KR102321457B1 - 무 뿌리색을 판별하기 위한 마커 및 이의용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 RsMYB1 유전자 차이를 검출하는 프라이머를 포함하는 무 품종의 색 판별용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물을 이용하면, 생육 초기에 안토시아닌 생성이 우수한 붉은 무를 신속 정확하게 선별할 수 있어 천연색소 생산 무 품종 육종에 유용하다.

Description

무 뿌리색을 판별하기 위한 마커 및 이의용도{Markers for discriminating the radish root tap colors and their use of}

본 발명은 RsMYB1 유전자 차이를 검출하는 무 뿌리색 판별용 프라이머 세트, 조성물 및 이의용도에 관한 것이다.

안토시아닌(Anthocyanin)은 플라보노이드계 식물의 이차대사산물 중 하나이다. 안토시아닌은 다양한 식물 조직에서 분홍색, 빨간색, 보라색, 파란색의 색을 나타냄으로써 원예작물의 상업적 가치에 영향을 미친다. 안토시아닌은 항산화 기능 및 다양한 영양학적 가치를 지니고 있기 때문에 많은 연구들이 안토시아닌 생합성과 조절기작을 밝히기 위해서 진행되어왔다. 안토시아닌은 페닐프로파노이드 경로와 플라보노이드 경로를 통해 합성된다.

안토시아닌 생합성은 전사 수준에서 조절이 된다고 밝혀졌다. MBW(MYB-bHLH-WD repeat) 복합체는 R2R3-MYB 전사인자, bHLH 전사인자 및 WD40 단백질로 구성되어 있으며 안토시아닌 생합성 유전자들의 전사를 조절한다. MBW 복합체는 안토시아닌 생합성 유전자들의 프로모터 지역에 결합함으로써 생합성 관련 유전자들을 발현시킨다. MBW 복합체 중 가장 핵심 역할을 하는 단백질은 R2R3-MYB 전사인자로 알려져 있으며, MYB 전사인자 단독으로 안토시아닌 생합성 유전자들의 발현을 조절할 수 있다. 다양한 식물 종에서 안토시아닌 생합성을 조절하는 MYB 전사인자를 밝혀내는 연구가 활발히 이루어졌으며 이런 MYB 전사인자들은 DNA 결합부위인 반복서열부위인 R2R3 도메인 부위의 아미노산 서열이 상당히 유사하다는 특징을 갖고 있다. 이런 특징을 이용하여 다른 종에서 이미 밝혀져 있는 MYB 전사인자의 서열을 이용하여 새로운 MYB 전사인자를 찾아내는 연구가 많이 되어왔다.

무는 십자화과 채소로 배추, 마늘, 고추, 양파와 함께 5대 채소 중 하나이다. 무의 뿌리색은 다양한 색소물질의 축적여부에 따라서 흰색, 붉은색, 초록색 등의 색깔을 나타내게 된다.

본 발명자는 안토시아닌을 축적하는 붉은 무와 안토시아닌을 축적하지 않은 흰 무에서의 안토시아닌 생성에 중요한 RsMYB1 유전자의 차이를 확인하였다. 붉은 무에서 RsMYB1 유전자가 정상적으로 전사되어지는 반면, 흰 무에서는 RsMYB1 유전자의 돌연변이로 인해서 정상적인 안토시아닌 생성이 이루지지 않음을 확인하였다. 따라서 RsMYB1 유전자의 차이를 바탕으로 안토시아닌 생합성에 기능이 있는 RsMYB1 유전자와 안토시아닌 생합성에 기능이 없는 RsMYB1 유전자를 구분하는 마커를 개발하였다.

대한민국 등록특허 제 10-2096226 호

본 발명의 해결 하고자 하는 과제는 무 뿌리색 판별용 프라이머, 상기 프라이머를 포함하는 조성물 또는 키트, 및 이를 이용한 무 뿌리색 판별방법을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 서열번호55 및 서열번호56으로 이루어진 프라이머 세트를 제공한다.

상기 무 뿌리색은 붉은색 또는 흰색일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 무 뿌리색 판별용 조성물을 제공한다.

상기 무 뿌리색은 무의 뿌리의 근피(skin) 또는 근육(flesh)의 색일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머를 포함하는 무 뿌리색 판별용 키트를 제공한다.

상기 키트는 AATT 서열을 인식하여 절단하는 제한 효소인 MluCI를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 무 시료로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계, b) 상기 추출된 DNA를 상기 프라이머 세트로 증폭하는 단계, 및 c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 무 뿌리색 판별방법을 제공한다.

상기 판별방법은 d) 상기 증폭 산물에 AATT 서열을 인식하여 절단하는 제한 효소인 MluCI를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 판별방법은 상기 제한효소로 처리한 증폭 산물을 아가로스 겔에서 검출하며, 상기 검출결과에서 ⅰ) 2개 밴드가 검출되면, 무 뿌리색을 붉은색으로 판단하며, ⅱ) 3개 밴드가 검출되면, 무 뿌리색을 흰색으로 판단하는 것일 수 있다.

본 발명의 RsMYB1 유전자 마커 조성물을 이용하면, 생육 초기에 안토시아닌 생성이 우수한 붉은 무를 신속 정확하게 선별할 수 있어 천연색소 생산 무 품종 육종에 활용할 수 있다.

도 1은 하얀 무 3 계통(W1 내지 W3)과 색소축적 무 3 계통(R1 내지 R3)의 사진이다.
도 2는 각 무 품종의 근피(skin), 근육(flesh), 및 잎(leaf) 조직에서 총 안토시아닌 함량을 분석한 결과이다.
도 3은 각 무 품종의 근피(skin), 근육(flesh), 및 잎(leaf) 조직에서 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석을 분석한 결과이다.
도 4는 RsMYB1 게놈 DNA(genomic DNA) 구조이다.
도 5는 RsMYB1의 아미노산 구조이다.
도 6은 무 임시 발현을 위해 제조한 pRsMYB1 정상형과 돌연변이형 포함하는 pE3c 벡터이다.
도 7은 RsMYB1 정상형과 돌연변이형 포함하는 E3c 벡터로 형질전환한 무의 자엽이다.
도 8은 도 7의 무 자엽에서 안토시아닌 함량을 분석한 결과이다.
도 9는 담배 임시발현을 위해 제조한 pRsMYB1 정상형과 돌연변이형 포함하는 pB2GW7 벡터이다.
도 10은 상기 pB2GW7 벡터로 형질전환한 담배 잎이다.
도 11은 도 10의 형질전환 담배에서 안토사아닌 함량 및 안토시아닌 생합성 구조유전자의 상대적 발현비를 분석한 결과이다.
도 12는 RsMYB1의 염기서열 차이를 이용한 붉은색 무 판별 마커를 나타낸 것이다.
도 13은 도 12의 마커를 이용하여 무 품종(붉은 무/흰 무)의 잎에서 분리된 유전자를 상기 마커를 이용하며 분석한 결과이다.

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 서열번호55 및 서열번호56으로 이루어진 무 뿌리색 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 “프라이머”는 자유 3' 말단에 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 짧은 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액, 중합반응을 위한 시약, 상이한 4가지 뉴클레오티드 트리포스페이트(nucleotide triphosphate) 및 DNA 중합효소 또는 역전사효소의 존재하에 적절한 온도에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 상기 프라이머 세트에 포함되는 프라이머는 올리고뉴클레오티드가 이용될 수 있고, 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 붉은 무와 흰 무에서 RsMYB1의 발현을 분석한 결과, 근피와 근육에서 안토시아닌이 색소축적 계통에서 RsMYB1의 높은 발현이 확인되었고, 잎의 경우에는 6 계통 모두에서 비슷한 수준으로 발현됨을 확인하였다. 다음으로 서로 다른 색소축적 양상을 지니는 무 계통의 잎으로부터 gDNA를 각각 추출하여, RsMYB1 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 붉은색 뿌리를 가지는 무의 CDS 서열은 747 bp이지만, 흰색 뿌리를 가지는 무의 경우 첫 번째 엑손에 AATT가 삽입되어 CDS 서열이 751 bp로 확인하였으며, RsMYB1유전자의 AATT 염기의 삽입으로 인한 돌연변이는 무 뿌리에서 안토시아닌 색소의 축적을 억제하여 흰색을 나타냄을 확인하였다. 구체적으로 RsMYB1^M의 경우에는 AATT 염기의 삽입으로 제대로 스플라이싱이 진행되지 않아서 조기 종결 단백질을 형성함으로 안토시아닌 생합성 유전자들의 발현을 조절하지 못함으로 안토시아닌 생합성이 저해되어 흰색이 나타나는 것으로 판단하였다.

