，确定DNA的纯度及浓度。取各品种少量原始DNA溶液稀释至10ng/uL，于-20℃保存备用。
二、SRAP-PCR扩增及电泳检测：
15μL PCR反应体系中，2×Taq PCR Mix(400μM dNTPs、15mMTris-HCl、75mMKCl、2.0mM MgCl2)7.5μl、模板DNA 3μl(10ng/L)、上下游引物均为0.9μL(5μM)、Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，灭菌水补足15μL。
PCR扩增程序：94℃变性5min，1个循环；94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸90s，共5个循环；之后35个循环：94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸90s；最后72℃延伸10min；4℃保存。
PCR扩增产物用6％的聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝19∶1，1×TBE缓冲液)电泳分离。200V电压预电泳30min，每孔上样6μL，400V恒压电泳，直至指示带距胶底部3-5cm，停止电泳；用0.1％AgNO3染色，在NaOH溶液中显影；照相观察并记录结果。
三、国内外10个主推扁穗雀麦品种的DNA指纹图谱构建：
根据每对引物扩增产物的凝胶电泳结果建立指纹图谱，即以扁穗雀麦品种编号为横行，以每条谱带的位点编号及其分子量为纵行，在每一横纵坐标交结处，有扩增谱带就标记为“1”，无扩增谱带就标记为“0”，分别绘制每对引物对供试品种的DNA指纹图谱表。
图1为引物组合11F6R(No.9和No.10)对10个国内外主要扁穗雀麦品种的扩增结果电泳图(M：marker50bp；1-10：表1中所列的10个扁穗雀麦品种)；
图2为引物组合18F10R(No.21和No.22)对10个国内外主要扁穗雀麦品种的扩增结果电泳图(M：marker50bp；1-10：表1中所列的10个扁穗雀麦品种)。
综合14对，28条引物组合的扩增结果，构建10个品种指纹图谱表，如下(以6f6r-358为例，“6f6r”表示上下游引物标号，“-358”表示多态性谱带的分子量为358bp)。
指纹图谱表中的二元数据，利用Freetree软件计算供试扁穗雀麦品种之间的Dice遗传距离系数，进行类平均法(UPGMA)聚类分析，获得能反映获知供试品种间的亲缘关系的树状图，含bootstrap支持率(如图3所示)
四、利用构建的DNA指纹图谱进行扁穗雀麦新品种或种质鉴定：
用步骤二中所述14对，28条引物对待鉴定的未知扁穗雀麦品种或种质材料的基因组DNA进行SRAP-PCR扩增、电泳，将得到的电泳图谱与步骤三中所构建的指纹图谱比较，获知未知材料与已知常见的扁穗雀麦品种之间的亲缘关系。待鉴定的品种如果声称是在上述条件下构建指纹图谱的10个主要扁穗雀麦品种之一，但待鉴定品种的指纹图谱却与声称的原品种不一致，即可判定即为假种子。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、以10个常用的扁穗雀麦品种幼苗植株为材料，每个品种选取10株，每株选取无病害幼嫩叶片1片，将10片分别来自不同植株的叶片等重量混合，提取每个品种的总DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测各品种总DNA纯度以及完整性，用紫外分光光度计测定各品种总DNA在260nm和280nm处的吸光值，确定DNA的纯度及浓度，取各品种少量原始DNA溶液稀释至10ng/uL，于-20℃保存备用；
S2、以步骤S1所得的DNA进行SRAP-PCR扩增，扩增产物用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；200V电压预电泳30min，每孔上样6μL，400V恒压电泳，直至指示带距胶底部3-5cm，停止电泳；用0.1％AgNO3染色，在NaOH溶液中显影，照相观察并记录结果；
S3、根据每对引物扩增产物的凝胶电泳结果建立指纹图谱，以扁穗雀麦品种编号为横行，以每条谱带的位点编号及其分子量为纵行，在每一横纵坐标交结处，有扩增谱带就标记为“1”，无扩增谱带就标记为“0”，分别绘制每对引物对供试品种的DNA指纹图谱表；
S4、利用Freetree软件计算供试扁穗雀麦品种之间的Dice遗传距离系数，进行类平均法(UPGMA)聚类分析，获得能反映供试品种间的亲缘关系的树状图，含bootstrap支持率，获知供试 10个常见扁穗雀麦新品种间的亲缘关系；
其中，所述步骤S2中SRAP-PCR扩增中采用的引物共14对，28条，包括SEQ ID NO.1～NO.28。
2.根据权利要求1所述的一种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法，其特征在于，所述扁穗雀麦品种包括国内审定的2个品种-“黔南”和“江夏”。
3.根据权利要求1所述的一种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法，其特征在于，所述的步骤S2中SRAP-PCR扩增采用15μL PCR反应体系，2×Taq PCR Mix 7.5μl、浓度为10ng/μL的模板DNA 3μl、浓度为5μM的上下游引物均为0.9μL、浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶0.2μL，灭菌水补足15μL；
其中，所述2×Taq PCR Mix为400μM dNTPs、15mM Tris-HCl、75mM KCl、2.0mM MgCl2。
4.根据权利要求1所述的一种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法，其特征在于，所述的步骤S2中PCR扩增程序为：94℃变性5min，1个循环；94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸90s，共5个循环；之后35个循环：94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸90s；最后72℃延伸10min；4℃保存。
5.根据权利要求1所述的一种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法的应用，其特征在于，用于获知未知材料与已知常见的扁穗雀麦品种之间的亲缘关系。
6.根据权利要求1所述的一种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法的应用，其特征在于，用于鉴定扁穗雀麦种子的真假。
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Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction- its application to mapping and gene tagging in Brassica;G. Li等;《Theor Appl Genet》;20011230;第103卷(第2期);第455–461页 *
三叶草遗传多样性的SRAP分析;李润芳 等;《草业学报》;20101231;第27卷(第12期);第53-57页 *
不同秋眠性苜蓿SRAP体系优化及遗传多样性分析;何庆元 等;《草业学报》;20110430;第20卷(第2期);第201-209页 *
不同种源黑龙骨遗传关系的SRAP分析;刘志飞等;《农业生物技术学报》;20140731;第22卷(第7期);摘要，第866页表2 *
中国西南区扁穗牛鞭草种质遗传多样性的SRAP分析;范彦 等;《基因组学与应用生物学》;20100131;第29卷(第1期);第63-70页 *
分子标记技术在牧草遗传多样性上的研究进展;胡豆豆 等;《河南农业科学》;20121130;第41卷(第11期);摘要，第10页表1，第2.1、2.3-2.4节 *
烟草主要栽培类型的SRAP标记研究;王日新 等;《生物技术通报》;20090630(第6期);第100-104页 *
青藏高原和新疆地区垂穗披碱草种质的SRAP及RAPD分析;苗佳敏 等;《草地学报》;20110331;第19卷(第2期);第306-316页 *

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