KR20170048939A - 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 마커 - Google Patents
수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 마커 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 마커에 관한 것으로, 구체적으로 박과 식물의 유전체 정보와 덩굴마름병 저항성 수박 및 덩굴마름병 감수성 수박의 유전체 정보를 분석하여 새롭게 발굴한 14개의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 2개의 삽입결실다형성(insertion-deletion polymorphism, InDel) 마커를 바탕으로 하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성을 판별할 수 있는 탐침, 조성물, 키트 및 판별방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 수박의 덩굴마름병에 대한 저항성 또는 감수성을 빠르고 정확하게 판별할 수 있다. 이에 따라 덩굴마름병에 대한 저항성이 우수한 수박을 선별하여 재배할 수 있어 농가의 피해를 줄이는데 크게 기여할 수 있을 뿐만 아니라 덩굴마름병에 대한 저항성을 갖으면서 다른 유용한 특성을 갖는 새로운 품종을 개발하는데에도 매우 유용할 것이라 기대된다.
본 발명에 따르면 수박의 덩굴마름병에 대한 저항성 또는 감수성을 빠르고 정확하게 판별할 수 있다. 이에 따라 덩굴마름병에 대한 저항성이 우수한 수박을 선별하여 재배할 수 있어 농가의 피해를 줄이는데 크게 기여할 수 있을 뿐만 아니라 덩굴마름병에 대한 저항성을 갖으면서 다른 유용한 특성을 갖는 새로운 품종을 개발하는데에도 매우 유용할 것이라 기대된다.
Description
본 발명은 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 마커에 관한 것으로, 구체적으로 박과 식물의 유전체 정보와 덩굴마름병 저항성 수박 및 덩굴마름병 감수성 수박의 유전체 정보를 분석하여 새롭게 발굴한 14개의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 2개의 삽입결실다형성(insertion-deletion polymorphism, InDel) 마커를 바탕으로 하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성을 판별할 수 있는 탐침, 조성물, 키트 및 판별방법에 관한 것이다.
수박은 여름철 더위와 갈증을 해소할 수 있는 최고의 과채류로 우리나라에서는 조선시대 이전에 들여와 재배되어 왔다. 박목 박과의 덩굴성 한해살이풀로 분류되며 학명은 Citrullus lanatus이다. 수박은 수분이 매우 높고 대부분 당질로 이루어져 있으며, 이뇨효과가 뛰어나고 구창, 방광염, 보혈, 강장 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 보통 7 ~ 8월에 수확하며 현재는 기술의 발전으로 인해 시설원예를 통한 연중재배도 이루어지고 있다.
수박 재배 시 탄저병, 역병, 덩굴마름병, 잘록병 등 여러 가지 병해가 발생할 수 있다. 이중 덩굴마름병은 줄기, 잎, 과경에 발생하는데, 줄기에서는 초기에 갈색반점이 나타나고 진전되면 담갈색 또는 회갈색의 병반으로 변하며, 잎에서는 초기에 작은 갈색반점이 나타나고 진전되면 회갈색 대형병반으로 확대된다. 병원체는 Didymella bryoniae와 Mycosphaerella melonis로 알려져 있다.
특히 시설재배의 경우 그 특성상 연작재배가 불가피하고 시설내부의 온도가 높아지거나 습도가 높아지게 되어 덩굴마름병 병원체가 발생하기 쉽다. 이 병은 수박의 착과 이후에 급격히 발생하여 과실이 성숙되기 이전에 잎과 덩굴이 말라죽는 경우가 많다. 따라서 수박의 안정적인 생산을 위해서는 덩굴마름병에 대한 저항성 계통의 선발 또는 육성이 필요하다.
한편, 육종에 있어서 분자표지의 이용은 환경이나 다른 유전자형에 의해 영향을 받지 않으며, 선발 비용과 시간 등을 절약할 수 있는 등 선발효율을 크게 높일 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한 특정 형질에 연관된 분자표지를 이용하여 다수의 유전자원에서 특정 형질을 지닌 계통을 선발할 수 있으며, 선발과정에서 대상 유전형을 직접 평가 선발함으로 정확성을 향상시킬 수 있고 많은 계통간의 차이를 구별할 수 있다고 알려져 있다.
본 발명자들은 수박의 덩굴마름병 저항성 및 감수성과 관련된 새로운 마커를 개발하고 이를 이용함으로써 덩굴마름병에 대한 저항성 또는 감수성이 있는 수박을 신속, 정확하고 용이하게 판별할 수 있는 방법을 개발하고자 연구 노력하였다. 이의 결과 기존 수박의 유전정보와 새롭게 확인한 덩굴마름병 저항성 및 감수성 수박 계통의 유전정보를 이용하여 덩굴마름병과 관련된 새로운 SNP 및 InDel 마커를 발굴할 수 있었으며, 이들 마커를 이용하여 덩굴마름병에 대한 저항성이 우수한 개체를 효과적으로 판별해낼 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
Norton, J. D. 1979. Inheritance of resistance to gummy stem blight in watermelon. HortScience 14:630-632.
Skarshaug, A. J. 1981. Centrum development in Didymella bryoniae. Amer. J. Bot. 68:1096-1103.
Haley, S. D., P.N. Miklas, J.R. Staely, J. Byrum, and J.D. Kelly. 1993. Identification of RAPD markers linked to major rust resistance gene block in common bean. Theor. Appl. Genet. 86:505-512.
Thormann, C.E., M.E. Ferreira, L.E.A. Camargo, J.G. Tivang, and T.c. Osborn. 1994. Comparison of and RAPD markers to estimating genetic relationships within and among Cruciferous species. Theor. Appl. Genet. 88:973-980.
