CN108866224B

CN108866224B - 十三种转基因大豆检测用多重pcr试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN108866224B
Application number: CN201810517389.5A
Authority: CN
Inventors: 薛满; 孙万平; 王晓囡; 沈苏南; 刘婉婉; 陶静; 马建婷
Original assignee: Suzhou Food Inspection And Testing Center; Suzhou University
Current assignee: Suzhou Food Inspection And Testing Center; Suzhou University
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2038-05-25
Also published as: CN108866224A

Abstract

本发明公开了十三种转基因大豆检测用多重PCR试剂盒及检测方法，可快速检测我国农业部批准进口的13种转基因大豆，包括MON87701、GTS40‑3‑2、MON89788、CV127、A2704、A5547、DP356043、DP305423、MON87769、MON87708、305423×40‑3‑2、MON87701×MON89788、MON87705；本发明公开的多重PCR试剂盒基于“公共引物”介导的多重PCR方法，包括公共引物、多重引物、多重PCR体系检测；新设计的退火温度法提高多重PCR体系的特异性、敏感性，该多重PCR方法具有包容性，可继续增加检测靶标，有利于提高多重PCR的检测通量。本发明具有灵敏度高，经济、快速、操作简单等优点，可应用于食品检测。

Description

十三种转基因大豆检测用多重PCR试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于食品/基因检测领域，具体涉及转基因大豆检测用多重PCR试剂盒及检测方法，尤其涉及十三种转基因大豆检测用多重PCR试剂盒及检测方法。

技术背景

转基因作物是利用基因工程技术将外源目的基因转入植物中培育而出的，它们具有抗虫、抗除草剂、抗逆和营养改良等优良特性。全球转基因作物的种植面积自1996年的0.17亿公顷增加到2015年的1.797亿公顷。随着转基因技术不断发展，转基因作物产业化与商业化的程度不断加深，我国陆续针对转基因作物制定了相关法律法规，然而，公众对转基因食品安全的担忧及对所食用食品是否含有转基因成分的知情权仍与日俱增，因此，快速、准确、敏感的转基因食品检测技术是所有转基因安全性评价等法律法规真正落到实处的基础和关键之一。

随着转基因技术不断发展，转基因作物产业化与商业化的程度也不断加深，随之而来的是转基因产品的安全性也被公众更加关注。我国目前允许进口的转基因大豆品系有13种，其中MON87705为2017年国家农业部批准进口。市场上针对这些转基因大豆品系的检测方法有很多，包括普通PCR技术、恒温扩增技术、基因芯片技术、荧光定量PCR等。中国农业部针对这些转基因大豆品系发布的检测方法以核酸检测为主，但是其方法都只能对1种转基因大豆品系进行单重PCR检测。发明人课题组已经针对12种转基因大豆品系设计了一种以公共引物为介导的多重PCR检测体系；但是在2017年我国农业部又发表批准MON87705转基因大豆品系进口，前期的针对12种转基因大豆的多重PCR体系不能够一次性检测出我国农业部规定的所有转基因品系，同时由于新组分的增加，导致现有检测条件不适用，不仅无法检测出13种，连曾经可以检测出的12种转基因大豆品系都不能准确检测出。因此，不仅需要研发出针对MON87705转基因大豆品的引物，更要使得该引物能够适应多重PCR检测。

发明内容

本发明的目的是提供十三种检测转基因大豆的多重PCR试剂盒，多重PCR体系，一般包括以下试剂：PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl₂、多重引物、模板和去离子水。用于我国目前批准进口（即已颁发安全证书）的13种转基因大豆的单一或者同时多重PCR检测，通过设计公共引物及转基因大豆特异性引物，限定多重PCR检测体系和条件，可检测食品（比如大豆、大豆制品、含有大豆成份的食物等）中是否含有转基因大豆成分。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：

十三种转基因大豆检测用多重PCR试剂盒，包括公共引物、针对转基因大豆的嵌合引物；所述公共引物的序列为SEQ ID NO.1；所述针对转基因大豆的嵌合引物为SEQ IDNO.2至SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列。

单种转基因大豆检测用PCR试剂盒，包括公共引物、针对转基因大豆的嵌合引物；所述公共引物的序列为SEQ ID NO.1；所述针对转基因大豆的嵌合引物为SEQ ID NO.14至SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列。