따라서 본 발명의 프라이머는 RsMYB1 유전자의 변이를 검출하여, 무 뿌리색을 검출하는 것으로, 구체적으로 RsMYB1 유전자의 첫 번째 엑손의 AATT 염기의 삽입결손을 검출하여 무 뿌리색을 판별하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 무 뿌리색 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명의 “무 뿌리색 판별용 조성물”은 서열번호55 및 서열번호56으로 이루어진 프라이머 세트를 포함한다.

본 발명의 조성물은 서열번호26의 RsMYB1(돌연변이형) 유전자의 109번째 내지 112번째 염기인 AATT를 검출하는 것일 수 있으며, 상기 AATT가 검출되는 경우, 무 뿌리색을 흰색으로 판단하는 것일 수 있다.

본 발명에서 “무 뿌리색”은 무 뿌리의 근피(Skin) 또는 근육(flesh)의 색이며, 구체적으로 무 뿌리의 근피 또는 근육이 붉은색 또는 흰색인 것일 수 있다.

본 발명에서 “붉은색”은 무의 조직에서 안토시아닌 축적에 의한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머를 포함하는 무 뿌리색 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 “키트”는 상기 조성물 이외에 상기 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 구체적으로 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명의 일실시예에서 붉은색을 축적하는 무와 축적하지 않은 무에서 RsMYB1의 염기서열이 다름을 확인하였다. 구체적으로 붉은 무의 RsMYB1^N과 흰 무의 RsMYB1^M에서 첫 번째 엑손에서 AATT 서열의 삽입(insertion) 차이를 확인하였는바, 삽입(insertion)된 AATT 영역을 증폭하고, AATT 서열을 인식하여 절단하는 제한효소인 MluCI으로 처리하게 되면 서로 다른 밴드 양상이 나타남을 확인하였다.

따라서 상기 키트는 AATT 서열을 인식하여 절단하는 제한 효소인 MluCI를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 무 시료로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계, b) 상기 추출된 DNA를 서열번호55 및 서열번호56으로 표시되는 프라이머 세트로 증폭하는 단계, 및 c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 무 뿌리색 판별방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 단계 (a)는 무 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계로 사용될 수 있는 시료의 예는 상기에서 설명한 바와 같으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 무 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 DNA 추출 키트를 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 당업자에 의해 용이하게 변형시켜 사용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 단계 (b)는 분리된 DNA를 주형으로, 서열번호55 및 56으로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 표적서열을 증폭 시키는 것이다.

본 발명에서 표적서열을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chainreaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Q 복제효소(Q replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법을 사용할 수 있고, 당업계에 공지된 방법을 당업자에 의해 적절하게 변형하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 서열번호55 및 56으로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 통해 표적 서열을 증폭시켰다.

본 발명에서 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 6% 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5, Cy-3 또는 6-FAM을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 무 시료에서 분리한 유전자를 RsMYB1-marker-F (서열번호55), RsMYB1-marker-R(서열번호56)을 이용하여 PCR로 증폭하고, AATT 염기서열을 인식하여 절단하는 제한효소 MluCI 를 처리한 뒤 2.5% 아가로스겔(agarose gel)을 이용하여 크기 차이를 확인하였다. MluCI 효소에 처리 시, 붉은 무는 185 bp, 31 bp로 절단되어 2개 밴드로 나타났으며, 흰 무의 경우에는 145 bp, 44 bp, 31 bp로 절단되어 3개 밴드로 나타났다.

따라서 본 발명의 판별방법은 d) 상기 증폭 산물에 AATT 서열을 인식하여 절단하는 제한 효소인 MluCI를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 판별방법은 상기 제한효소 처리한 증폭 산물을 아가로스 겔에서 검출하며, 상기 검출결과에서 ⅰ) 2개 밴드가 검출되면, 무 뿌리색을 붉은색으로 판단하며, ⅱ) 3개 밴드가 검출되면, 무 뿌리색을 흰색으로 판단하는 것일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

1. 무 품종별 안토시아닌 함량 및 유전자 발현 분석

무 뿌리의 겉쪽(근피)와 안쪽(근육)에 색소축적이 이루어지지 않은 하얀 무 3 계통(W1 내지 W3)과 색소축적 무 3 계통(R1 내지 R3)을 활용하여 실험을 수행하였다(도 1). 선발된 6 계통의 근피, 근육, 잎에서의 색소축적과 관련된 물질을 알아보고자 안토시아닌 함량 및 안토시아닌 생합성 관련 유전자 발현을 분석하였다.

무 품종의 조직별 안토시아닌 함량 분석

근피, 근육 그리고 잎 조직을 액체질소를 이용하여 파쇄한 뒤, 100 mg으로 정량하여 1% HCl이 포함된 메탄올을 600 ㎕ 처리 후, 4℃에서 16시간 추출하였다. 추출물에 멸균수 200 ㎕와 클로로포름(chloroform) 200 ㎕를 순차적으로 첨가하여 잘 섞어준 후 원심분리기로 12,000 rpm에 5분간 침전시켜 상층액을 흡광도 530nm와 657nm에서 측정하였다.

총 안토시아닌 함량은 육안으로 보이는 것과 동일하게 붉은색이 축적된 R1, R2, R3의 근피와 R2, R3의 근육에서 높았으며 R1, R2, R3의 잎에서 소량의 안토시아닌 함량이 확인되었다. 이러한 결과는 무 뿌리에서의 색소축적 양상은 안토시아닌과 관련되어있음을 확인하였다(도 2).

무 품종의 조직별 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석

다음으로 안토시아닌 축적과 유전자 발현의 상관관계를 확인하고자, 근피, 근육 그리고 잎 조직에서 안토시아닌 생합성 유전자(RsPAL, RsCHS, RsCHI, RsF3H, RsDFR, RsANS) 및 전사인자(RsMYB1, RsTT8, RsTTG1)들의 발현을 확인하였다.

조직별(근피, 근육, 잎) 발현을 확인하기 위하여 Farvogen plant RNA 추출 키트(extraction kit)를 이용하여 각 조직별로 total RNA를 추출하였다. Total RNA 2 ㎍으로 정량 후 GenDEPOT cDNA 합성 키트(synthesis kit)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

안토시아닌 생합성 경로 유전자들의 발현은 RNA polymerase-II transcription factor(RPII) 유전자를 참조값(reference)으로 사용하였으며 quantitative real time PCR (qPCR) 분석을 실시하였다. 본 실험에 사용된 프라이머는 표 1과 같다.