Torres, A.M. 1993. Identifying rose cultivars using random amplified polymorphic DNA markers.
따라서 본 발명의 주된 목적은 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성을 정확하고 용이하게 판별할 수 있는 마커를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 마커를 이용한 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 탐침, 조성물 및 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커를 이용함으로써 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성을 정확하고 용이하게 판별할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 다음 (1) 내지 (14)의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 (15) 내지 (16)의 삽입결실다형성(insertion-deletion polymorphism, InDel) 중에서 선택된 다형성을 검출하기 위한 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 탐침을 제공한다.
(1) 서열번호 1의 염기서열에서 250번째 염기(A 또는 G)의 다형성
(2) 서열번호 2의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 C)의 다형성
(3) 서열번호 3의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 C)의 다형성
(4) 서열번호 4의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 G)의 다형성
(5) 서열번호 5의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 C)의 다형성
(6) 서열번호 6의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 A)의 다형성
(7) 서열번호 7의 염기서열에서 250번째 염기(A 또는 G)의 다형성
(8) 서열번호 8의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 T)의 다형성
(9) 서열번호 9의 염기서열에서 250번째 염기(G 또는 A)의 다형성
(10) 서열번호 10의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 C)의 다형성
(11) 서열번호 11의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 T)의 다형성
(12) 서열번호 12의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 T)의 다형성
(13) 서열번호 13의 염기서열에서 250번째 염기(G 또는 T)의 다형성
(14) 서열번호 14의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 A)의 다형성
(15) 서열번호 15의 염기서열에서 116번째 내지 117번째 염기(AC)의 삽입 또는 결실 다형성
(16) 서열번호 16의 염기서열에서 59번째 내지 62번째 염기(AATT)의 삽입 또는 결실 다형성
이때, 서열번호 1은 A 유전자형의 염기서열, 서열번호 2는 T 유전자형의 염기서열, 서열번호 3은 T 유전자형의 염기서열, 서열번호 4는 T 유전자형의 염기서열, 서열번호 5는 T 유전자형의 염기서열, 서열번호 6은 C 유전자형의 염기서열, 서열번호 7은 A 유전자형의 염기서열, 서열번호 8은 C 유전자형의 염기서열, 서열번호 9는 G 유전자형의 염기서열, 서열번호 10은 T 유전자형의 염기서열, 서열번호 11은 C 유전자형의 염기서열, 서열번호 12는 C 유전자형의 염기서열, 서열번호 13은 G 유전자형의 염기서열, 서열번호 14는 C 유전자형의 염기서열이며, 서열번호 15는 AC 삽입 유전자형의 염기서열, 서열번호 16은 AATT 삽입 유전자형의 염기서열을 나타낸다.
본 발명의 탐침에 있어서, 상기 탐침은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 교잡(hybridization)을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브(probe)일 수 있다.
상기 탐침이 PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머이며 HRM(high resolution melting) 분석용 프라이머인 경우, 다형성 위치의 염기를 포함하여 HRM 분석에 용이한 크기(예를 들어, 50 내지 500bp 크기)의 증폭산물을 생성할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다. 이러한 HRM 분석용 프라이머로 상기 (1)의 탐침은 서열번호 17의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 18의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (2)의 탐침은 서열번호 19의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (3)의 탐침은 서열번호 21의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 22의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (4)의 탐침은 서열번호 23의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 24의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (5)의 탐침은 서열번호 25의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 26의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (6)의 탐침은 서열번호 27의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 28의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (7)의 탐침은 서열번호 29의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 30의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (8)의 탐침은 서열번호 31의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 32의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (9)의 탐침은 서열번호 33의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 34의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (10)의 탐침은 서열번호 35의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 36의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (11)의 탐침은 서열번호 37의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 38의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (12)의 탐침은 서열번호 39의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 40의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (13)의 탐침은 서열번호 41의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 42의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (14)의 탐침은 서열번호 43의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 44의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (15)의 탐침은 서열번호 45의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 46의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍; 상기 (16)의 탐침은 서열번호 47의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 48의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;인 것이 바람직하다. 이들 프라이머 쌍은 상기 각 SNP 또는 InDel을 용이하게 판별할 수 있는 프라이머 쌍으로, 수박의 유전체에서 서로 다른 위치의 SNP 또는 InDel 인근 서열을 정확하게 증폭할 수 있는 프라이머들로 이루어져 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 탐침을 포함하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명의 조성물 및 키트는 상기 (1) 내지 (16)의 다형성을 판별하기 위한 각각의 탐침을 모두 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에는 상기와 같은 탐침 이외에도 탐침을 사용하여 다형성을 검출하는데 필요한 시약, 예를 들어 PCR 또는 DNA-DNA hybridization 등을 수행하는데 필요한 시약이 더 포함될 수 있다.
본 발명의 키트에는 상기와 같은 탐침 이외에도 탐침을 사용하여 다형성을 검출하는데 필요한 시약, 기구 또는 장치, 예를 들어 PCR 또는 DNA-DNA hybridization 등을 수행하는데 필요한 시약, 기구 또는 장치가 더 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 수박 시료로부터 뉴클레오티드를 분리하는 단계; 상기 (1) 내지 (16)의 다형성 중에서 선택된 다형성의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별 방법을 제공한다. 이때, 상기 (1) 내지 (16)의 다형성의 유전자형을 모두 결정하는 것이 바람직하다.