上述技术方案中，所述PCR试剂盒还包括Taq 聚合酶、dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液、去离子水、阳性对照引物对；其中所述阳性对照引物对的序列优选为阳性对照正引物SEQ IDNO.24、阳性对照反引物SEQ ID NO.25，产物长度都为210bp；可用来检测DNA模板质量和反应体系扩增效率；

SEQ ID NO.24：GGGTGAGGATAGGGTTCTCTG

SEQ ID NO.25：GCGATCGAGTAGTGAGAGTCG。

上述技术方案中，进行PCR反应时，升温程序为95℃预变性 5min；95℃ 变性30s，62℃退火10s，56℃退火20s，72℃ 延伸30s共10个循环；然后72℃ 预变性2min；95℃ 变性30s，56℃退火 30s，72℃ 延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸7min。前10个循环，创造性的设计两个退火温度下，低浓度的嵌合引物中特异引物扩增靶标序列，产生带有公共引物末端的PCR产物；后30个循环，在低退火温度（与前循环第二退火温度一致）下，高浓度的公共引物以早期产生的带有公共引物末端的PCR产物为模板进行大量扩增。根据本发明的方法可以有效、简便的检测产品中，尤其是食品中是否含有转基因大豆成分，为国民知情权以及食品安全做出巨大贡献。尤其是本发明新提出了PCR反应程序，解决了在SEQ ID NO.14、SEQID NO.15存在下无法用现有PCR程序准确获得扩增结果的问题。

上述技术方案中，进行PCR反应时，采用25微升体系，其中公共引物的终浓度为1600nM，针对转基因大豆的嵌合引物对的终浓度如下：M7SF53.6nM、M7SR 53.6nM、D6SF52.8nM、D6SR 52.8nM、D2SF 54.4nM、D2SR 54.4nM、CVSF 24nM、CVSR 24nM、M69SF16nM、M69SR 64nM、A2SF 64nM、A2SR 16nM、GSF 52nM、GSR 52nM、M05SR 40nM、M08SF32nM、M9SF64nM、A5SR 64nM、A5SF 64nM。

本发明还公开了一种检测产品中转基因大豆成分的方法，提取待检测产品基因组DNA作为模板（比如转基因大豆的插入基因与大豆基因组的连接区为靶标序列），在嵌合引物与公共引物存在下进行PCR反应，对PCR产物进行电泳分析即完成产品中转基因大豆成分的检测；最后对PCR产物扩增进行电泳分析，即完成产品中转基因大豆成分的检测；所述公共引物的序列为SEQ ID NO.1；所述嵌合引物为SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列或者所述嵌合引物为SEQ ID NO.14至SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列。

上述技术方案中，进行PCR反应时，升温程序为95℃预变性 5min；95℃ 变性30s，62℃退火10s，56℃退火20s，72℃ 延伸30s共10个循环；然后72℃ 预变性2min；95℃ 变性30s，56℃退火 30s，72℃ 延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸7min；进行PCR反应时，采用25微升体系，其中公共引物的终浓度为1600nM，针对转基因大豆的嵌合引物对的终浓度如下：M7SF53.6nM、M7SR 53.6nM、D6SF 52.8nM、D6SR 52.8nM、D2SF 54.4nM、D2SR 54.4nM、CVSF 24nM、CVSR 24nM、M69SF16nM、M69SR 64nM、A2SF 64nM、A2SR 16nM、GSF 52nM、GSR52nM、M05SR 40nM、M08SF32nM、M9SF 64nM、A5SR 64nM、A5SF 64nM；所述产品为包含大豆成分的食品。

本发明公开的转基因大豆成分核酸检测方法准确，可同时检测13中目标基因，而且检测结果准确，可解决公众对转基因食品安全的担忧及对所食用食品是否含有转基因成分的知情权。

本发明进一步公开了一种转基因大豆检测用引物，包括公共引物、针对转基因大豆的嵌合引物；所述公共引物的序列为SEQ ID NO.1；所述针对转基因大豆的嵌合引物为SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列或者所述针对转基因大豆的嵌合引物为SEQ ID NO.14至SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列。

本发明还公开了上述转基因大豆检测用引物在制备检测转基因大豆的PCR试剂盒（包括多重PCR试剂盒、普通PCR试剂盒）中的应用或者权利要求8所述转基因大豆检测用引物在检测转基因大豆中的应用。