유전자명	정방향 프라이머(F)	역방항 프라이머(R)
RsRPII	5’-ATCACGCTAAATGGTCTCCT-3’ 서열번호1	5’-GCTGCTCTCAATCAAGTCAATC-3’ 서열번호2
RsPAL	5’-CGTCTCCTCAGTGGCTAG-3’ 서열번호3	5’-CGTGAATCGCTTTGTTCCT-3’ 서열번호4
RsCHS	5’-GTGACTG GAACTCCCTCT-3’ 서열번호5	5’-CTCTCATCTTCTCAGCCTTG-3’ 서열번호6
RsCHI	5’-TCCATCCTCTTCG CTCTC-3’ 서열번호7	5’-GACACACGGTTCTTTCCAA-3’ 서열번호8
RsF3H	5’-TTACAAGCCACACGAGAC-3’ 서열번호9	5’-ATGGTCGCCTAGATTAACAAC-3’ 서열번호10
RsDFR	5’-CGTTAGCGGAGAAAGCAG-3’ 서열번호11	5’-GGCGGCATAGATGTTGTTAT-3’ 서열번호12
RsANS	5’-GAAGTTGGTGGCTTAGAAGAG-3’ 서열번호13	5’-ATGTTGTGTAGAATCAAGGTCAA-3’ 서열번호14
RsMYB1	5’-GTGCATGGACTGCTGAAGAA-3’ 서열번호15	5’-CAGTCCGACCGGGTAATCTA-3’ 서열번호16
RsTT8	5’-AGTGATCGGAGCTGAGGAAA-3’ 서열번호17	5’-ACTTGCTTCCTCCTCGCATA-3’ 서열번호18
RsTTG1	5’-AACAGCAAGACGTCCGAGTT-3’ 서열번호19	5’-GATGTCGTGGACCTCCTTGT-3’ 서열번호20

RsMYB1의 경우에는 근피와 근육에서 안토시아닌이 색소축적 계통에서 높은 발현이 확인되었고, 잎의 경우에는 6계통 모두에서 비슷한 수준으로 발현됨을 확인하였다. RsTT8은 안토시아닌 색소 축적이 관찰되는 계통에서 높은 발현이 확인되었다. RsTTG1은 하얀 무 3 계통과 색소축적 무 3계통 간에 유의한 발현 차이가 확인되지 않았다. 안토시아닌 생합성경로 유전자 중에서, RsPAL을 제외한 대부분의 안토시아닌 생합성 경로 유전자들의 발현은 안토시아닌 함량이 높게 확인된 계통에서 높은 발현을 나타내었다(도 3).

상기 분석결과를 통해 색소축적을 나타내는 무 계통은 안토시아닌의 축적에 따라서 색소축적을 나타내며 이러한 색소축적은 안토시아닌 생합성 및 전사인자(RsMYB1, RsTT8, RsCHS, RsCHI, RsF3H, RsDFR, RsANS)의 높은 발현에 의해서 이루어짐을 확인하였다.

2. RsMYB1 유전자 클로닝

무 뿌리에서 안토시아닌 축적과 관련한 유전자들의 기작을 확인하고, RsMYB1 유전자의 염기서열간의 차이를 확인하고자 genomic DNA(gDNA)를 분리하여 유전자 클로닝을 진행하였다.

먼저, 서로 다른 색소축적 양상을 지니는 무 계통의 잎으로부터 gDNA를 각각 추출하여, RsMYB1 유전자의 전체 open reading frame(ORF)을 클로닝 할 수 있는 RsMYB1-ORF F(서열번호21 :5’-ATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGAG-3’)과 RsMYB1-ORF-R (서열번호22 : 5’-TTACACAGTCTC TCCATCTAACAGGCT-3’) 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)을 이용하여 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인하였고, 이를 High yield PlusTM Gel/PCR DNA Mini Kit를 이용하여 분리 후 pTOPO 벡터에 도입하여 염기서열을 비교분석 하였다.

그 결과, 붉은색 뿌리를 가지는 무의 RsMYB1 염기서열은 기존에 NCBI에 보고된 RsMYB1(accession KR706195)과 96% 유사하였다. 붉은색 뿌리를 가지는 무의 CDS 서열은 747 bp이지만, 흰색 뿌리를 가지는 무의 경우 첫 번째 엑손에 AATT가 삽입되어 CDS 서열이 751 bp로 확인되었다(도 4).

붉은색 뿌리를 가지는 무 유래의 RsMYB1 유전자를 정상형인 N으로 명명하여 RsMYB1^N으로 표시하였고, 흰색 뿌리를 가지는 무 유래의 RsMYB1을 돌연변이형인 M으로 명명하여 RsMYB1^M로 표시하였다. 또한, 정상형 또는 돌연변이 RsMYB1의 genomic 유전자, CDS(coding sequence) 염기서열 및 단백질 아미노산 서열을 표 2와 같다.

RsMYB1 유전자(정상형/돌연변이형)에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 도 5과 같이 248 aa(서열번호27) 및 41 aa(서열번호28)로 구성된다.