상기 (1)의 다형성이 G 유전자형, (2)의 다형성이 C 유전자형, (3)의 다형성이 C 유전자형, (4)의 다형성이 G 유전자형, (5)의 다형성이 C 유전자형, (6)의 다형성이 A 유전자형, (7)의 다형성이 G 유전자형, (8)의 다형성이 C 유전자형, (9)의 다형성이 A 유전자형, (10)의 다형성이 C 유전자형, (11)의 다형성이 T 유전자형, (12)의 다형성이 T 유전자형, (13)의 다형성이 T 유전자형, (14)의 다형성이 A 유전자형, (15)의 다형성이 AC 결실 유전자형, (16)의 다형성이 AATT 결실 유전자형에 해당하는 경우 덩굴마름병에 대한 저항성을 갖는 것으로 판별할 수 있고, 반대 유전자형인 경우 감수성을 갖는 것으로 판별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 수박 시료로부터 분리된 뉴클레오티드를 주형으로 하고 상기 (1) 내지 (16) 중에서 선택된 프라이머 쌍으로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 단계; 및 상기 중합효소연쇄반응으로 수득된 증폭산물을 이용하여 HRM(high resolution melting) 분석을 수행하는 단계;를 포함하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별 방법을 제공한다. 이때, 상기 (1) 내지 (16)의 프라이머 쌍을 모두 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면 수박의 덩굴마름병에 대한 저항성 또는 감수성을 빠르고 정확하게 판별할 수 있다. 이에 따라 덩굴마름병에 대한 저항성이 우수한 수박을 선별하여 재배할 수 있어 농가의 피해를 줄이는데 크게 기여할 수 있을 뿐만 아니라 덩굴마름병에 대한 저항성을 갖으면서 다른 유용한 특성을 갖는 새로운 품종을 개발하는데에도 매우 유용할 것이라 기대된다.
도 1은 본 발명에서 사용한 수박의 SNP 또는 InDel 분석방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 수박덩굴마름병 저항성(PI189225) 및 감수성(920533) 모부본을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 (1)의 SNP에 대한 SWF01 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 (2)의 SNP에 대한 SWF02 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 (3)의 SNP에 대한 SWF03 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 (4)의 SNP에 대한 SWF06 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 (5)의 SNP에 대한 SWF07 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 (6)의 SNP에 대한 SWF08 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 (7)의 SNP에 대한 SWF09 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 (8)의 SNP에 대한 SWF10 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 (9)의 SNP에 대한 SWF13 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 (10)의 SNP에 대한 SWF16 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 (11)의 SNP에 대한 SWF18 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 (12)의 SNP에 대한 SWF20 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 (13)의 SNP에 대한 SWF21 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 (14)의 SNP에 대한 SWF22 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명의 (15)의 InDel에 대한 IWF16 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 본 발명의 (16)의 InDel에 대한 IWF22 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 수박덩굴마름병 저항성(PI189225) 및 감수성(920533) 모부본을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 (1)의 SNP에 대한 SWF01 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 (2)의 SNP에 대한 SWF02 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 (3)의 SNP에 대한 SWF03 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 (4)의 SNP에 대한 SWF06 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 (5)의 SNP에 대한 SWF07 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 (6)의 SNP에 대한 SWF08 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 (7)의 SNP에 대한 SWF09 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 (8)의 SNP에 대한 SWF10 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 (9)의 SNP에 대한 SWF13 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 (10)의 SNP에 대한 SWF16 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 (11)의 SNP에 대한 SWF18 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 (12)의 SNP에 대한 SWF20 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 (13)의 SNP에 대한 SWF21 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 (14)의 SNP에 대한 SWF22 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명의 (15)의 InDel에 대한 IWF16 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 본 발명의 (16)의 InDel에 대한 IWF22 프라이머를 사용한 덩굴마름병 저항성과 감수성 수박 계통의 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1.
1-1. 재료 및 방법
1-1-1. 식물 시료 및 Genomic DNA 추출
수박 덩굴마름병 연관 분자표지 개발을 위해 국립원예특작과학원 채소과 과채류연구실에서 수박 덩굴마름병 저항성과 감수성으로 확실하게 구분되는 계통(저항성 2개, 중도저항성 1개, 감수성 1개)들의 종자를 분양받아서 병저항성 검정을 통해 표현형을 확인하고 시험재료로 사용하였다.
Genomic DNA는 MATRIX 96 well plate에 튜브(Thermo. matrix #4140)를 준비하고 한 튜브에 비드를 2개씩 넣고 잎 시료를 넣어서 -20℃에 1 ~ 2시간 얼린 후, Tissuelyzer(20 frequency/sec, 1m)로 마쇄한 다음 튜브에 CTAB buffer를 500㎕ 씩 넣고 새지 않도록 캡을 꼼꼼히 닫은 후 Tissuelyzer에서 한 번 더 10초 정도 가볍게 마쇄하였다. 12,000rpm으로 5분간 원심분리하여 200㎕ 상층액만 Lysis plate로 옮겨준 후 데크에 장착하였다. 자동핵산추출기(QIAGEN)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였고, 추출한 genomic DNA는 Nanodrop 1000 spectrophotometer(Thermo Scientic, Wilmington, USA)를 사용하여 정량하였으며, -20℃에 사용할 때까지 보관하였다.
1-1-2. SNP/InDel 프라이머 제작
수박 덩굴마름병 저항성 및 감수성 관련 유전자원의 염기서열 분석 정보(Roche GS FLX 454 DNA sequencing data)를 바탕으로 공개된 수박 유전체 정보(ICUGI : http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi)를 reference로 alignment를 수행하였다. GS FLX 454 DNA sequence의 long read data의 quality에 따른 trimming 후, reference genome과의 alignment를 수행하여 consensus sequence를 작성하였다. 프로그램을 이용하여 SNP 또는 InDell detection 후, 샘플간 SNP matrix를 작성하여 SNP를 선발하였고, HRM 분석을 위한 프라이머를 디자인하였다. HRM 프라이머는 reference sequecnce를 이용하여 SNP position을 target으로 product size 100 ~ 150bp, Tm값 55 ~ 65℃, primer size 20 ~ 25bp를 기준으로 설정하였고, 454 sequencing data의 양이 적고 mapping된 read의 depth가 낮아 프라이머 디자인 시 reference sequecnce를 사용하였다(도 1 참조).
