CN108330132A - 一种人工合成cry1Ah1基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人工合成cry1Ah1基因及其应用，该人工合成cry1Ah1基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示或如SEQ ID NO.3所示。本发明选取Bt杀虫基因crylAh1基因野生型序列为原始序列对cry1Ah1基因编码区全长起始密码子开始第64nt‑1998nt杀虫关键区域共645个氨基酸，在不改变原有氨基酸一级序列的前提下进行密码子优化，获得cry1Ah1‑B基因和cry1Ah1‑U基因，将优化后的基因与优化前基因的所有基因翻译的蛋白经过tBlastX比较均完全一致。对转cry1Ah1改造基因植株的RT‑PCR鉴定分析，表明cry1Ah1‑B、cry1Ah1‑U与野生cry1Ah1基因表达效率有明显差别，转Bt基因杨树的ELISA测定结果表明，包括对照组在内的所有株系总蛋白量保持在24.013mg/g~26.667mg/g之间，虫试结果较为良好的株系中A‑3‑4、A‑5‑0、A‑5‑23和Z‑1‑3四个株系的毒蛋白含量在4669.38ng/g~9342.33ng/g之间，抗虫效果明显。

Description

一种人工合成cry1Ah1基因及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种人工合成cry1Ah1基因及其应用。
背景技术
抗虫转基因植物最重要的就是杀虫蛋白的表达量及活性，由于在进行Bt基因转化植物时，多选用对害虫具有高毒力的基因，并且已知杀虫活性关键区域，在进行基因优化和修饰时不会对基因表达的氨基酸序列做出改变，故不会影响最终杀虫蛋白的活性。所以提高外源抗虫基因在植物中的表达量是转抗虫基因植物基因工程重要研究方向。Bt基因的表达量越高，植物的抗虫效果越好。植物的抗虫性还要受到害虫对植物的侵蚀部位和季节性的影响，综合考虑这些因素以便于实现杀虫基因表达的更好的效果。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种人工合成cry1Ah1基因及其应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种人工合成cry1Ah1基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的人工合成cry1Ah1基因在表达Bt蛋白中的应用。
所述的人工合成cry1Ah1基因在转基因杨树中的应用。
一种人工合成cry1Ah1基因，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
所述的人工合成cry1Ah1基因在表达Bt蛋白中的应用。
所述的人工合成cry1Ah1基因在转基因杨树中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明选取Bt杀虫基因crylAh1(64nt-1998nt)基因野生型序列为原始序列对cry1Ah1基因编码区全长起始密码子开始第64nt-1998nt杀虫关键区域共645个氨基酸，在不改变原有氨基酸一级序列的前提下进行密码子优化，获得cry1Ah1-B基因和cry1Ah1-U基因，将优化后的基因与优化前基因的所有基因翻译的蛋白经过tBlastX比较均完全一致。对转cry1Ah1改造基因植株的RT-PCR鉴定分析，表明cry1Ah1-B、cry1Ah1-U与野生cry1Ah1基因表达效率有明显差别，cry1Ah1-U基因mRNA相对水平表达量的均值为0.032556，cry1Ah1-B基因mRNA相对水平表达量的均值为0.004044，野生cry1Ah1基因mRNA相对水平表达量的均值为0.000275。转Bt基因杨树的ELISA测定结果表明，包括对照组在内的所有株系总蛋白量保持在24.013mg/g～26.667mg/g之间，虫试结果较为良好的株系中A-3-4、A-5-0、A-5-23和Z-1-3四个株系的毒蛋白含量在4669.38ng/g～9342.33ng/g之间，占总蛋白表达量的比重是在0.0183％～0.0387％之间，均在0.01％以上。总体而言，毒蛋白表达量越高、占总蛋白表达量越高，越容易使美国白蛾体内毒素累积起到杀虫作用，抗虫效果也就越好。
附图说明
图1是cry1Ah1优化前后基因tBlastX比较图；
图2是试纸条检测Bt蛋白的表达位置结果图；
图3是转化南林895杨过程图；图中，A：杨树叶盘；B：抗性芽的筛选；C：抗性愈伤再生小苗；D：再生植株生根；
图4是转cry1Ah1-B基因杨树抗性植株基因组PCR检测结果图；图中，M：DNAMarker；CK+：阳性质粒；CK-：非转基因南林895杨；1-15：转基因NL895杨；
图5是转cry1Ah1-U基因南林895杨抗性植株基因组PCR检测结果图；图中，M：DNAMarker；CK+：阳性质粒；CK-：非转基因南林895杨；1-15：转基因NL895杨；
图6是Bt蛋白标准曲线图；
