CN107557487B - 燕麦dna分子指纹图谱的构建方法及应用 - Google Patents
燕麦dna分子指纹图谱的构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了燕麦DNA分子指纹图谱的构建方法及应用。本方法针对燕麦基因组设计了一套特异性SSR分子标记引物(SEQ ID NO:1‑20)，利用该引物对燕麦基因组DNA进行PCR扩增，可以产生长度不同的扩增产物，通过对产物长度的分析检测构建不同燕麦品种特征指纹图谱，实现品种鉴定。与常规形态鉴定相比，利用本发明方法进行品种鉴定方法耗时短、不受环境影响、方便快捷且结果准确可靠，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和植物品种鉴别技术领域，具体地说，涉及燕麦DNA分子指纹图谱的构建方法及应用。
背景技术
燕麦(Avena L.)属禾本科燕麦属一年生草本植物，是重要的粮食和饲草饲料作物，广泛分布于世界各地。根据燕麦籽粒带壳与否，可把燕麦分为皮燕麦和裸燕麦两大类，欧美等国家栽培的燕麦以皮燕麦为主，研究也主要针对皮燕麦；中国是大粒裸燕麦的起源中心，裸燕麦在中国有着悠久的栽培历史，迄今在各个燕麦主产区仍然主要种植裸燕麦。燕麦营养丰富，是谷物中最好的全价营养食品之一，与小麦、水稻、玉米等作物相比，燕麦籽粒中的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质元素等营养指标均位居前列，此外，燕麦中还含有丰富的可溶性膳食纤维。国内外大量研究证明燕麦能够降血脂和胆固醇且无副作用，具有调节人体免疫功能，增强抵抗力和抑制糖尿病等作用[Ripsin CM,Keenan JM,JacobsDR,Elmer PJ,Welch RR,Van Horn L,Liu K,Turnbull WH,Thye FW,Kestin M,Hegsted M,Davidson DM,Davidson MH,Dugan LD,Demark-Wahnefried W,Beling S.Oat productsand lipid lowering.J Am Med Assoc.1992,267(24):3317-3325]，是谷物中最好的全价营养食品之一。
近年来，随着燕麦的保健功能为越来越多的人所认知以及国家对科研投入的增加，燕麦新品种的选育研究有了很大的进步，迫切需要一种能够快速鉴定燕麦新品种的方法，以便能够进行品种确认以及对品种权实施保护。传统的形态学鉴定方法通过不同品种间表型性状差异对不同品种进行鉴定，虽然直观可靠，但鉴定过程繁琐费力，所需时间长，而且对表型性状相近的品种鉴别困难；DNA分子标记能够利用不同品种在DNA分子水平上的差异来对不同品种进行鉴定，其中SSR(Simple Sequence Repeats)分子标记因其具有共显性、多态性高、扩增稳定、快速经济等特点而应用最为普遍。SSR也称为微卫星DNA(Microsatellite DNA)，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单元组成的串联重复序列。其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)稳定性好，便于不同的研究平台相互合作交流。因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图谱的绘制等研究中。但SSR标记的发掘要经过对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及筛选等步骤，因而其开发费用相当高，目前还没有建立燕麦品种DNA指纹图谱从而鉴别品种的报道。申请人前期通过重组富集文库的方法开发出大量燕麦SSR分子标记，已成功应用于燕麦遗传图谱构建、目标基因定位以及种质资源多样性等研究中(Wu B,Lu P,Zhang Z.Recombinant microsatelliteamplification:a rapid method for developing simple sequence repeatmarkers.Mol Breeding.2012,29:53–59)，为燕麦品种的分子鉴定提供了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、准确、低成本的燕麦DNA分子指纹图谱的构建方法及应用。
为了实现本发明目的，本发明以30份代表性燕麦品种基因组DNA为模板，通过分析SSR标记等位位点数、多态性信息含量值以及可重复性等指标，筛选出10对SSR引物，通过这些引物组成的分子标记组合可以完全鉴别30份燕麦品种的差异。
选取的30份代表性燕麦品种分别为：品燕一号，宁莜一号，陇燕二号，定莜一号，坝莜一号，坝莜九号，白燕二号，白燕七号，白引燕一号，草莜一号，花晚6号，花早2号，张燕7号，科燕一号，品五，坝燕四号，五寨莜麦，丽江燕麦，五燕五号，华北一号，早燕麦1号，冀杂二号，和丰一号，晋燕七号，雁红十号，同系一号，高千一号，巴燕一号，内燕六号，锡燕一号。
筛选燕麦核心SSR引物的方法为：
步骤一，初筛引物：通过PCR及电泳筛选出在不同燕麦品种间具有多态性、带型清晰且能够稳定重复的SSR初筛引物；
步骤二，复筛引物：在步骤一获得的SSR初筛引物中筛选出在燕麦品种间多态性信息含量值高、等位位点数多的SSR引物作为燕麦品种指纹图谱库构建的核心引物，根据核心引物的等位位点个数划分类群，将处在同一位点的品种划分为同一类群；
步骤三，将其他引物在在步骤二划分的类群中划分亚类群，以此类推，直到把各类群分到只有一个品种为止。
基于上述筛选方法，本发明提供一套燕麦核心SSR引物，包括10对核心SSR引物，分别对应于表1中M01～M10，引物信息如下：
表1 10对核心SSR引物信息
本发明还提供含有所述核心SSR引物的检测试剂或试剂盒。
本发明还提供所述核心SSR引物、或所述检测试剂或试剂盒在鉴定燕麦品种中的应用。
本发明还提供所述核心SSR引物、或所述检测试剂或试剂盒在燕麦种质资源遗传改良中的应用。
本发明还提供所述核心SSR引物、或所述检测试剂或试剂盒在燕麦分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供一种燕麦DNA分子指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
1)提取待测燕麦的基因组DNA；
2)以提取的DNA为模板，分别利用表1所述的每对核心SSR引物进行PCR扩增；