유전자 /단백질	염기서열/아미노산 서열
RsMYB1 N genomic 유전자 (서열번호23)	-1094 taatgatggc ctaaggtatc aaccaagatc atcatctatt gtgaaactga aaccagtaag -1034 aaacaataat ggaggctact tcggtggtaa atacatgcac atattttacc ccaaaaaaaa -974 aaatacatgc acatatcaag agatacttac aagtttcaaa acagaatcac tctatagttg -914 aatttgcttt ccaatcctta ctgctttaac ttgtcattta gtccaatctg gtttgggctc -854 gcttcttcat ttcacatttg ctttttattt cactttcgct ttcattcctc ttcttttaat -794 aacgggctta ttttactgag cagaaatttg tatactaaca aatggcttac gttaaatatg -734 aaaatctcta atggttatga tgaactttat catcttattg ttttaaataa caaatgaggt -674 tcaagtaata tgttttttga actctctgcc aaaagtacat actcaacaac atgacacact -614 aaaatacggc atagttttga tatcaaagaa caatttgcga aatagtgatt tgtgtactca -554 taatagttgt agcttgtttt gtgtacacaa attagttgac agaaaaaaaa cattacacta -494 tttgcaaatt gtgtgctcat accatccacc ctttctccta atcatgttct aactctggtg -434 catgtagctg ttgaactgtt ccctctctta gtcatacgaa taaactattt tccatcgaca -374 tgtttgttct ttaggagtac tgaaaaatat gaagagacta agtgatatgt atgctatgac -314 gtgcaaagaa aagactaagt gatatgtatg ctatgacgtc caaagaaaag actaagtgct -254 attaaccttt tctgtattta gtctaaatca gtagcagagc ataaataact aaaattagca -194 aattagacac gagtaaaaca tgaaatgtgg atgttagaca tgcacgtcac taccctcatt -134 tgcccgtcac gtgtataaat aaagtcctcg aaggaattgt aaaaccacag tagaaaccct -74 tttcctcaag cctgccttta cgtatactta aaaaaaaaat tggttagata cttctaatat -14 tttatcgttg gtccatggag ggttcgtcca aagggctgag aaaaggtgca tggactgctg 46 aagaagatag tctcttgagg caatgcattg ataagtatgg agaagggaaa tggcaccaag 106 ttcctttaag agctggtatg ttacttttta tcattttgca cacacacata taccacgtat 166 attctctttc tctctgtcta ctatatagaa attaattaac acccgggtgc acaatcattt 226 tttctttttg tttatgaaaa aaaaaacatt tatgatgttc atatttaagt ttgccgactt 286 tttttgttgg attgtcgttt attaaattga attcagtgaa atttttttgc acgaacccgt 346 gtgtttatgt tgaatacatt atttctattg gtgtacttaa attcttcatg ataaaatttt 406 aggagacacg gaagcagtcc tttttcatcc ttttaataat acttatgtca attattggtt 466 ttgtagagct caatcggtgc aggaagagtt gtagactaag atggttgaac tatttgaagc 526 caagtatcaa gagagggaaa cttaactctg atgaagttga tcttcttctt cgccttcata 586 aacttttggg aaacaggttt acattcaaga tataaattca actttatttc gtatcctctt 646 tcggcctaat catttgattt tctttttgta taaaaatact ttatttcata tgtaatgatc 706 cattgctacg tcgtcatata tatatatata tatatcccta atctttcaaa tgcatgctta 766 ggtggtcttt aattgctggt agattacccg gtcggactgc caatgatgta aaaaattact 826 ggaacaccca tttgagtaag aaacatgaac caggttgtaa gacacagatg aaaaaagaga 886 agagaaacat tccttgctct tctactacac tagcccaaaa aatcgacgtt ttcaaacctc 926 gacctcgatc cttcaccgtt aacaacggct gcagccatat cattggcatg ccaaaacctg 986 acgttgttcc tctatgcctt cgattcaaca acaccaaaaa tgtttgtgaa aatattgcta 1046 catgtaacaa agatgacgat aaatctgagc ttgtttgtaa tttaatggat ggtcagaata 1106 tgtggtggga gagtttgcta gatgagagcc aagatccagc tgctctctat ccagaagcta 1166 cagcaacaaa aaaggccgta acctccgagt ttgacgttga tcacctttgg agcctgttag 1226 atggagagac tgtgtaa
RsMYB1 M genomic 유전자 (서열번호24)	-1094 taatgatggc ctaaggtatc aaccaagatc atcatctatt gtgaaactga aaccagtaag -1034 aaacaataat ggaggctact tcggtggtaa atacatgcac atattttacc ccaaaaaaaa -974 aaatacatgc acatatcaag agatacttac aagtttcaaa acagaatcac tctatagttg -914 aatttgcttt ccaatcctta ctgctttaac ttgtcattta gtccaatctg gtttgggctc -854 gcttcttcat ttcacatttg ctttttattt cactttcgct ttcattcctc ttcttttaat -794 aacgggctta ttttactgag cagaaatttg tatactaaca aatggcttac gttaaatatg -734 aaaatctcta atggttatga tgaactttat catcttattg ttttaaataa caaatgaggt -674 tcaagtaata tgttttttga actctctgcc aaaagtacat actcaacaac atgacacact -614 aaaatacggc atagttttga tatcaaagaa caatttgcga aatagtgatt tgtgtactca -554 taatagttgt agcttgtttt gtgtacacaa attagttgac agaaaaaaaa cattacacta -494 tttgcaaatt gtgtgctcat accatccacc ctttctccta atcatgttct aactctggtg -434 catgtagctg ttgaactgtt ccctctctta gtcatacgaa taaactattt tccatcgaca -374 tgtttgttct ttaggagtac tgaaaaatat gaagagacta agtgatatgt atgctatgac -314 gtgcaaagaa aagactaagt gatatgtatg ctatgacgtc caaagaaaag actaagtgct -254 attaaccttt tctgtattta gtctaaatca gtagcagagc ataaataact aaaattagca -194 aattagacac gagtaaaaca tgaaatgtgg atgttagaca tgcacgtcac taccctcatt -134 tgcccgtcac gtgtataaat aaagtcctcg aaggaattgt aaaaccacag tagaaaccct -74 tttcctcaag cctgccttta cgtatactta aaaaaaaaat tggttagata cttctaatat -14 tttatcgttg gtccatggag ggttcgtcca aagggctgag aaaaggtgca tggactgctg 46 aagaagatag tctcttgagg caatgcattg ataagtatgg agaagggaaa tggcaccaag 106 ttaattcctt taagagctga tatgttactt tttatcattt tgcacacaca catataccac 166 gtatattctc tttctctctg tctactatat agaaattaat taacacccgg gtgcacaatc 226 attttttctt tttgtttatg aaaaaaaaaa catttatgat gttcatatt aagtttgccg 286 actctctttg ttggattgtc gtttattaaa ttgaactcag tgaaattttc ttgcacgaac 346 ccgtgtgttt atgttgaata cattatttct attggtgtac ttaaattctt catgataaaa 406 ttttaggaga cacggaagca gtcctttttc atccttttaa taatacttat gtcaattatt 466 ggttttgtag agctcaatcg gtgcaggaag agttgtagac taagatggtt gaactatttg 526 aagccaagta tcaagagagg gaaacttaac tctgatgaag ttgatcttct tcttcgcctt 586 cataaacttt tgggaaacag gtttacattc aagatataaa ttcaacttta tttcgtatcc 646 tctttcggcc taatcatttg attttctttt tgtataaaaa tactttattt catatgtaat 706 gatccattgc tacgtcgtca tatatatata tatatatccc taatctttca aatgcatgct 766 taggtggtct ttaattgctg gtagattacc cggtcggact gccaatgatg taaaaaatta 826 ctggaacacc catttgagta agaaacatga accaggttgt aagacacaga tgaaaaaaga 886 gaagagaaac attccttgct cttctactac actagcccaa aaaatcgacg ttttcaaacc 926 tcgacctcga tccttcaccg ttaacaacgg ctgcagccat atcattggca tgccaaaacc 986 tgacgttgtt cctctatgcc ttcgattcaa caacaccaaa aatgtttgtg aaagtattgc 1046 tacatgtaac aaagatgacg ataaatctga gcttgatagt aatttgatgg atggtcagaa 1106 tatgtggtgg gagagtttgc taaatgaaaa cccagatcca gctgcactct ttccagaagc 1166 tacagcaaca gaaaaaggcg caacctccgc atttgacgtt gagcaacttt ggagcctgtt 1226 agatggagag actgtgtaa
RsMYB1 N CDS (서열번호25)	1 atggagggtt cgtccaaagg gttgagaaaa ggtgcatgga ctgctgaaga agatagtctc 61 ttgaggcaat gcattgataa gtatggagaa gggaaatggc accaagttcc tttaagagct 121 gggctcaatc ggtgcaggaa gagttgtaga ctaagatggt tgaactattt gaagccaagt 181 atcaagagag ggaaacttaa ctctgatgaa gttgatcttc ttcttcgcct tcataaactt 241 ttgggaaaca ggtggtcttt aattgctggt agattacccg gtcggactgc caatgatgta 301 aaaaattact ggaacaccca tttgagtaag aaacatgaac caggttgtaa gacacagatg 361 aaaaaagaga agagaaacat tccttgctct tctactacac tagcccaaaa aatcgacgtt 421 ttcaaacctc gacctcgatc cttcaccgtt aacaacggct gcagccatat cattggcatg 481 ccaaaacctg acgttgttcc tctatgcctt cgattcaaca acaccaaaaa tgtttgtgaa 541 aatattgcta catgtaacaa agatgacgat aaatctgagc ttgtttgtaa tttaatggat 601 ggtcagaata tgtggtggga gagtttgcta gatgagagcc aagatccagc tgctctctat 661 ccagaagcta cagcaacaaa aaaggccgta acctccgagt ttgacgttga tcacctttgg 721 agcctgttag atggagagac tgtgtaa
RsMYB1 M CDS (서열번호26)	1 atggagggtt cgtccaaagg gctgagaaaa ggtgcatgga ctgctgaaga agatagtctc 61 ttgaggcaat gcattgataa gtatggagaa gggaaatggc accaagttaa ttcctttaag 121 agctgagctc aatcggtgca ggaagagttg tagactaaga tggttgaact atttgaagcc 181 aagtatcaag agagggaaac ttaactctga tgaagttgat cttcttcttc gccttcataa 241 acttttggga aacaggtggt ctttaattgc tggtagatta cccggtcgga ctgccaatga 301 tgtaaaaaat tactggaaca cccatttgag taagaaacat gaaccaggtt gtaagacaca 361 gatgaaaaaa gagaagagaa acattccttg ctcttctact acactagccc aaaaaatcga 421 cgttttcaaa cctcgacctc gatccttcac cgttaacaac ggctgcagcc atatcattgg 481 catgccaaaa cctgacgttg ttcctctatg ccttcgattc aacaacacca aaaatgtttg 541 tgaaagtatt gctacatgta acaaagatga cgataaatct gagcttgata gtaatttgat 601 ggatggtcag aatatgtggt gggagagttt gctaaatgaa aacccagatc cagctgcact 661 ctttccagaa gctacagcaa cagaaaaagg cgcaacctcc gcatttgacg ttgagcaact 721 ttggagcctg ttagatggag agactgtgta a
RsMYB1 N 단백질 (서열번호27)	1 MEGSSKGLRK GAWTAEEDSL LRQCIDKYGE GKWHQV PLRA GLNRCRKSCR LRWLNYLKPS 61 IKRGKLNSDE VDLLLRLHKL LGNRWSLIAG RLPGRTANDV KNYWNTHLSK KHEPGCKTQM 121 KKEKRNIPCS STTLAQKIDV FKPRPRSFTV NNGCSHIIGM PKPDVVPLCL RFNNTKNVCE 181 NIATCNKDDD KSELVCNLMD GQNMWWESLL DESQDPAALY PEATATKKAV TSEFDVDHLW 241 SLLDGETV
RsMYB1 M 단백질 (서열번호28)	1 MEGSSKGLRK GAWTAEEDSL LRQCIDKYGE GKWHQV NSFK S