图7是转Bt基因抗虫杨树的ELISA测定结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例中，没有做出具体说明的操作，均按照本领域的常规方法或参照分子生物学实验手册进行即可。
实施例1
根据现有的高频密码子算法对欧洲山杨的92个基因32397个、毛白杨的54个基因共18377个密码子、银白杨和欧洲山杨所得杂交杨11个基因共1918个密码子、欧洲黑杨49个基因共15002个密码子、颤杨的55个基因24984个密码子、毛果杨的173个基因115716个密码子、毛果杨和美洲黑杨所得杂交杨的41个基因14531个密码子、美洲黑杨的20个基因9894个密码子、欧洲山杨与颤杨的杂交杨114个基因48153个密码子、欧洲山杨和银白杨所得杂交杨72个基因共29918个密码子的密码子使用频率进行了统计，结果见表1，从表1中可以看出不同杨属植物最优密码子大部分均相同，如Ile、Val和Ala等。但也有些氨基酸所使用的最优密码子有所不同，如phe和Pro。即使不相同的，如脯氨酸所使用的同义密码子有CCU、CCC、CCA、CCG，均以AT结尾的密码子为最优密码子，CCU和CCA在不同种杨树中的使用频率均大大高于以CG结尾的密码子。虽然只使用了20个美洲黑杨的基因进行分析，但是结合本表，可以判断出美洲黑杨的密码子使用频率高低依次为：TTT:TTC；TTA:TTG:CTT:CTC:CTA:CTG；GTT:GTC:GTA:GTG；CCT:CCC:CCA:CCG；ACT:ACC:ACA:ACG；GCT:GCC:GCA:GCG；TAT:TAC；TAA:TAG；CAT:CAC；CAA:CAG；AAT:AAC；AAA:AAG；GAT:GAC；GAA:GAG；TGT:TGC；CGT:CGC:CGA:CGG:AGA:AGG；GGT:GGC:GGA:GGG；AGT:AGC:TCT:TCC:TCA:TCG。
表1 杨树高频密码子分析表
选取Bt杀虫基因crylAh1(64nt-1998nt)基因野生型序列为原始序列利用表1对cry1Ah1基因编码区全长起始密码子开始第64nt-1998nt杀虫关键区域共645个氨基酸，在不改变原有氨基酸一级序列的前提下进行密码子优化，得到两种优化方式，共长2155bp，cry1Ah1-B基因(碱基序列如SEQ ID NO.2所示)是未进行最优密码子全部替换全序列，cry1Ah1-U基因(碱基序列如SEQ ID NO.3所示)是进行最优密码子全部替换全序列，cry1Ah1-0基因(碱基序列如SEQ ID NO.1所示)是原始野生Bt菌中的基因，将优化后的基因与优化前基因的所有基因翻译的蛋白经过tBlastX比较均完全一致，如图1所示。cry1Ah1基因优化前后物理参数的比较，如表2所示。
表2 cry1Ah1基因优化前后物理参数的比较
注：最小自由能为mRNA二级结构最小自由能。
实施例2
1、实施例1人工改造后的cry1Ah1杀虫基因，进行人工合成，然后进行原核表达载体构建的蛋白检测
菌体用北京康为世纪生物技术有限公司生产的细菌蛋白提取试剂盒提取细胞质总蛋白和包涵体总蛋白，然后用金标Bt试纸条检测Bt蛋白(如果检测液内含有Bt蛋白，在试纸条的质控带下方会出现一条检测带)，分别对发酵液上清、包涵体提取液和细胞裂解后可溶蛋白液体进行试纸条检测，结果表明PET-Bt、PET-Bt-U,PET-Bt-B菌株表达的蛋白都位于包涵体内(如图2)，原核表达结果说明优化后的基因在E.coli中能正常表达。
2、载体构建和南林895杨的遗传转化
通过gateway技术，将cry1Ah1-B和cry1Ah1-U基因从入门载体pENTR上转入植物表达载体pGWB402上，得到含有目的基因的植物表达载体pGWB402-cry1Ah1B和pGWB402-cry1Ah1U。然后将含有目的基因的植物表达载体pGWB402-cry1Ah1B和pGWB402-cry1Ah1U转入根癌农杆菌LBA4404中，利用农杆菌介导的转化方法分别将含有pGWB402-cry1Ah1B和pGWB402-cry1Ah1U质粒的根癌农杆菌LBA4404转入南林895杨树，转化过程如图3所示。得到经过抗生素筛选为阳性的植株，转pGWB402-cry1Ah1B的南林895杨抗性植株67株、转pGWB402-cry1Ah1U72的南林895杨抗性植株58株。
3、转cry1Ah1改造基因植株的PCR检测
用全序列人工合成的cry1Ah1-B和转cry1Ah1-U基因杨树基因杨树部分片段PCR引物对转基因植株进行PCR检测，cry1Ah1-B的PCR检测扩增结果如图4所示，质粒和部分抗性植株得了扩增的目的条带487bp，cry1Ah1-U的PCR检测扩增结果如图5所示，质粒和部分抗性植株得了扩增的目的条带452bp，而阴性对照植株(非转基因南林895杨)则没有出现此特异扩增片段。以上结果说明，转基因植株中存在目的基因。
4、转cry1Ah1改造基因植株的RT-PCR鉴定分析
选用actin(NM_197297)管家基因构建的标准质粒做内参基因标准品，实时定量PCR的结果如表3所示，从表3可以看出，cry1Ah1-B、cry1Ah1-U、cry1Ah1-0基因表达效率有明显差别。cry1Ah1-U基因mRNA相对水平表达量的均值为0.032556，cry1Ah1-B基因mRNA相对水平表达量的均值为0.004044，未改造的cry1Ah1-0基因mRNA相对水平表达量的均值为0.000275。