3)分析PCR扩增产物，构建燕麦DNA分子指纹图谱。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，51-60℃退火30s(具体退火温度见表1)，72℃延伸1min，30-35个循环；最后72℃延伸5min。
PCR扩增体系为：100ng/μL模板DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液2μL，10mmol/L dNTP0.4μL，10pmol/L上、下游引物各1μL，5U/μL TaqDNA聚合酶0.2μL，加ddH2O至总体积20μL。
前述的方法，利用ABI 3730xl测序仪检测分析扩增产物的长度，建立各品种SSR标记长度信息数据，得到的信息列表即为燕麦品种的DNA分子指纹图谱。
本发明进一步提供上述方法在鉴定燕麦品种中的应用。具体如下：
利用表1所述核心SSR引物分别对待测燕麦品种的DNA进行PCR扩增；利用ABI3730xl测序仪检测分析扩增产物的长度，将得到的指纹图谱与采用相同方法获得的已知燕麦品种的特征指纹图谱进行比对，确定待测燕麦品种。
本发明燕麦DNA指纹图谱的构建方法，利用了核心SSR引物对某一燕麦品种DNA进行扩增，得到一个特定的指纹，而一组SSR引物对该特定的品种进行DNA扩增则赋予该品种一组DNA指纹，本发明方法采用引物组合鉴别的方法对引物进行再次分析和筛选，使每一个品种都找到相对应的DNA指纹图谱，从而区分不同的品种。以相关品种为对照，本发明方法可以有效地鉴别燕麦种子真伪，防止假冒伪劣品种进入市场，同时也为燕麦品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术参考。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 10对核心SSR引物的获得
本实施例以我国不同产区有代表性的30个燕麦品种(来源于国家农作物种质资源保存中心)基因组DNA为模板，通过分析SSR标记等位位点数目、多态性信息含量值以及可重复性等指标，筛选出10对SSR引物，通过这些引物组成的分子标记组合可以完全鉴别30份燕麦品种的差异。
30份代表性燕麦品种分别为：品燕一号，宁莜一号，陇燕二号，定莜一号，坝莜一号，坝莜九号，白燕二号，白燕七号，白引燕一号，草莜一号，花晚6号，花早2号，张燕7号，科燕一号，品五，坝燕四号，五寨莜麦，丽江燕麦，五燕五号，华北一号，早燕麦1号，冀杂二号，和丰一号，晋燕七号，雁红十号，同系一号，高千一号，巴燕一号，内燕六号，锡燕一号。
步骤一，初筛引物：通过PCR和电泳筛选出在不同燕麦品种间具有多态性、带型清晰且能够稳定重复的SSR初筛引物；
步骤二，复筛引物：在步骤一获得的SSR初筛引物中筛选出在燕麦品种间多态性信息含量值高、等位位点数多的SSR引物作为燕麦品种指纹图谱库构建的核心引物，根据核心引物的等位位点个数划分类群，将处在同一位点的品种划分为同一类群；
步骤三，将其他引物在在步骤二划分的类群中划分亚类群，以此类推，直到把各类群分到只有一个品种为止。
基于上述筛选方法，本发明最终得到10对燕麦SSR核心引物(表1)。
实施例2 燕麦品种特征指纹图谱的构建与燕麦品种鉴定方法的建立
1、燕麦品种基因组DNA提取
将燕麦种植于土壤中，室温培养，长出两周后取各品种燕麦幼嫩的叶片0.2g于1.5mL离心管中，加入液氮研磨成粉末。采用CTAB法提取DNA，操作实验步骤按照试剂盒说明书进行。用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测总DNA的浓度，然后将总DNA稀释成100ng/μL，储存于-20℃备用。
2、以实施例1所述30份燕麦品种为材料，利用筛选得到的10对SSR引物分别各燕麦品种的DNA进行PCR扩增，PCR反应试验中采用的PCR反应体系为20μL体系：1μL的模板DNA(100ng/μL)，2μL的10×PCR缓冲液，0.4μL的dNTP(10mmol/L)，1μL上下游引物(10pmol/L)，0.2μL的Taq酶(5U/μL)，加ddH2O至20μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，51-60℃退火30s(具体退火温度见表1)，72℃延伸1min，进行30-35个循环，最后72℃延伸5min。
3、燕麦品种DNA特征指纹图谱的构建
扩增产物的长度采用毛细管荧光电泳法在ABI 3730xl测序仪上进行检测，检测结果用Genemapper软件进行分析得到扩增产物大小(bp)，统计实施实施例1所述30份燕麦品种SSR基因型信息数据库，按照引物顺序进行编码，得到的指纹代码即为该品种的指纹图谱(表2)。
表2 利用10对核心SSR引物构建30个代表性燕麦品种的指纹信息
4、鉴定燕麦品种方法的建立
(1)提取待测燕麦品种的DNA，以表1的10对引物对分别对待测燕麦品种的DNA进行PCR扩增；20μL PCR反应体系：1μL的模板DNA(100ng/μL)，2μL的10×PCR缓冲液，0.4μL的dNTP(10mmol/L)，1μL上下游引物(10pmol/L)，0.2μL的Taq酶(5U/μL)，加ddH2O至20μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，51-60℃退火30s(具体退火温度见表1)，72℃延伸1min，进行30-35个循环，最后72℃延伸5min。
(2)扩增产物的长度采用毛细管荧光电泳法在ABI 3730xl测序仪上进行检测，检测结果用Genemapper软件进行分析得到扩增产物大小，将得到的待测燕麦品种指纹代码，与上述3中的燕麦品种的特征指纹图谱进行比对，确定待测燕麦品种。
实施例3 本发明鉴定燕麦品种方法的应用
取2个燕麦品种(与实施例1中产地不同)作为验证材料，利用筛选的核心引物对2个燕麦进行扩增，采用实施例2的方法对未知样品构建指纹图谱，得到的指纹图谱如表3所示。
表3 待测测品种(品种1和品种2)指纹图谱
| 名称 | M01 | M02 | M03 | M04 | M05 | M06 | M07 | M08 | M09 | M10 |
| 品种1 | 132 | 119 | 210 | 176 | 253 | 206 | 263 | 286 | 214 | 180 |
| 品种2 | 128 | 110 | 202 | 172 | 255 | 215 | 275 | 274 | 223 | 180 |