1-1-3. High Resolution Melting(HRM) 분석
HRM은 Bio-Rad CFX96 Real Time PCR machine system(Bio-Rad, USA)을 사용하였으며, HRM 분석을 위해서 template DNA 50ng, forward primer(5μM) 1㎕, reverse primer(5μM) 1㎕, Bio-Rad ssofast evagreen(2X) 10㎕를 섞어주고 최종 볼륨 20㎕이 되도록 distilled water로 채워주었다. 증폭조건은 initial Denatunation은 98℃에서 2분간 처리하였고, 98℃에서 2초, 56℃에서 15초, melt curve 65℃에서 95℃까지 매 10초마다 0.2℃ 증가시켰다. 그리고 98℃에서 2초의 과정부터 앞의 과정을 40회 반복하였다.
1-2. 결과
1-2-1. 수박 유전체 정보 기반 덩굴마름병 관련 SNP/InDel 분석
수박 덩굴마름병 저항성(PI189225) 및 감수성(920533)(도 2 참조) 유전자원의 염기서열정보 일부를 바탕으로 ICUGI에 공개된 수박 유전체 정보를 reference로 alignment 수행한 결과, 수박 덩굴마름병 저항성 및 감수성 관련 모부본의 sequencing data가 수박 유전체 genome에 덩굴마름병 감수성(FuP1)에서 9.06%, 저항성(FuP2)에서는 6.69%로 mapping 되었다(표 1 참조).
수박 덩굴마름병 저항성 및 감수성 샘플간의 SNP 비교분석을 수행하기 위해 homozygous SNP만 이용하였고, 다형성을 나타내는 383개의 SNP 중에서 intron에 위치한 25개 SNP를 바탕으로 HRM 분석을 위한 프라이머 22개를 디자인하였다(표 2 참조).
Reference genome에 mapping하여 In/Del validation 및 selection을 통해 기준 이상의 In/Del을 선발하고 In/Del을 detection하였고, 수박 덩굴마름병 저항성 및 감수성 샘플에서 detection된 total In/Del을 insertion/deletion 및 homozygous/heterozygous In/Del로 분류하고, In/Del matrix를 작성하였다. 수박 덩굴마름병 저항성 및 감수성 샘플간의 InDel 비교분석을 수행하기 위해 total InDel을 이용하였고, 다형성을 나타내는 267개 InDel 중에서 HRM 분석을 위한 프라이머 40개를 디자인하였다(표 3 및 4 참조).
1-2-2. 수박 덩굴마름병 관련 SNP/InDel 마커 선발
수박 덩굴마름병 저항성 마커선발을 위해 저항성(PI189225, PI482322) 및 감수성(920533) 유전자원의 종자를 분양받아서 병검정을 통해 확실하게 구분되는 계통들의 어린 잎을 수집하여 genomic DNA를 추출하여 실험에 사용하였다.
수박 덩굴마름병 저항성 및 감수성 자원의 염기서열 정보를 기반으로 분석된 SNP 388개 중 intron에 위치하는 25개 SNP에서 1개 SNP만 포함되도록 제작된 22개 프라이머 중 14개 SNP(SWF01, SWF02, SWF03, SWF06, SWF07, SWF08, SWF09, SWF10, SWF13, SWF16, SWF18, SWF20, SWF21, SWF22) 프라이머가 real-time PCR을 이용한 HRM 분석을 통해 수박 덩굴마름병 저항성 2점과 감수성 1점간의 확연한 melting temperature 차이를 보였다(표 5 및 6 참조).
생물정보분석을 통해 분석된 267개 InDel 중에서 HRM 분석을 위해 40개 프라이머 세트를 제작하였고, 그 중에서 10개 InDel(IWF02, IWF09, IWF15, IWF16, IWF22, IWF24, IWF28, IWF30, IWF31, IWF35) 프라이머를 1차 선발하였다. 특히 IWF16, IWF22의 경우 real-time PCR을 이용한 HRM 분석을 통해 수박 덩굴마름병 저항성 및 감수성간의 melting temperature 차이를 나타내어 최종 선발하였다(표 5 및 6 참조).
따라서 본 발명을 통해 개발된 수박 덩굴마름병 저항성 연관 가능성이 높은 마커들은 수박 병저항성 품종 육성에 활용 가능할 것으로 기대된다.