表3 各样品目的基因相对转录水平
实施例3转基因杨树的毒蛋白分析
1、杨树品种
本申请人培育的转Bt(Cry1Ah1-U)基因南林895杨，包括16个株系：A-1、A-3-0、A-3-2、A-3-4、A-4-36、A-4-6、A-5-0、A-5-23、A-7、X-1、X-2-0、X-2-3、X-2-6、X-2-7、Z-1-1、Z-1-3。以上株系均于2016年4月定值于温室，并于当年10月中旬取每株系杨树第3～5片展开叶数片放入冰盒带回实验室后放入-80℃冰箱保存待用。
2、植物总蛋白的提取
采用一步法总蛋白提取试剂盒提取蛋白。具体步骤为：(1)取样品各1g放入液氮过夜。(2)在液氮环境下将叶片研磨成淡绿色粉末状，并将粉末放入1.5mL离心管。(3)在离心管中加入1mL的裂解液，在4℃环境下裂解20分钟，期间每过5分钟震荡一次。(4)4℃，14000rpm/min离心30分钟。将上清液取出转移至新离心管，并在-80℃环境下保存。
3、植物总蛋白浓度的测定
采用BCA总蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。BCA法测定蛋白浓度原理基于双缩脲反应，肽键在碱性条件下将Cu2+还原为Cu+出从而生成红紫色络合物并在562nm出有较强的吸光度，反应吸光度与蛋白浓度为线性关系，因此绘制总蛋白浓度标准曲线后可测得待测样品吸光度对应蛋白浓度。具有较低误差且灵敏度高。总蛋白浓度测定的具体步骤如下：
(1)准备：2mg/mL BSA蛋白标准液的配制。将BSA标准品30mg与1mL蛋白标准品配制液混合，充分溶解后制得30mg/mL的BSA蛋白标准液母液。随后取母液20μL用蛋白样品溶解液稀释至300μL配制成2mg/mL BSA蛋白标准液待用。BCA工作液的配制。取0.4mL BCA试剂B用BCA试剂A稀释至20mL配制成BCA工作液。打开水浴锅至37℃待用。
(2)加样：所有加样中蛋白标准品和待测样品全部设置两次重复。其中依次在相应微孔中加入2mg/mL BSA蛋白标准液25μL、20μL、12μL、8μL、4μL、2μL、1μL补足蛋白样品溶解液至25μL。依次在相应微孔中加入待测样品1μL并补足蛋白样品溶解液至25μL。设置空白孔加入蛋白样品溶解液25μL。
(3)反应：在每孔中加入200μL BCA工作液，轻微震荡混匀后37℃反应30min。
(4)测定：将微孔板取用并冷却至室温，小心去除微孔中的气泡，将微孔板放至酶标仪并调节酶标仪吸光度至562nm波长，测量各个微孔的OD值。
(5)绘图：根据标准品浓度梯度和吸光度绘制标准曲线，并根据标准曲线计算各个样品的总蛋白浓度。
4、用ELISA测定Bt毒蛋白含量
Bt毒蛋白的含量测定。采用美国Agdia公司ELISA试剂盒测定各株系的Bt毒蛋白含量。具体实验步骤如下：
(1)准备：将酶联免疫试剂盒从冰箱取出并在室温下平衡30min。期间取待测样品5μL用蛋白提取液稀释至100μL待用。打开水浴锅并调节至37℃。
(2)加样：根据表4中的位置和加样量添加标准品、空白孔和待测样品。其中每孔最终补足ddH2O至50μL。(本试剂盒提供的标准品浓度为180ng/mL，因此经过表中加样可得到162ng/mL、126ng/mL、90ng/mL、54ng/mL、36ng/mL、18ng/mL、7.2ng/mL七个浓度梯度的标准品孔)
(3)温育：用封板膜封板，将酶标板小心放入密封袋放入37℃的水浴锅中温育30min。
(4)配液：用200mL容量瓶将30倍浓缩洗涤液用ddH2O稀释30倍后待用。
(5)洗涤：小心揭掉封板膜并弃掉液体，甩干，每孔加满洗涤液并静置30s，随后弃去。重复5次，拍干。
(6)加酶：除去空白孔外，每孔加入酶标试剂50μl。
(7)温育：封膜，放入密封袋密封后放入37℃水浴锅温育30min。
(8)洗涤：取出酶标版揭掉封板膜并弃去液体，甩干每孔加入洗涤液静置30s，随后弃去废液。一共重复5次，最后拍干。
(9)显色：每孔加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl。震荡混匀后用封板膜封板，放入密封袋并放入37℃水浴锅中避光显色15min。
(10)终止：每孔加入终止液50μl，终止反应。
(11)测定：在酶标仪上测定450nm吸光度，并以空白孔调零计算标准品和样品的OD值。绘制Bt蛋白的标准曲线。
表4：ELISA实验加样位置及加样量表
酶标板序号 样品名称 加样量/μL 酶标板序号 样品名称 加样量/μL
A1～A2 标准品 45 F3～F5 A-4-6 10
B1～B2 标准品 35 G3～G5 A-5-0 10
C1～C2 标准品 25 H3～H5 A-5-23 10
D1～D2 标准品 15 A6～A8 A-7 10
E1～E2 标准品 10 B6～B8 X-1 10
F1～F2 标准品 5 C6～C8 X-2-0 10
G1～G2 标准品 2 D6～D8 X-2-3 10
H1～H2 空白对照 0 E6～E8 X-2-6 10