本发明中，所述公共引物的序列SEQ ID NO.1及所述嵌合引物的核苷酸序列如下所示：

所述嵌合引物为针对13种转基因大豆的嵌合引物；A2704-12和A5547-127的上游引物相同，MON89788、MON87708、MON87769的下游引物相同，MON87701与MON87705的上游引物相同。305423×40-3-2、MON87701×MON89788是两种基因堆叠的转基因大豆，若样品中同时检测出转基因大豆DP305423和GTS40-3-2，则样品中有可能含有转基因大豆305423×40-3-2；若样品中同时检测出转基因大豆MON87701和MON89788，则样品中有可能含有转基因大豆MON87701×MON89788。

上述技术方案中，公共引物与转基因大豆相关基因组无同源性，当以转基因大豆基因组为模板进行扩增时，不论条件如何，均应没有特异性产物；当以嵌合引物的扩增产物为模板时，公共引物可以扩增出特异性产物；并且公共引物的Tm比转基因大豆靶特异性引物的Tm值低5～10 ℃。

本发明公开的试剂盒可用于产品尤其是食品中转基因大豆成分的检测，本发明公开的多重PCR是公共引物介导的多重PCR结合两步退火温度法。循环早期，在限定的两个退火温度下，低浓度的嵌合引物扩增靶标序列，产生带有公共引物末端的PCR产物；循环后期，在低退火温度下，高浓度的公共引物以早期产生的PCR产物为模板进行大量扩增。多重PCR采用的25μL反应体系包括：10μM的公共引物4μL，不同浓度的嵌合引物混合物2μL，2×DreamTaq Green Mix 12.5μL，DNA模板 1μL，灭菌ddH₂O 4.5μL；PCR反应条件为：为95℃预变性5min；95℃ 变性30s，62℃退火10s，56℃退火20s，72℃ 延伸30s共10个循环；然后72℃ 预变性2min；95℃ 变性30s，56℃退火 30s，72℃ 延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸7min。然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明本发明的检测转基因大豆的多重PCR试剂盒可同时或者独立特异性检测11种转基因大豆的基因组；利用构建的质粒模板，本发明的检测转基因大豆的多重PCR试剂盒的敏感性最高可达0.001%（w/w）转基因大豆成分含量，即0.001ng/100ngDNA样品，完全超出本领域技术人员的预期，非显而易见。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有以下优点：

（1）本发明公开的检测转基因大豆的多重PCR试剂盒，可同时也可单独检测我国批准进口的13种转基因大豆，不仅可以节约试剂使用量和降低检测成本，同时提高了检测效率，具有灵敏度高，经济、快速、操作简单等优点；

（2）本发明公开的试剂盒进行检测时，嵌合引物浓度低，公共引物浓度为1600nM；降低嵌合引物的浓度有利于加入更多对嵌合引物，提高多重PCR检测通量；采用单条公共引物，有利于减少二聚体的形成，高浓度有利于扩增特异性产物的量，进而提高检测敏感性；

（3）本发明公开的试剂盒采用一个PCR反应中的两步退火温度法，这是本发明的创造性所在，前10个循环扩增采用高退火温度结合低退火温度的方式有利于十三种嵌合引物的特异性结合，减少非特异性产物；后30个循环扩增低退火温度（与前循环低退火温度一样）使公共引物发挥放大作用；中间额外增加72℃预变性2 min，有利于为公共引物获得足够的模板；

（4）本发明公开的试剂盒中，公共引物与每条多重PCR特异引物的5' 末端连接，一起构成了嵌合引物；公共引物介导的多重PCR可以降低引物对的浓度，减少二聚体的形成，从而提高多重PCR的检测通量；通过创造性的设计克服了现有多重PCR体系存在的非特异性扩增、易存在二聚体的缺陷；

（5）本发明的多重PCR检测体系特异性高，敏感性高达0.001%（w/w）(转基因大豆成分含量)，即0.001ng/100ngDNA样品，这取得了显著的进步；单管进行，操作简单，且具有灵敏度高、经济、快速等优点，具有实际应用价值；

（6）本发明公开的多重PCR(mutiplex PCR)在一个PCR管中同时检测多个靶标分子，比southern杂交、基因芯片方法更加简便快捷，比荧光定量PCR更经济，与恒温扩增技术（包括环介导等温扩增法）相比不易污染及高通量。由于该技术所具有的高效性、敏感性和经济简便性等优点，可以在核酸检测技术中受到广泛关注。