3. 무 임시발현을 통한 RsMYB1 유전자 기능 확인

RsMYB1 유전자의 정상형과 돌연변이형의 기능을 알아보고자 앞에서 분리된 gRsMYB1^N과 gRsMYB1M을 pE3c-RsMYB1-F (서열번호29 :5’-AAAAAAGCAGGCTTTATGGAGGGTTCGTCCAA A-3’), pE3c-RsMYB1-R (서열번호30 : 5’-TGAATTGGTTCCTTTCCCACAGTCTCTCCATCT-3’) 프라이머를 이용하여 증폭 후 In-Fusion® HD Cloning Kit를 이용하여 pE3c 벡터에 도입하였다.

최종적으로 식물에서 전신발현이 가능한 35s 프로모터가 포함되어있는 pB2GW7 벡터로 gateway cloning 방법을 이용하여 도입하였다. 정상형 벡터 (pB2GW7-gRsMYB1^N-myc)와 돌연변이형 벡터(pB2GW7-gRsMYB1^M-myc)을 아그로박테리움 GV3101에 freeze-thaw 방법을 통해서 형질전환을 수행하였다(도 6). 각각의 벡터가 도입된 아그로박테리움을 28℃에서 이틀간 현탁 배양한 후, 무 유식물체 잎에 agroinfiletration을 수행하였다. 배양된 아그로박테리움은 OD600=0.6으로 동일하게 맞추어 100 μM acetosyringone과 10 mM MgCl₂, 10 mM MES (pH5.6)가 포함된 용액으로 현탁시켜 무 자엽에 주사기를 이용하여 agroinfiltration을 수행하였다. 5일 후, agroinfiltration이 실시된 자엽에서의 색소축적 여부를 확인하였다(도 7). RsMYB1유전자 단독발현과 RsMYB1과 RsTT8 유전자가 동시에 발현된 경우에 색소축적이 확인되었다.

마찬가지로, gRsMYB1^N 단독발현 및 gRsMYB1^N 과 RsTT8 유전자가 동시에 발현된 경우에도 자엽에서 색소축적이 확인되었다. 하지만, gRsMYB1^M 단독발현 및 gRsMYB1^M과 RsTT8 유전자의 동시발현의 경우에는 색소축적이 이루어지지 않음을 확인하였다.

이러한 결과는 gRsMYB1^N은 정상적인 안토시아닌 색소 생성에 영향하나, gRsMYB1^M는 정상적인 안토시아닌 색소생성에 기능이 없는 것으로 생각되어진다. 안토시아닌 함량을 측정하기 위해서 아그로박테리움이 주입된 자엽을 각각 액체질소로 파쇄한 뒤 100 mg으로 정량하여 사용하였다. RsMYB1 단독 주입의 경우 대조군인 35s 프로모터가 주입된 자엽에 비교하여 안토시아닌 함량이 1.6배 증가하였으며, gRsMYB1^N 단독의 경우 1.7배 증가되었다. 또한 RsMYB1과 RsTT8이 동시에 주입된 자엽은 35s 프로모터 주입 자엽에 비해 2.8배의 안토시아닌 축적이 증가하였고, gRsMYB1^N과 RsTT8이 동시에 주입된 자엽의 안토시아닌 함량은 대조구와 비교하여 2.7배 증가하였다. 반면 gRsMYB1^M는 단독 주입뿐만 아니라 RsTT8과 동시 주입한 자엽에서도 안토시아닌 축적이 대조구와 유사하였다(도 8).

4. 담배 임시발현을 통한 RsMYB1 유전자 기능 확인

무 임시발현을 통해 RsMYB1 유전자의 기능을 확인한 것과 마찬가지로 담배 잎에서 또한 RsMYB1의 정상형과 돌연변이형의 기능을 알아보고자, RsMYB1 gDNA와 돌연변이형 RsMYB1 gDNA를 각각 gateway cloning 방법을 이용하여 pB2GW7 벡터로 도입한 후, 아그로박테리움 GV3101에 형질전환을 수행하였다(도 9). 형질전환된 아그로박테리움은 앞선 방법과 동일하게 담배 잎에 주사기를 통하여 agroinfiltration을 수행하였다. agroinfiltration 수행 5일 뒤, 담배 잎에서부터 색소축적을 확인하였다(도 10).

분석결과, RsMYB1과 RsTT8 유전자가 동시에 발현된 경우 색소축적이 확인되었으며, gRsMYB1^N과 RsTT8 유전자가 동시에 발현된 잎에서도 약한 색소축적이 확인되었으나, gRsMYB1^M과 RsTT8 돌연변이형을 동시에 주입한 잎에서는 색소축적이 확인되지 않았다.

이를 정량적으로 측정하기 위하여 잎을 채취하여 액체질소로 파쇄한 뒤, 100 mg으로 정량하여 총 안토시아닌 함량을 측정하고, 안토시아닌 생합성 구조유전자들의 발현을 확인하였다. 그 결과, RsMYB1과 RsTT8의 coding sequence(CDS)를 동시에 주입한 잎에서 안토시아닌 함량이 높게 확인되었고, gRsMYB1^N과 RsTT8을 동시에 주입한 잎에서 안토시아닌 함량이 확인되었으나, gRsMYB1^M과 RsTT8을 동시에 주입한 잎에서는 안토시아닌 함량이 확인되지 않았다.

또한 안토시아닌 생합성 구조 유전자들의 발현을 분석하고자, 잎에서부터 total RNA를 추출하여 2 ㎍으로 정량한 뒤, cDNA로 합성하여 qRT-PCR을 진행하여 확인하였다. 참조값(Reference)으로 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 이용하였으며, 사용된 프라이머는 표 3과 같다.

유전자명	정방향 프라이머(F)	역방항 프라이머(R)
NtGAPDH	5’-GGTGTCCACAGACTTCGTGG-3’ 서열번호31	5’-GACTCCTCACAGCAGCACCA-3’ 서열번호32
NtPAL	5’-ATTGAGGTCATCCGTTCTGC-3’ 서열번호33	5’-ACCGTGTAACGCCTTGTTTC-3’ 서열번호34
Nt4CL	5’-TCATTGACGAGGATGACGAG-3’ 서열번호35	5’-TGGGATGGTTGAGAAGAAGG-3’ 서열번호36
NtCHS	5’- TTGTTCGAGCTTGTCTCTGC-3’ 서열번호37	5’-AGCCCAGGAACATCTTTGAG-3’ 서열번호38
NtCHI	5’-GTCA GGCCATTGAAAAGCTC-3’ 서열번호39	5’-CTAATCGTCAATGCCCCAAC-3’ 서열번호40
NtF3H	5’-CAAGGCAT GTGTGGATATGG-3’ 서열번호41	5’-TGTGTCGTTTCAGTCCAAGG-3’ 서열번호42
NtFLS	5’-TTTGGCACTTGG TGTTGTGG-3’ 서열번호43	5’-ACTTGACATCATACCAATGGC-3’ 서열번호44
NtF3'H	5’-AGGCTCAACACTTCT CGT-3’ 서열번호45	5’-CATCAACTTTGGGCTTCT-3’ 서열번호46
NtF3'5'H	5’-TTGATGTGTGGGAAAAACC A-3’ 서열번호47	5’-CAAAATCGTTCCCTCTTGGA-3’ 서열번호48
NtDFR	5’-AACCAACAGTCAGGGGAAT G-3’ 서열번호49	5’-TTGGACATCGACAGTTCCAG-3’ 서열번호50
NtANS	5’-TGGCGTTGAAGCTCATACTG-3’ 서열번호51	5’-GGAATTAGGCACACACTTTGC-3’ 서열번호52
NtUFGT	5’-GAGTGCATTGGATGCCTTTT-3’ 서열번호53	5’-CCAGCTCCATTAGGTCCTTG-3’ 서열번호54

gRsMYB1^N과 RsTT8 유전자를 동시에 주입한 잎에서도 NtPAL, Nt4CL, NtFLS를 제외한 나머지 유전자들이 높은 발현양상을 나타내었으나, gRsMYB1^M과 RsTT8 유전자를 동시에 주입한 잎에서는 안토시아닌 생합성 유전자들의 발현 수준이 낮음을 확인하였다. 이러한 유전자 발현양상은 잎에서의 총 안토시아닌 함량 축적 양상과 일치하였다(도 11).