| 마커목록 | Melting temperature(℃) | ||
| 저항성 계통(R1) | 저항성 계통(R2) | 감수성 계통(S1) | |
| SWF01 | 76.07 | 76.07 | 75.27 |
| SWF02 | 77.83 | 77.73 | 77.34 |
| SWF03 | 76.57 | 76.60 | 76.09 |
| SWF06 | 73.10 | 73.10 | 72.94 |
| SWF07 | 75.26 | 75.28 | 74.67 |
| SWF08 | 81.67 | 81.66 | 82.29 |
| SWF09 | 82.20 | 82.23 | 82.02 |
| SWF10 | 70.88 | 70.99 | 70.06 |
| SWF13 | 81.62 | 81.62 | 81.99 |
| SWF16 | 79.02 | 79.02 | 78.88 |
| SWF18 | 84.18 | 84.18 | 84.56 |
| SWF20 | 76.38 | 76.40 | 76.87 |
| SWF21 | 76.35 | 76.37 | 76.84 |
| SWF22 | 77.39 | 77.44 | 77.73 |
| IWF16 | 78.25 | 78.24 | 78.53 |
| IWF22 | 78.10 | 78.10 | 77.89 |
* sample 1: 920533, sample 2: PI189225.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Markers for discrimination of resistance or susceptibility about
gummy stem blight disease of watermelon
<130> PA-D15215
<160> 48
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 500
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 1
gtgtgttcaa gatacgaggt gactgcctct cctttgtctc ttcttagata ccatttcttc 60
aattgcgtaa aatgggttaa atttgacctt aggtctttca gaatgctcct ttgcacattg 120
tgtcggttga agtcgtttgg gttgaagtgt cactttcaag gaatctcttt ttgaagatag 180
ttaaaggctg ttgttgcatc ttttaggctc tttattttcc agcttcttgc catctttttt 240
tggttgatta catagtcttg cagtatgctt ctgtgtgcat gttctcaagc ttagttggcg 300
tttaagttat tcgtttaaag ctttggtttt aaagcttagt tggcgtttaa gttatcggtc 360
ttttaggata agttacttct ttggattgct cgctttgttt cagcttgggt tcaagcctct 420
tcaaatttga tctggattgt ttttatttct cttgcttagg ccttttcttt tctttgtatt 480
cattttggta tttttcgtaa 500
<210> 2
<211> 500
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 2
atgttttgct tttcactctg ttttaccaaa acaaaagctc tcttattaat cagaaacttc 60
aattctattt atattataga gtgcagagaa atcctcaata gctcattagt ttttgtggga 120
gaaataggag gcaatgatta caattatcta ttctttcaac gatatagctt ggaagaagtc 180
aagtcttttg taccattagt ggttcaagca atttcttcaa caatcactgt aagaccctat 240
ttctggattt taatgttgct tttgcaattc aatgttaaag aaaactacaa ctaaattatt 300
gcaggagttg attaagttgg gtgctacgac tttagtagtt cctggggaca ttccaattgg 360
gtgtaatcca ttatatctca tgatttatgg aaattcagtt caaaactccg aaaatggttg 420
tttggattgg ctgaaccaat tctctgagta ccataataaa caacttcaag aagaattgaa 480
acaaattcga gctcgtcatc 500
<210> 3
<211> 500
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 3
ccaaaacaaa agctctctta ttaatcagaa acttcaattc tatttatatt atagagtgca 60
gagaaatcct caatagctca ttagtttttg tgggagaaat aggaggcaat gattacaatt 120
atctattctt tcaacgatat agcttggaag aagtcaagtc ttttgtacca ttagtggttc 180
aagcaatttc ttcaacaatc actgtaagac cctatttctg gattttaatg ttgcttttgc 240
aattcaatgt taaagaaaac tacaactaaa ttattgcagg agttgattaa gttgggtgct 300
acgactttag tagttcctgg ggacattcca attgggtgta atccattata tctcatgatt 360
tatggaaatt cagttcaaaa ctccgaaaat ggttgtttgg attggctgaa ccaattctct 420
gagtaccata ataaacaact tcaagaagaa ttgaaacaaa ttcgagctcg tcatccttat 480
gttcatatca tatatgcaga 500
<210> 4
<211> 500
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 4
tatacttaac aataaaatac tcggaaaaga ccacatacgt cgaaggtttt tggttgccgt 60
aggaaaaagt agaagtccca ctcctattaa gataggaatt ggaagtgaga tgaacggtat 120
gatccatgaa tattgatacg tatattccat aaaaaaagta tatttaattc ctaattaatt 180
tttctgattc accagctctt atctcttttc aaaaggatca gttaataaaa aatttaaata 240
tccaaaactt aaatagaatt ttttttctat tcttcatttt ttgccaaata cttcaaatat 300
ttcaagtcac gaagttacaa ttgttcaaat cggatgatcc actaaaacta ttaatgaaca 360
cacttttaag ccctaatctc tattttcctt tgctttaaca aaagataaaa atcatgatta 420
aaggttggct agggttggtt tgaatggtta ggagggtagg tggaattaaa gtgcatgttt 480
aagtaactat gattactttc 500
<210> 5
<211> 500
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 5
tctcttgatt ctttgagtct cactaagtgt tacaaggttg aacaacttcc agaatttgat 60
gaaaacatga aatctttaag ggtgatggat ttgaacggta cggccataag gaggttacct 120
tcatcaattg gatatcttat tgggcttgag aatttaaacc ttaatgtgtg caaacctgac 180
tactcttcca actgaaattc atttgttaaa aagtgttgag gaacttcata ttcgtgggtg 240
ttctaaactt gatatgtttc ccccaagatc aagcttaaat tttccccaac aaagcttatg 300
ttccaagctg agggtattgg atcttaaaga ttgtaacata acaaattccg atttcctaga 360
aactctatct aatgtgtgca cttccttgga gaagctaaat ttgtcaggaa ataaattctg 420
ttccctaccc tctctccaaa attttacatc gttgaggttt cttgaattaa ggaattgcaa 480
gtttcttcga aacatcgcaa 500
<210> 6
<211> 500
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 6
ggaactgatt ggattagccg gagagacaat aacgccgaga gataagagag cgaaatacaa 60
cacaggaatt tgcagagaag tcggtgaaag aataaaagcc acttgaccat tggagaagga 120
gtaaagagct ctaaggttag aggtgaggtt tcggatttga cggaggaaaa gggcgtaaga 180
gacagtgacg ccggagtcgg agtcgacgag agcagcagtg ttcggcggag gaagagatga 240
tcggagaacc gaaagagcat gtccggcaac ggtgagtggc tgagataacg gcggaagcga 300
gaagggtggt cggaggctct tgtaaatctt ggtttgagga cagaaaccgc tgcgggaatc 360
aacggaatgg gcagccattg gagtggatcg tgaagaaagt gatttaatgc gtggctaaac 420