将得到的指纹图谱表3与上述已知燕麦品种的特征指纹图谱表2进行比对，发现待测品种与表2中“坝莜一号”和“白燕二号”的指纹代码相同，说明彼此是相同的品种。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 燕麦DNA分子指纹图谱的构建方法及应用
<130> KHP171115851.0
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtaaatctca tggtctttgc ac 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaacatacat gcggtctcat tc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgacgacgac gatgacgatg at 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggaggaaat agcctggttg ca 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgaactctt gaagcaagca gc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttcccagcc gtcgattcac aa 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgaacttacc aggtgccacg ac 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgggctgat gtaaatctac gc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caagcagcaa acagtcccct at 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acagctccaa ccatttggac ac 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccccttcttc cctgaccagc tc 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacagtgttc acctccgcca ta 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgggatcagt ggttccagat ta 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgatagccca gactcagttg tt 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tctgtccacc accaccggat ca 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccgacacgca tgagtaggag ga 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgactgcaac tcacggtctt ct 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
taccagattt gctgctgatt ga 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tggatggtgc attgacaagg at 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acaccagcta gtctgaagaa ag 22
Claims (10)
1.燕麦核心SSR引物，其特征在于，包括10对核心SSR引物，分别对应于表1中M01～M10，引物信息如下：
表1 10对核心SSR引物信息
2.含有权利要求1所述核心SSR引物的检测试剂或试剂盒。
3.权利要求1所述核心SSR引物、或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在鉴定燕麦品种中的应用。
4.权利要求1所述核心SSR引物、或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在燕麦种质资源遗传改良中的应用。
5.燕麦DNA分子指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测燕麦的基因组DNA；
2)以提取的DNA为模板，分别利用权利要求1所述的每对核心SSR引物进行PCR扩增；
3)分析PCR扩增产物，构建燕麦DNA分子指纹图谱。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，51-60℃退火30s，72℃延伸1min，30-35个循环；最后72℃延伸5min。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)PCR扩增体系为：100ng/μL模板DNA1μL，10×PCR反应缓冲液2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，10pmol/L上、下游引物各1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，加ddH2O至总体积20μL。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)利用ABI 3730xl测序仪检测分析扩增产物的长度，建立各品种SSR标记长度信息数据，得到的信息列表即为燕麦品种的DNA分子指纹图谱。
9.权利要求5-8任一项所述方法在鉴定燕麦品种中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，利用权利要求1所述核心SSR引物分别对待测燕麦品种的DNA进行PCR扩增；利用ABI 3730xl测序仪检测分析扩增产物的长度，将得到的指纹图谱与采用相同方法获得的已知燕麦品种的特征指纹图谱进行比对，确定待测燕麦品种。
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Granted publication date: 20191206 Termination date: 20200920 |