이러한 결과는 gRsMYB1^N은 무 자엽뿐만 아니라 담배 잎에서 정상적으로 스플라이싱(splicing)하여 RsTT8과 함께 안토시아닌 생합성 유전자들의 발현을 양성적으로 조절함을 의미한다. 그러나 gRsMYB1^M의 경우에는 제대로 스플라이싱이 진행되지 않아서 조기종결 단백질을 형성함으로 안토시아닌 생합성 유전자들의 발현을 조절하지 못함으로 안토시아닌 색소 생성에 영향하지 못했음을 유추할 수 있다.

5. RsMYB1을 이용한 붉은색 무 판별 마커

붉은색을 축적하는 무와 축적하지 않은 무에서 RsMYB1의 염기서열이 다름을 확인하였다. 도 12에서처럼 RsMYB1^N과 RsMYB1^M 간에는 AATT 서열의 차이가 확인됨으로, 이들 영역을 증폭하여 AATT 서열을 인식하여 절단하는 제한효소인 MluCI으로 처리하게 되면 서로 다른 밴드 양상이 확인 될 수 있다.

이러한 RsMYB1^N과 RsMYB1^M 간의 서열차이를 이용하여 무 식물체에서 색소축적 여부를 판별하는 마커를 개발하고자 하였다. 흰색과 붉은색을 축적하는 무 잎으로부터 genomic DNA을 추출하여 100 ng으로 정량을 한 뒤, RsMYB1-marker-F (서열번호55: 5'-CAAGCCTGCCTTTACGTATACTTAAAA-3'), RsMYB1-marker-R (서열번호56: 5'-TGTGCAAAA TGATAAAAAGTAACATACC-3')를 이용하여 PCR로 증폭하였다. RsMYB1^N의 경우에는 216bp로 증폭산물이 확인되며 NC로 표시하였고, RsMYB1^M의 경우에는 220 bp로 증폭산물이 확인되었고, MC로 표시하였다. 증폭된 PCR 산물은 정제 후, AATT 염기서열을 인식하여 절단하는 제한효소 MluCI을 처리한 뒤 2.5% 아가로스겔(agarose gel)을 이용하여 크기 차이를 확인하였다. MluCI 효소에 의하여 NC의 경우에는 한 개의 인식부위를 지님으로 185 bp, 31 bp로 절단되어 나타나며, MC의 경우에는 두 개의 인식부위를 지님으로 145 bp, 44 bp, 31 bp로 절단되어 서로 다른 전기영동 양상을 나타낸다(도 13).

붉은색을 축적하는 무의 경우에는 모두 RsMYB1 유전자가 NC와 동일한 밴드 양상을 나타내었고, 이는 RsMYB1 유전자가 모두 정상적인 형태를 가지고 있는 것을 의미한다. 반면, 흰색을 나타내는 무의 경우에는 MC와 동일한 양상으로 확인되었다. 이러한 결과는 흰색을 나타내는 무의 경우에는 RsMYB1 유전자가 돌연변이되어 색소의 축적이 이루어지지 않는 것으로 판단된다.