acgatccaag cgaacacgta tttataacca ctacggagaa caagcaaatc cgtccaacac 480
agggattcta gatataccat 500
<210> 7
<211> 500
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 7
gttccccata cgaccactga acccagtctt cgtgtttcca tctttatcag tgaacaacgt 60
gcagatgagt atcaaataac tatcagtcgt ccccaaaatc cacttaccat cataagtaac 120
atccacatga gtaatcggcg aaccaagccc tggaaaggct gtctttgcct gtctcattga 180
cgtcttcgaa tacagcctta tcttcccatc aaccgaccca acaacaattg atccatcccc 240
tgttgtagca aagcactgga agttcgtccc tctagaaaac tgatgcccct gcgcccagtt 300
cagaaccgtt gaattatcag cagctccacc aatgttctga accattcctc tacggtctct 360
catgtcccat tgacaaagcc tgttgtcatc caaccccaaa aatgtcgact ctgaaggatc 420
caattgagac cctttggtgt catttgcgat gtccctcatt gtaatgtctg taccatcctt 480
ttcaaatttc cattctgtaa 500
<210> 8
<211> 500
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 8
aatcataatt tttcgaaagt tacattcatg ccagactcca ctaagaacat gtaatataga 60
ttgcaatttt gaacattaaa gttagcgaat ccaatttttg aaaattggat tcattcccaa 120
aaaatcttga ataaaaagaa aaaagtatcg cacgatcaga tcgctcgaaa ctcggttctc 180
catttattct ttccatctta aaaccattct tctaattagg tgaagaacga tcctttgagt 240
ctaatataac aacaataatc cgtgtgagga acaatttgga ttatgaaagt gttgtgaatg 300
tggtttacga catttcagta tttgggtaag ttgagatact tgtgtgaaaa cgaaccctta 360
acaaatacgt ttggcgaaac aaatgttcaa caatacacct aaatgtaggt agtgtttgag 420
ttatagaaca accttttgta tagtccaaaa taaaataatg tatttgtgtg acaaatactg 480
gttttataag gaacatgaaa 500
<210> 9
<211> 500
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 9
aaattgcgga ggctaatcgc atgtatgttg aataaatgaa acaggaaggc aggaccgatg 60
ccttacaact tcgcattcaa taatcttcaa aataaagcca ccagcccagg aagaacaatg 120
agaatcatac gcagaagaat atcagtacga aaaatgaaag accagttata actaaataca 180
agaatgggca gaaagagaga gaataccgcc aacgctgtta tggttggagc agccagcttc 240
gactcgggcg agaagaggaa gaggatcagg aagatgaaga gactgaggtt gcagaaaagg 300
aacacaaaca cagacggtgg aggtggttcc tccatcaatt ccaagaatca cgcccccaac 360
tcctcctgtt ccgccggaca tttcccgctc caattccgag acttccccat tccgatgttt 420
cttcgtcatc tggaaactca ggaatcagaa tccggtacgg gaaccctgat ccttttgcct 480
tactcctcct cccaattaca 500
<210> 10
<211> 500
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 10
atttgctgag aagtatctaa aaggggtctc gggcgagatc acacttcagg tttctagtgg 60
gaagcaatgg cgtgtccgat gcattcgtga aggtcctggc accaagctaa ccaggggatg 120
ggctgacttt gtcgtggaca atgacttgaa agaagaagac gtttgtgtct ttgaactgat 180
cgatataaaa gatattgtgc tgaaagttac agtattccga gtccatgacg atccgacaaa 240
aacttgaact ggaggtaatc tttttgctga aattcacgtg tattttgtaa tgttttcaag 300
gttgactgcc cttttttctt gcatgccttc attagattct aaatagtaaa tatgagcaca 360
attgttttaa tgtttacttc tataatgaaa atgttgaaat tttgaaaaca aaagagaact 420
attcctcaga atatcaccca aatggcttaa ttactctagt acatgttttt ggagatgact 480
gtgaactgtt ccactgttga 500
<210> 11
<211> 500
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 11
agaggagcaa cttttgaaga atacgagtga tctcttcatt cctcacaaat cgagatcgcg 60
caagctgcgg cggcgcaaga acctccatca tcgtgagttt cttcatgtac ctccaataat 120
cgccgtaggg agcgccgagg aatccgactt tgccgtacgg atactcctcg ctgaaggcga 180
aatcagggcg ggaggagaag gtgaggtcgt gcgttttgaa gatctcggca gcgagggagg 240
cggaggagac gaggacgtac tgcagagcgc caaggcggat gtggaggagc gggccatact 300
tggaggagat attgaagaag gatttgtgag tcgcagggag gaggaggtgg agatggccga 360
tcagcgggag cggcggcgga gatggaggca gagtgagttt tccggcggcg gatttggacg 420
gtttgtggag gaagaagagg aggaagagag aggagaggaa gaagaggaag aggtagagag 480
cgtagtgaag agcggcgtcc 500
<210> 12
<211> 500
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 12
aatggatttt tctttggtaa cataagatga aattgtagaa agaatcatgc ggagaatttt 60
tttttaccga tattcctgat tagtaattag gaaaccccta ttaaacaaaa taaaagagca 120
aattatttct tccacaaaat ttggcaaggg gaataaaatg aatttcatgc tcccttctta 180
acagtacatg tgtatatata attcaactat agcaaatagt ggcatagagt cttgcatctt 240
tctacatctc tagaggatct ctagttttac taagaatccc tgttgttgga tcggattata 300
actaactttt ggggaatttg tacgaaaatc tttatgaaat tttattaaaa aaaatgataa 360
gacaagataa taactaaaat aatgcaaaag tctattatga tacatatatt tcatgtcgaa 420
agatgagtaa gtccatttat ttaattcgac attcctcatt ccttttctat atatactcac 480
gtagatatta cttagtataa 500
<210> 13
<211> 500
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 13
aagaatcatg cggagaattt ttttttaccg atattcctga ttagtaatta ggaaacccct 60
attaaacaaa ataaaagagc aaattatttc ttccacaaaa tttggcaagg ggaataaaat 120
gaatttcatg ctcccttctt aacagtacat gtgtatatat aattcaacta tagcaaatag 180
tggcatagag tcttgcatct ttctacatct ctagaggatc tctagtttta ctaagaatcc 240
ctgttgttgg atcggattat aactaacttt tggggaattt gtacgaaaat ctttatgaaa 300
ttttattaaa aaaaatgata agacaagata ataactaaaa taatgcaaaa gtctattatg 360
atacatatat ttcatgtcga aagatgagta agtccattta tttaattcga cattcctcat 420
tccttttcta tatatactca cgtagatatt acttagtata attatctatg aattagtata 480
attataagat accttttata 500
<210> 14
<211> 500
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 14