A3～A5 A-1 10 F6～F8 X-2-7 10
B3～B5 A-3-0 10 G6～G8 Z-1-1 10
C3～C5 A-3-2 10 H6～H8 Z-1-3 10
D3～D5 A-3-4 10 A9～A11 CK 10
E3～E5 A-4-36 10
为了准确测定转基因植株样品毒蛋白的浓度，在ELISA实验中设置了7个梯度每个梯度两个重复的标准蛋白作为阳性对照。根据各个标准蛋白微孔的OD值与相应蛋白浓度建立Bt蛋白的标准曲线，以OD值为纵坐标目的蛋白浓度为横坐标。结果如图6所示，表明目的蛋白浓度与OD值之间有良好的线性关系：
目的蛋白浓度(ng/mL)＝200×OD值-0.0094
(注：由总蛋白提取时取样量和ELISA实验前稀释倍数可知，目的蛋白浓度(ng/mL)和毒蛋白含量(ng/g)的换算关系为1:100)。
对各个株系进行ELISA反应，反应最终显色为黄色，反应结果见图7。经酶标仪测定，得出各个株系OD值结果见表5。根据同批实验的标准蛋白对照绘制的蛋白标准曲线计算样品中Bt蛋白的浓度，计算结果见下表。根据总蛋白浓度计算蛋白占总蛋白浓度。
表5：转Bt基因杨树的ELISA测定结果
由表5可以看出，包括对照组在内的所有株系总蛋白量保持在24.013mg/g～26.667mg/g之间。其中毒蛋白含量最后的是株系A-4-6，其毒蛋白表达量高达11500.01ng/g，占该株系总蛋白表达量的0.0478％。其次是株系A-2-7，其毒蛋白表达量达到了10061.49ng/g，占其总蛋白表达量的0.0401％。虫试结果较为良好的株系中A-3-4、A-5-0、A-5-23和Z-1-3四个株系的毒蛋白含量在4669.38ng/g～9342.33ng/g之间，占总蛋白表达量的比重是在0.0183％～0.0387％之间，均在0.01％以上。总体而言，毒蛋白表达量越高、占总蛋白表达量越高，越容易使美国白蛾体内毒素累积起到杀虫作用，抗虫效果也就越好。
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 一种人工合成cry1Ah1基因及其应用
<130> 100
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2046
<212> DNA
<213> Bacillusthuringiensis
<400> 1
atgaaaaaca gtatcaaatt atcagaactt tggtatttca atgaaagaaa atggaggtat 60
tttatggaga tagtgaataa tcagaatcaa tgcgtgcctt ataattgttt gaataatccc 120
gaaatcgaaa tattagaagg cggaagaata tcagttggta ataccccaat tgatatttct 180
ctttcgctta ctcagtttct tttgagtgaa tttgtcccag gtgcggggtt tgtattagga 240
ttaattgatt taatatgggg atttgtaggt ccttcccaat gggacgcatt tcttgctcaa 300
gtggaacagt taattaacca aagaatagca gaagctgtaa gaaatacagc aattcaggaa 360
ttagagggaa tggcacgggt ttatagaacc tatgctactg cttttgctga gtgggaaaaa 420
gctcctgatg acccagagct aagagaagca ctacgtacac aatttacagc aactgagact 480
tatataagtg gaagaatatc cgttttaaaa attcaaactt ttgaagtaca gctgttatca 540
gtgtttgccc aagctgcaaa tttacattta tctttattaa gagacgttgt gttttttggg 600
caaagatggg gtttttcaac gacaaccgta aataattact acaatgattt aacagaaggg 660
attagtacct atacagatta tgctgtacgc tggtacaata cgggattaga acgtgtatgg 720
ggaccggatt ctagagattg ggtaaggtat aatcaattta gaagagaatt aacactaact 780
gtattagata tcgttgctct gttcccgaat tatgatagta gaagatatcc aattcgaaca 840
gtttcccaat taacaagaga aatttataca aacccagtat tagaaaattt tgatggtagt 900
tttcgaggct cggctcaggg catagaaaga agtattagga gtccacattt gatggatata 960
cttaacagta taaccatcta tacggatgct cataggggtt attattattg gtcagggcat 1020