이상의 결과를 종합해 보면, 무 뿌리에 붉은색이 축적되기 위해서는 RsMYB1 유전자가 필수적으로 요구되며, RsMYB1유전자의 AATT 염기의 삽입으로 인한 돌연변이는 무 뿌리에서 안토시아닌 색소의 축적을 억제하여 흰색을 나타냄을 확인하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Markers for discriminating the radish root tap colors and their use of <130> DP20200099 <160> 56 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsRPII forward primer <400> 1 atcacgctaa atggtctcct 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsRPII reverse primer <400> 2 gctgctctca atcaagtcaa tc 22 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsPAL forward primer <400> 3 cgtctcctca gtggctag 18 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsPAL reverse primer <400> 4 cgtgaatcgc tttgttcct 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsCHS forward primer <400> 5 gtgactggaa ctccctct 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsCHS reverse primer <400> 6 ctctcatctt ctcagccttg 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsCHI forward primer <400> 7 tccatcctct tcgctctc 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsCHI reverse primer <400> 8 gacacacggt tctttccaa 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsF3H forward primer <400> 9 ttacaagcca cacgagac 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsF3H reverse primer <400> 10 atggtcgcct agattaacaa c 21 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsDFR forward primer <400> 11 cgttagcgga gaaagcag 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsDFR reverse primer <400> 12 ggcggcatag atgttgttat 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsANS forward primer <400> 13 gaagttggtg gcttagaaga g 21 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsANS reverse primer <400> 14 atgttgtgta gaatcaaggt caa 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB1 forward primer <400> 15 gtgcatggac tgctgaagaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB1 reverse primer <400> 16 cagtccgacc gggtaatcta 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsTT8 forward primer <400> 17 agtgatcgga gctgaggaaa 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsTT8 reverse primer <400> 18 acttgcttcc tcctcgcata 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsTTG1 forward primer <400> 19 aacagcaaga cgtccgagtt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsTTG1 reverse primer <400> 20 gatgtcgtgg acctccttgt 20 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB1 ORF forward primer <400> 21 atggagggtt cgtccaaagg gctgag 26 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB1 ORF reverse primer <400> 22 ttacacagtc tctccatcta acaggct 27 <210> 23 <211> 2357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB1N genomic DNA <400> 23 taatgatggc ctaaggtatc aaccaagatc atcatctatt gtgaaactga aaccagtaag 60 aaacaataat ggaggctact tcggtggtaa atacatgcac atattttacc ccaaaaaaaa 120 aaatacatgc acatatcaag agatacttac aagtttcaaa acagaatcac tctatagttg 180 aatttgcttt ccaatcctta ctgctttaac ttgtcattta gtccaatctg gtttgggctc 240 gcttcttcat ttcacatttg ctttttattt cactttcgct ttcattcctc ttcttttaat 300 aacgggctta ttttactgag cagaaatttg tatactaaca aatggcttac gttaaatatg 360 aaaatctcta atggttatga tgaactttat catcttattg ttttaaataa caaatgaggt 420 tcaagtaata tgttttttga actctctgcc aaaagtacat actcaacaac atgacacact 480 aaaatacggc atagttttga tatcaaagaa caatttgcga aatagtgatt tgtgtactca 540 taatagttgt agcttgtttt gtgtacacaa attagttgac agaaaaaaaa cattacacta 600 tttgcaaatt gtgtgctcat accatccacc ctttctccta atcatgttct aactctggtg 660 catgtagctg ttgaactgtt ccctctctta gtcatacgaa taaactattt tccatcgaca 720 tgtttgttct ttaggagtac tgaaaaatat gaagagacta agtgatatgt atgctatgac 780 gtgcaaagaa aagactaagt gatatgtatg ctatgacgtc caaagaaaag actaagtgct 840 attaaccttt tctgtattta gtctaaatca gtagcagagc ataaataact aaaattagca 900 aattagacac gagtaaaaca tgaaatgtgg atgttagaca tgcacgtcac taccctcatt 960 tgcccgtcac gtgtataaat aaagtcctcg aaggaattgt aaaaccacag tagaaaccct 1020 tttcctcaag cctgccttta cgtatactta aaaaaaaaat tggttagata cttctaatat 1080 tttatcgttg gtccatggag ggttcgtcca aagggctgag aaaaggtgca tggactgctg 1140 aagaagatag tctcttgagg caatgcattg ataagtatgg agaagggaaa tggcaccaag 1200 ttcctttaag agctggtatg ttacttttta tcattttgca cacacacata taccacgtat 1260 attctctttc tctctgtcta ctatatagaa attaattaac acccgggtgc acaatcattt 1320 tttctttttg tttatgaaaa aaaaaacatt tatgatgttc atatttaagt ttgccgactt 1380 tttttgttgg attgtcgttt attaaattga attcagtgaa atttttttgc acgaacccgt 1440 gtgtttatgt tgaatacatt atttctattg gtgtacttaa attcttcatg ataaaatttt 1500 aggagacacg gaagcagtcc tttttcatcc ttttaataat acttatgtca attattggtt 1560 ttgtagagct caatcggtgc aggaagagtt gtagactaag atggttgaac tatttgaagc 1620 caagtatcaa gagagggaaa cttaactctg atgaagttga tcttcttctt cgccttcata 1680 aacttttggg aaacaggttt acattcaaga tataaattca actttatttc gtatcctctt 1740 tcggcctaat catttgattt tctttttgta taaaaatact ttatttcata tgtaatgatc 1800 cattgctacg tcgtcatata tatatatata tatatcccta atctttcaaa tgcatgctta 1860 ggtggtcttt aattgctggt agattacccg gtcggactgc caatgatgta aaaaattact 1920 ggaacaccca tttgagtaag aaacatgaac caggttgtaa gacacagatg aaaaaagaga 1980 agagaaacat tccttgctct tctactacac tagcccaaaa aatcgacgtt ttcaaacctc 2040 gacctcgatc cttcaccgtt aacaacggct gcagccatat cattggcatg ccaaaacctg 2100 acgttgttcc tctatgcctt cgattcaaca acaccaaaaa tgtttgtgaa aatattgcta 2160 catgtaacaa agatgacgat aaatctgagc ttgtttgtaa tttaatggat ggtcagaata 2220 tgtggtggga gagtttgcta gatgagagcc aagatccagc tgctctctat ccagaagcta 2280 cagcaacaaa aaaggccgta acctccgagt ttgacgttga tcacctttgg agcctgttag 2340 atggagagac tgtgtaa 2357 <210> 24 <211> 2358 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB1M genomic DNA <400> 24 taatgatggc ctaaggtatc aaccaagatc atcatctatt gtgaaactga aaccagtaag 60 aaacaataat ggaggctact tcggtggtaa atacatgcac atattttacc ccaaaaaaaa 120 aaatacatgc acatatcaag agatacttac aagtttcaaa acagaatcac tctatagttg 180 aatttgcttt ccaatcctta ctgctttaac ttgtcattta gtccaatctg gtttgggctc 240 gcttcttcat ttcacatttg ctttttattt cactttcgct ttcattcctc ttcttttaat 300 aacgggctta ttttactgag cagaaatttg tatactaaca aatggcttac gttaaatatg 360 aaaatctcta atggttatga tgaactttat catcttattg ttttaaataa caaatgaggt 420 tcaagtaata tgttttttga actctctgcc aaaagtacat actcaacaac atgacacact 480 aaaatacggc atagttttga tatcaaagaa caatttgcga aatagtgatt tgtgtactca 540 taatagttgt agcttgtttt gtgtacacaa attagttgac agaaaaaaaa cattacacta 600 tttgcaaatt gtgtgctcat accatccacc ctttctccta atcatgttct aactctggtg 660 catgtagctg ttgaactgtt ccctctctta gtcatacgaa taaactattt tccatcgaca 720 tgtttgttct ttaggagtac tgaaaaatat gaagagacta agtgatatgt atgctatgac 780 gtgcaaagaa aagactaagt gatatgtatg ctatgacgtc caaagaaaag actaagtgct 840 attaaccttt tctgtattta gtctaaatca gtagcagagc ataaataact aaaattagca 900 aattagacac gagtaaaaca tgaaatgtgg atgttagaca tgcacgtcac taccctcatt 960 tgcccgtcac gtgtataaat aaagtcctcg aaggaattgt aaaaccacag tagaaaccct 1020 tttcctcaag cctgccttta cgtatactta aaaaaaaaat tggttagata cttctaatat 1080 tttatcgttg gtccatggag ggttcgtcca aagggctgag aaaaggtgca tggactgctg 1140 aagaagatag tctcttgagg caatgcattg ataagtatgg agaagggaaa tggcaccaag 1200 ttaattcctt taagagctga tatgttactt tttatcattt tgcacacaca catataccac 1260 gtatattctc tttctctctg tctactatat agaaattaat taacacccgg gtgcacaatc 1320 attttttctt tttgtttatg aaaaaaaaaa catttatgat gttcatatta agtttgccga 1380 ctctctttgt tggattgtcg tttattaaat tgaactcagt gaaattttct tgcacgaacc 1440 cgtgtgttta tgttgaatac attatttcta ttggtgtact taaattcttc atgataaaat 1500 tttaggagac acggaagcag tcctttttca tccttttaat aatacttatg tcaattattg 1560 gttttgtaga gctcaatcgg tgcaggaaga gttgtagact aagatggttg aactatttga 1620 agccaagtat caagagaggg aaacttaact ctgatgaagt tgatcttctt cttcgccttc 1680 ataaactttt gggaaacagg tttacattca agatataaat tcaactttat ttcgtatcct 1740 ctttcggcct aatcatttga ttttcttttt gtataaaaat actttatttc atatgtaatg 1800 atccattgct acgtcgtcat atatatatat atatatccct aatctttcaa atgcatgctt 1860 aggtggtctt taattgctgg tagattaccc ggtcggactg ccaatgatgt aaaaaattac 1920 tggaacaccc atttgagtaa gaaacatgaa ccaggttgta agacacagat gaaaaaagag 1980 aagagaaaca ttccttgctc ttctactaca ctagcccaaa aaatcgacgt tttcaaacct 2040 cgacctcgat ccttcaccgt taacaacggc tgcagccata tcattggcat gccaaaacct 2100 gacgttgttc ctctatgcct tcgattcaac aacaccaaaa atgtttgtga aagtattgct 2160 acatgtaaca aagatgacga taaatctgag cttgatagta atttgatgga tggtcagaat 2220 atgtggtggg agagtttgct aaatgaaaac ccagatccag ctgcactctt tccagaagct 2280 acagcaacag aaaaaggcgc aacctccgca tttgacgttg agcaactttg gagcctgtta 2340 gatggagaga ctgtgtaa 2358 <210> 25 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB1N CDS gene <400> 25 atggagggtt cgtccaaagg gttgagaaaa ggtgcatgga ctgctgaaga agatagtctc 60 ttgaggcaat gcattgataa gtatggagaa gggaaatggc accaagttcc tttaagagct 120 gggctcaatc ggtgcaggaa gagttgtaga ctaagatggt tgaactattt gaagccaagt 180 atcaagagag ggaaacttaa ctctgatgaa gttgatcttc ttcttcgcct tcataaactt 240 ttgggaaaca ggtggtcttt aattgctggt agattacccg gtcggactgc caatgatgta 300 aaaaattact ggaacaccca tttgagtaag aaacatgaac caggttgtaa gacacagatg 360 aaaaaagaga agagaaacat tccttgctct tctactacac tagcccaaaa aatcgacgtt 420 ttcaaacctc gacctcgatc cttcaccgtt aacaacggct gcagccatat cattggcatg 480 ccaaaacctg acgttgttcc tctatgcctt cgattcaaca acaccaaaaa tgtttgtgaa 540 aatattgcta catgtaacaa agatgacgat aaatctgagc ttgtttgtaa tttaatggat 600 ggtcagaata tgtggtggga gagtttgcta gatgagagcc aagatccagc tgctctctat 660 ccagaagcta cagcaacaaa aaaggccgta acctccgagt ttgacgttga tcacctttgg 720 agcctgttag atggagagac tgtgtaa 747 <210> 26 <211> 751 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB1M CDS gene <400> 26 atggagggtt cgtccaaagg gctgagaaaa ggtgcatgga ctgctgaaga agatagtctc 60 ttgaggcaat gcattgataa gtatggagaa gggaaatggc accaagttaa ttcctttaag 120 agctgagctc aatcggtgca ggaagagttg tagactaaga tggttgaact atttgaagcc 180 aagtatcaag agagggaaac ttaactctga tgaagttgat cttcttcttc gccttcataa 240 acttttggga aacaggtggt ctttaattgc tggtagatta cccggtcgga ctgccaatga 300 tgtaaaaaat tactggaaca cccatttgag taagaaacat gaaccaggtt gtaagacaca 360 gatgaaaaaa gagaagagaa acattccttg ctcttctact acactagccc aaaaaatcga 420 cgttttcaaa cctcgacctc gatccttcac cgttaacaac ggctgcagcc atatcattgg 480 catgccaaaa cctgacgttg ttcctctatg ccttcgattc aacaacacca aaaatgtttg 540 tgaaagtatt gctacatgta acaaagatga cgataaatct gagcttgata gtaatttgat 600 ggatggtcag aatatgtggt gggagagttt gctaaatgaa aacccagatc cagctgcact 660 ctttccagaa gctacagcaa cagaaaaagg cgcaacctcc gcatttgacg ttgagcaact 720 ttggagcctg ttagatggag agactgtgta a 751 <210> 27 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB1N protein <400> 27 Met Glu Gly Ser Ser Lys Gly Leu Arg Lys Gly Ala Trp Thr Ala Glu 1 5 10 15 Glu Asp Ser Leu Leu Arg Gln Cys Ile Asp Lys Tyr Gly Glu Gly Lys 20 25 30 Trp His Gln Val Pro Leu Arg Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser 35 40 45 Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Lys Pro Ser Ile Lys Arg Gly 50 55 60 Lys Leu Asn Ser Asp Glu Val Asp Leu Leu Leu Arg Leu His Lys Leu 65 70 75 80 Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr 85 90 95 Ala Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Ser Lys Lys His 100 105 110 Glu Pro Gly Cys Lys Thr Gln Met Lys Lys Glu Lys Arg Asn Ile Pro 115 120 125 Cys Ser Ser Thr Thr Leu Ala Gln Lys Ile Asp Val Phe Lys Pro Arg 130 135 140 Pro Arg Ser Phe Thr Val Asn Asn Gly Cys Ser His Ile Ile Gly Met 145 150 155 160 Pro Lys Pro Asp Val Val Pro Leu Cys Leu Arg Phe Asn Asn Thr Lys 165 170 175 Asn Val Cys Glu Asn Ile Ala Thr Cys Asn Lys Asp Asp Asp Lys Ser 180 185 190 Glu Leu Val Cys Asn Leu Met Asp Gly Gln Asn Met Trp Trp Glu Ser 195 200 205 Leu Leu Asp Glu Ser Gln Asp Pro Ala Ala Leu Tyr Pro Glu Ala Thr 210 215 220 Ala Thr Lys Lys Ala Val Thr Ser Glu Phe Asp Val Asp His Leu Trp 225 230 235 240 Ser Leu Leu Asp Gly Glu Thr Val 245 <210> 28 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB1M protein <400> 28 Met Glu Gly Ser Ser Lys Gly Leu Arg Lys Gly Ala Trp Thr Ala Glu 1 5 10 15 Glu Asp Ser Leu Leu Arg Gln Cys Ile Asp Lys Tyr Gly Glu Gly Lys 20 25 30 Trp His Gln Val Asn Ser Phe Lys Ser 35 40 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pE3c-RsMYB1-forward primer <400> 29 aaaaaagcag gctttatgga gggttcgtcc aaa 33 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pE3c-RsMYB1-reverse primer <400> 30 tgaattggtt cctttcccac agtctctcca tct 33 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtGAPDH forward primer <400> 31 ggtgtccaca gacttcgtgg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtGAPDH reverse primer <400> 32 gactcctcac agcagcacca 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtPAL forward primer <400> 33 attgaggtca tccgttctgc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtPAL reverse primer <400> 34 accgtgtaac gccttgtttc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nt4CL forward primer <400> 35 tcattgacga ggatgacgag 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nt4CL reverse primer <400> 36 tcattgacga ggatgacgag 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtCHS forward primer <400> 37 ttgttcgagc ttgtctctgc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtCHS reverse primer <400> 38 agcccaggaa catctttgag 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtCHI forward primer <400> 39 gtcaggccat tgaaaagctc 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtCHI reverse primer <400> 40 ctaatcgtca atgccccaac 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtF3H forward primer <400> 41 caaggcatgt gtggatatgg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtF3H reverse primer <400> 42 tgtgtcgttt cagtccaagg 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtFLS forward primer <400> 43 tttggcactt ggtgttgtgg 20 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtFLS reverse primer <400> 44 acttgacatc ataccaatgg c 21 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtF3'H forward primer <400> 45 aggctcaaca cttctcgt 18 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtF3'H reverse primer <400> 46 catcaacttt gggcttct 18 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtF3'5'H forward primer <400> 47 ttgatgtgtg ggaaaaacca 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtF3'5'H reverse primer <400> 48 caaaatcgtt ccctcttgga 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtDFR forward primer <400> 49 aaccaacagt caggggaatg 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtDFR reverse primer <400> 50 ttggacatcg acagttccag 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtANS forward primer <400> 51 tggcgttgaa gctcatactg 20 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtANS reverse primer <400> 52 ggaattaggc acacactttg c 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtUFGT forward primer <400> 53 ggaattaggc acacactttg c 21 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NtUFGT reverse primer <400> 54 ccagctccat taggtccttg 20 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB1 marker forward primer <400> 55 caagcctgcc tttacgtata cttaaaa 27 <210> 56 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB1 marker reverse primer <400> 56 tgtgcaaaat gataaaaagt aacatacc 28