gatttttttt ttttcaattt tctttaccgc tctccgtctt agtagaaaga cacagtattc 60
gggatagaaa gaaaacaata attgaaataa atctacgctt cttggaggtg caatttgaaa 120
ataaaaaaat tccttctgtc gtgtatcccc gattaatgta acctcagatg ctttaattgt 180
cgattctagt attaagcgaa aggtgtaacc tatggattaa gtcaacccta ctccactagt 240
aaaaatattc actagtaaaa ataggtagca gaggggaaga agcactacac ctaggaatca 300
acaacacgaa aactttgtta taaattatcc cttttcctta tcgggatcgg aacttagaaa 360
aatggttggg acaacaaaca tccatctcgt ttgtattttg gatacctgta gaaccatcga 420
agactgttga agtgactaat tcctggaaat ttagaggcgt tgaggacaaa gaaattgtta 480
gagttaccct ttttttttta 500
<210> 15
<211> 150
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 15
agagactgtt tttaggacac cactaaaatt tcttgagaac agctataatg gctgaaccta 60
ataagatagc aattacaacc caagaagtaa taagtacttg ggcatgcact tggaaacatc 120
ctccctattt gccaatacaa atgttggccg 150
<210> 16
<211> 149
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 16
ggcccatgga tccatacatc tcgatcggaa aagaatcaat agaaaaagaa agaatcggaa 60
ttaattgatc gatatatttc tcgaaacaaa cgaaaaggaa acgaaacgaa agacgaaaca 120
taaatcatgg atcaactaag ccaagccct 149
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF01 forward Primer
<400> 17
ttttccagct tcttgccatc t 21
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF01 reverse Primer
<400> 18
gaacatgcac acagaagcat act 23
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF02 forward Primer
<400> 19
caacgatata gcttggaaga agtc 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF02 reverse Primer
<400> 20
cccaggaact actaaagtcg tagc 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF03 forward Primer
<400> 21
aagcaatttc ttcaacaatc actg 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF03 reverse Primer
<400> 22
agtcgtagca cccaacttaa tcaa 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF06 forward Primer
<400> 23
aacggtatga tccatgaata ttga 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF06 reverse Primer
<400> 24
tgaagtattt ggcaaaaaat gaag 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF07 forward Primer
<400> 25
ttcatattcg tgggtgttct aaac 24
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF07 reverse Primer
<400> 26
acataagctt tgttggggaa aat 23
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF08 forward Primer
<400> 27
agtcgacgag agcagcagtg 20
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF08 reverse Primer
<400> 28
actcaccgtt gccggaca 18
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF09 forward Primer
<400> 29
gtctcattga cgtcttcgaa taca 24
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF09 reverse Primer
<400> 30
ataattcaac ggttctgaac tgg 23
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF10 forward Primer
<400> 31
tgaagaacga tcctttgagt ctaa 24
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF10 reverse Primer
<400> 32
aattgttcct cacacggatt attg 24
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF13 forward Primer
<400> 33
agaataccgc caacgctgtt 20
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF13 reverse Primer
<400> 34
gttccttttc tgcaacctca gtct 24
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF16 forward Primer
<400> 35
agtattccga gtccatgacg at 22
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF16 reverse Primer
<400> 36
tctaatgaag gcatgcaaga aa 22
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF18 forward Primer
<400> 37
cgggaggaga aggtgaggt 19
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF18 reverse Primer
<400> 38
tggcgctctg cagtacgt 18
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF20 forward Primer
<400> 39
tttcatgctc ccttcttaac agt 23
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF20 reverse Primer
<400> 40
tccccaaaag ttagttataa tccg 24
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF21 forward Primer
<400> 41
tttcatgctc ccttcttaac agt 23
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF21 reverse Primer
<400> 42
cgtacaaatt ccccaaaagt tagt 24
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF22 forward Primer
<400> 43
tgtcgtgtat ccccgattaa tgta 24
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SWF22 reverse Primer
<400> 44
tgcttcttcc cctctgctac ctat 24
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IWF16 forward Primer
<400> 45
agagactgtt tttaggacac cact 24
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IWF16 reverse Primer
<400> 46
cggccaacat ttgtattggc a 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IWF22 forward Primer
<400> 47
ggcccatgga tccatacatc t 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IWF22 reverse Primer
<400> 48
agggcttggc ttagttgatc c 21
Claims (11)
- 다음 (1) 내지 (14)의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 (15) 내지 (16)의 삽입결실다형성(insertion-deletion polymorphism, InDel) 중에서 선택된 다형성을 검출하기 위한 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 탐침.