caaataatgg cttctcctgt cggtttttcg gggccagaat tcacgtttcc gctatatgga 1080
accatgggaa atgcagctcc acaacaacgt attgttgctc aactaggtca gggcgtgtat 1140
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gtatacagaa aaagcggaac ggtagattcg ctggatgaaa taccaccaca gaataacaac 1320
gtgccaccta ggcaaggatt tagtcatcga ttaagccatg tttcaatgtt tcgttcaggc 1380
tctagtagta gtgtaagtat aataagagct cctatgttct cttggataca tcgtagtgct 1440
gaatttaata atataattgc atcggatagt attactcaaa tccctgcagt gaagggaaac 1500
tttcttttta atggttctgt aatttcagga ccaggattta ctggtgggga cttagttaga 1560
ttaaatagta gtggaaataa cattcagaat agagggtata ttgaagttcc aattcacttc 1620
ccatcgacat ctaccagata tcgagttcgt gtacggtatg cttctgtaac cccgattcac 1680
ctcaacgtta attggggtaa ttcatccatt ttttccaata cagtaccagc tacagctacg 1740
tcattagata atctacaatc aagtgatttt ggttattttg aaagtgccaa tgcttttaca 1800
tcttcattag gtaatatagt aggtgttaga aattttagtg ggactgcagg agtgataata 1860
gacagatttg aatttattcc agttactgca acactcgagg ctgaatataa tctggaaaga 1920
gcgcagaagg cggtgaatgc gctgtttacg tctacaaacc aactagggct aaaaacaaat 1980
gtaacggatt atcatattga tcaagtgtcc aatttagtta cgtgtttatc ggatgaattt 2040
tgtctg 2046
<210> 2
<211> 2153
<212> DNA
<213> cry1Ah1-B基因序列(Artificial)
<400> 2
cacctatttt tacaacaatt accaacaaca acaaacaaca aacaacatta caattactat 60
ttacaattac ataaaccatg gctgcgaaaa acagtatcaa gttatcagaa ctttggtact 120
tcaacgaaag gaaatggagg tattttatgg agatagtgaa caaccagaac cagtgcgtgc 180
cttataactg tttgaacaat cccgaaatcg aaatacttga aggcggaagg atatcagttg 240
gtaatactcc aattgatatt tcactttcgc ttactcagtt tcttttgagt gaatttgtcc 300
caggtgcggg gtttgtactt ggacttatcg acttaatatg gggatttgta ggtccttccc 360
aatgggacgc atttcttgct caagtggaac agcttatcaa ccagagaata gcagaagctg 420
taagaaacac agcaattcag gaacttgagg gaatggcacg ggtttacagg acctatgcta 480
ctgcttttgc tgagtgggaa aaagctcctg atgacccaga gctaagagaa gcactacgta 540
cacaattcac agcaactgag acctacataa gtggaagaat atccgttctt aaaattcaaa 600
cttttgaggt acagctgtta tcagtgttcg ctcaagctgc aaaccttcac ttatctttat 660
taagggacgt tgtgtttttt gggcaaaggt ggggtttttc tacgacaacc gtaaacaatt 720
actacaatga cttaacagaa gggattagta cctatacaga ttatgctgta cgctggtaca 780
atacgggatt agaacgtgta tggggaccgg attctagaga ttgggtaagg tacaaccagt 840
tcagaagaga gttaacacta actgtattag atatcgttgc tctgttcccg aattacgata 900