Claims (9)

1. 서열번호55 및 서열번호56으로 표시되는 무 뿌리색 판별용 프라이머 세트; 및 AATT 서열을 인식하여 절단하는 제한 효소인 MluCI를 포함하는 무 뿌리색 판별용 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 무 뿌리색은 붉은색 또는 흰색인 것인, 무 뿌리색 판별용 조성물.
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서,
   상기 무 뿌리색은 무 뿌리의 근피(skin) 또는 근육(flesh)의 색인 것인, 무 뿌리색 판별용 조성물.
5. 제 1항의 조성물을 포함하는 무 뿌리색 판별용 키트.
6. 삭제
7. a) 무 시료로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계,
   b) 상기 추출된 DNA를 서열번호55 및 서열번호56으로 표시되는 무 뿌리색 판별용 프라이머 세트로 증폭하는 단계,
   c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계, 및
   d) 상기 증폭 산물에 AATT 서열을 인식하여 절단하는 제한 효소인 MluCI를 처리하는 단계를 포함하는,
   무 뿌리색 판별방법.
8. 삭제
9. 제 7항에 있어서,
   상기 제한효소로 처리한 증폭 산물을 아가로스 겔에서 검출하며,
   상기 검출결과에서 ⅰ) 2개 밴드가 검출되면, 무 뿌리색을 붉은색으로 판단하며, ⅱ) 3개 밴드가 검출되면, 무 뿌리색을 흰색으로 판단하는 것인, 판별방법.

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