(1) 서열번호 1의 염기서열에서 250번째 염기(A 또는 G)의 다형성
(2) 서열번호 2의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 C)의 다형성
(3) 서열번호 3의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 C)의 다형성
(4) 서열번호 4의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 G)의 다형성
(5) 서열번호 5의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 C)의 다형성
(6) 서열번호 6의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 A)의 다형성
(7) 서열번호 7의 염기서열에서 250번째 염기(A 또는 G)의 다형성
(8) 서열번호 8의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 T)의 다형성
(9) 서열번호 9의 염기서열에서 250번째 염기(G 또는 A)의 다형성
(10) 서열번호 10의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 C)의 다형성
(11) 서열번호 11의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 T)의 다형성
(12) 서열번호 12의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 T)의 다형성
(13) 서열번호 13의 염기서열에서 250번째 염기(G 또는 T)의 다형성
(14) 서열번호 14의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 A)의 다형성
(15) 서열번호 15의 염기서열에서 116번째 내지 117번째 염기(AC)의 삽입 또는 결실 다형성
(16) 서열번호 16의 염기서열에서 59번째 내지 62번째 염기(AATT)의 삽입 또는 결실 다형성 - 제 1항에 있어서,
상기 탐침은 중합효소연쇄반응용 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 교잡용 올리고뉴클레오티드 프로브인 것을 특징으로 하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 탐침. - 제 1항에 있어서,
상기 (1)의 탐침은 서열번호 17의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 18의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (2)의 탐침은 서열번호 19의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (3)의 탐침은 서열번호 21의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 22의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (4)의 탐침은 서열번호 23의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 24의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (5)의 탐침은 서열번호 25의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 26의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (6)의 탐침은 서열번호 27의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 28의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (7)의 탐침은 서열번호 29의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 30의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (8)의 탐침은 서열번호 31의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 32의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (9)의 탐침은 서열번호 33의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 34의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (10)의 탐침은 서열번호 35의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 36의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (11)의 탐침은 서열번호 37의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 38의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (12)의 탐침은 서열번호 39의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 40의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (13)의 탐침은 서열번호 41의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 42의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (14)의 탐침은 서열번호 43의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 44의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (15)의 탐침은 서열번호 45의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 46의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;
상기 (16)의 탐침은 서열번호 47의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 48의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍;인 것을 특징으로 하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 탐침. - 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 탐침을 포함하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 조성물.
- 제 4항에 있어서,
상기 조성물은
상기 (1) 내지 (16)의 다형성을 판별하기 위한 각각의 탐침을 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 조성물. - 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 탐침을 포함하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 키트.
- 제 6항에 있어서,
상기 키트는
상기 (1) 내지 (16)의 다형성을 판별하기 위한 각각의 탐침을 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 키트. - 수박 시료로부터 뉴클레오티드를 분리하는 단계; 및
다음 (1) 내지 (14)의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 (15) 내지 (16)의 삽입결실다형성(insertion-deletion polymorphism, InDel) 중에서 선택된 다형성의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별 방법.
(1) 서열번호 1의 염기서열에서 250번째 염기(A 또는 G)의 다형성
(2) 서열번호 2의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 C)의 다형성
(3) 서열번호 3의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 C)의 다형성
(4) 서열번호 4의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 G)의 다형성
(5) 서열번호 5의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 C)의 다형성
(6) 서열번호 6의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 A)의 다형성
(7) 서열번호 7의 염기서열에서 250번째 염기(A 또는 G)의 다형성
(8) 서열번호 8의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 T)의 다형성
(9) 서열번호 9의 염기서열에서 250번째 염기(G 또는 A)의 다형성
(10) 서열번호 10의 염기서열에서 250번째 염기(T 또는 C)의 다형성
(11) 서열번호 11의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 T)의 다형성
(12) 서열번호 12의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 T)의 다형성
(13) 서열번호 13의 염기서열에서 250번째 염기(G 또는 T)의 다형성
(14) 서열번호 14의 염기서열에서 250번째 염기(C 또는 A)의 다형성
(15) 서열번호 15의 염기서열에서 116번째 내지 117번째 염기(AC)의 삽입 또는 결실 다형성
(16) 서열번호 16의 염기서열에서 59번째 내지 62번째 염기(AATT)의 삽입 또는 결실 다형성 - 제 8항에 있어서,
상기 (1) 내지 (16)의 다형성의 유전자형을 모두 결정하는 것을 특징으로 하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별 방법. - 수박 시료로부터 분리된 뉴클레오티드를 주형으로 하고
다음 (1) 내지 (16) 중에서 선택된 프라이머 쌍으로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 단계; 및
상기 중합효소연쇄반응으로 수득된 증폭산물을 이용하여 HRM(high resolution melting) 분석을 수행하는 단계;를 포함하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별 방법.
(1) 서열번호 17의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 18의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(2) 서열번호 19의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(3) 서열번호 21의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 22의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(4) 서열번호 23의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 24의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(5) 서열번호 25의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 26의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(6) 서열번호 27의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 28의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(7) 서열번호 29의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 30의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(8) 서열번호 31의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 32의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(9) 서열번호 33의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 34의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(10) 서열번호 35의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 36의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(11) 서열번호 37의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 38의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(12) 서열번호 39의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 40의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(13) 서열번호 41의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 42의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(14) 서열번호 43의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 44의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(15) 서열번호 45의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 46의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍
(16) 서열번호 47의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 48의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍 - 제 10항에 있어서,
상기 (1) 내지 (16)의 프라이머 쌍을 모두 사용하는 것을 특징으로 하는 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별 방법.
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