gtagacgtta tccaattcga acagtttccc agttaacaag agaaatctat actaacccag 960
tattagaaaa ttttgatggt agttttcgag gctcggctca gggcatagaa agaagtatta 1020
ggagtccaca tttgatggac atactcaaca gtataaccat ttacacggat gctcataggg 1080
gttattatta ctggagtggg catcagatca tggcttctcc tgtcggtttt tcggggccag 1140
aattcacgtt tccgctatac ggtaccatgg gaaatgcagc tccacaacaa cgtattgttg 1200
ctcaactagg tcagggcgtg tatagaacat tatcctctac tttttataga agacctttta 1260
acatagggat aaacaatcag caactatctg ttcttgacgg gacagaattt gcttacggaa 1320
cctcctcaaa tttgccatcc gctgtataca gaaaaagcgg aacggtagat tcgctggacg 1380
aaataccacc acagaataac aacgtgccac ctaggcaagg attcagtcat cgattaagcc 1440
atgtttcaat gtttcgttca ggctctagta gtagtgtaag tattataaga gctcctatgt 1500
tctcttggat acaccgtagc gctgagttca acaatattat cgcatcggat agtattactc 1560
aaatccctgc agtgaaggga aactttcttt ttaatggttc tgtaatttca ggaccaggat 1620
tcactggtgg ggacttagtc aggttaaaca gtagtggaaa taacattcag aatagagggt 1680
atattgaagt tccaattcac ttcccaagca catctaccag atatcgagtt cgtgtacggt 1740
atgcttctgt aaccccgatt cacctcaacg ttaattgggg taatagttcc attttttcca 1800
acacagtacc agctacagct acgtcattag ataacctaca gtcaagtgat tttggttatt 1860
ttgaaagtgc caacgctttt acatcttcat taggtaacat agtaggtgtt agaaatttta 1920
gtgggactgc aggagtgatt atagacagat ttgaattcat tccagttact gcaacactcg 1980
aggctgaata caacctggaa agagcgcaga aggcggtgaa tgcgctgttt acgtctacaa 2040
accagctagg gctaaaaaca aacgtaacgg attatcatat tgatcaagtg tccaacttag 2100
ttacgtgttt atcggatgaa ttttgtctgt ccgagaagga tgaactttaa taa 2153
<210> 3
<211> 2153
<212> DNA
<213> cry1Ah1-U基因序列(Artificial)
<400> 3
cacctatttt tacaacaatt accaacaaca acaaacaaca aacaacatta caattactat 60
ttacaattac ataaaccatg gctgctaaga attctatcaa gctttcagaa ctttggtatt 120
ttaatgagag aaagtggaga tatttcatgg agatcgtgaa caatcagaat cagtgtgtgc 180
catacaattg tcttaacaat ccagaaattg agatcttgga aggaggtagg atctctgtgg 240
gaaacactcc tatcgatatt tctttgtcac ttacgcaatt tcttttgtca gagtttgttc 300
caggtgctgg tttcgtgttg ggacttattg atcttatttg gggattcgtt ggtccatctc 360
aatgggatgc ttttcttgca caggttgagc agcttatcaa tcagagaatt gctgaggcag 420
tgagaaatac tgctattcaa gagcttgaag gaatggctcg tgtttaccgt acttatgcca 480
cagcatttgc tgagtgggag aaggctccag atgatccaga gcttagagag gctcttagaa 540
ctcaattcac tgcaacagag acttatatct caggtagaat ttcagtgctt aagattcaaa 600
cttttgaagt gcaacttctt tcagtgtttg ctcaagctgc taacttgcat ctttctcttc 660
ttagagatgt ggtgttcttt ggtcaaaggt ggggtttcag tacaactact gtaaacaatt 720
attataacga tcttactgag ggtatttcca cttatacaga ctatgctgtt agatggtata 780
acactggtct tgaaagggtt tggggtccag attcacgtga ttgggttagg tacaatcagt 840
ttaggaggga acttactctt actgtgctcg atatcgtggc tttgttccca aactacgatt 900
ctagaagata tccaattaga actgtttcac aacttactag agaaatctat acaaatccag 960
ttcttgagaa ttttgatggt tcttttagag gttctgctca aggtattgag agatctatta 1020
gatctccaca tcttatggat attcttaact ccattactat ctatactgat gctcatagag 1080
ggtactatta ttggtctggt catcaaatta tggcttctcc agttggattc tcaggtccag 1140
agtttacttt cccactttac ggaactatgg gtaacgctgc tccacaacaa agaattgttg 1200
ctcaacttgg tcaaggtgtg tacagaactc tttcttctac tttttacagg agacccttca 1260
atattggtat caacaaccag caactgtctg ttcttgatgg tactgagttt gcttatggta 1320
catcatctaa cttaccatct gctgtttatc gtaagagtgg aaccgttgat agtttggatg 1380
agattccacc acaaaacaac aatgttccac caagacaagg tttttctcat agactttctc 1440
atgtgtcaat gtttagatct ggtagctcta gttctgtttc tattattaga gctccaatgt 1500
tctcatggat tcatagatct gctgagttta acaacattat tgcttcagac tctattactc 1560
aaattccagc tgttaagggt aatttccttt ttaacggttc tgttatttct ggtccaggtt 1620
ttactggtgg tgatttggtg agactgaact catctggtaa caatatccaa aacagaggtt 1680
atattgaggt tcctatccat tttccatcta catcaactag atacagagtt agagtgagat 1740
acgcttctgt tactccaatt catcttaatg ttaattgggg taattcttct attttttcta 1800
atactgttcc agctacagca actagcttgg ataaccttca atcttctgat tttggttatt 1860
ttgagtctgc taacgctttc acatcttcac ttggtaatat tgttggtgtt agaaattttt 1920
ctggtactgc tggtgttatt attgatagat ttgagtttat tccagttact gctactcttg 1980
aggctgagta taaccttgag agagctcaaa aggctgttaa cgctcttttt acttctacta 2040
accagcttgg tcttaagacg aacgttactg attatcatat tgatcaagtt tctaatcttg 2100
ttacttgtct ttctgatgag ttttgtcttt ccgagaagga tgaactttaa taa 2153

Claims (6)

1.一种人工合成cry1Ah1基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的人工合成cry1Ah1基因在表达Bt蛋白中的应用。
3.权利要求1所述的人工合成cry1Ah1基因在转基因杨树中的应用。
4.一种人工合成cry1Ah1基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
5.权利要求4所述的人工合成cry1Ah1基因在表达Bt蛋白中的应用。
6.权利要求4所述的人工合成cry1Ah1基因在转基因杨树中的应用。
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