附图说明

图1是本发明公共引物的特异性检测电泳图；

图2是本发明公共引物的新品种特异性检测电泳图；

图3是本发明嵌合引物的特异性检测的电泳结果图；

图4是本发明嵌合引物的敏感性检测的电泳结果图；

图5是本发明多重检测体系的特异性结果图；

图6是本发明多重检测体系的敏感性结果图。

具体实施方式

下面结合实施例与附图对本发明作进一步的描述，所涉及的设备以及原料都是购买，引物可根据本发明的序列人工合成。

主要试剂配置

200 mg/mL 氨苄青霉素，将4g 氨苄亲霉素和15 mL的灭菌水加到50ml容器中搅拌使其充分溶解，定容至20 mL。并用0.22 um过滤膜过滤除菌。分装，-20℃保存。

LB液体培养基，将10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g氯化钠和95 mL的ddH20加入到容器摇动容器使其溶解。调节pH值7.0，定容至1 L，高压蒸汽灭菌20 min，4℃保存。

LB固体培养基，称取胰蛋白胨5 g，酵母提取物2.5 g，氯化钠5 g，琼脂粉5 g，加入约480 mL的ddH20溶解，调节pH值至pH=7.0，定容至500 mL。高压灭菌20 min，冷却至70℃左右倒入培养皿，吹干后封边，倒置存放于4℃。

LB/Amp 固体平板，500 mL LB固体培养基高温高压灭菌25 min后，冷却至60℃左右时加入200 mg/mL的氨苄亲霉素，使其终浓度为200 μg/mL，缓慢摇动使其均匀冷却至60℃左右倒入培养皿，凝固吹干后封封边，倒置存放于4℃保存。

Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（50×TAE），称取Tris-base 121 g，量取冰乙酸28.5mL，加入0.5 mol/L的EDTA(pH8.0)50 mL，混合均匀后加ddH20定容至500 mL，室温保存。常用工作液浓度为1×，可现配现用。

30%甘油溶液，量取30 mL甘油溶液，加双蒸水定容至100 mL，高压蒸汽灭菌，分装于1.5 mL EP管中，4℃保存。使用时，加入等体积菌液，混匀后置于-80℃冰箱保存。

2%琼脂糖凝胶，称取琼脂糖3 g置于500 mL三角瓶，加入170 mL 1×TAE，微波炉加热4min，室温稍微冷却，加入适量1×TAE，放入微波炉加热4min，拿出剧烈摇晃使其均匀，置于室温冷却至60℃，加入适量geistain（1:1000），轻轻摇匀后注入合适的制胶盘的胶槽中，室温下放置40 min后，4℃冰箱保存。

植物基因组提取

按照植物基因组提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit）提取转基因大豆DP356043、DP305423、GTS40-3-2、MON87701、CV127、MON87769、MON87708、MON89788、MON87705品系和非转基因大豆的基因组。

豆制品收集和核酸提取

在市场上采样豆制品共73种，包括腐竹、茶干、豆干、豆浆、豆瓣酱等，根据PlantGenomic DNA Kit说明书提取样品核酸，-20℃保存。以样品DNA为模板，先用本发明UP-MPCR体系进行检测，再用国家农业部规定的方法检测，评估UP-M-PCR体系检测的准确性和实用性。

在转基因植物中，外源插入序列DNA片段一般包括启动子、目的基因和终止子3类元件，所以针对扩增的目的序列的不同，其检测特异性的差别也很大。品系特异性PCR检测是通过检测外源插入DNA和植物本身DNA的连接序列实现的，由于外源插入位点是唯一的并且连接区序列是单一拷贝的，所以品系特异性检测的特异性最高，能够区分具有相同构建的转基因品系。本发明设计建立的以公共引物介导的多重PCR体系，引入新品系MON87705，通过调整引物对浓度比和退火温度，建立能同时检测13种转基因大豆（包括2种复合性状）的多重PCR体系，验证了本发明设计的多重PCR检测体系具有足够的包容性。

实验表明，本发明的公共引物UP4与新品系MON87705作温度梯度实验（45℃-66℃）不产生条带，同时本发明设计的多重PCR体系具有高特异性和高敏感性（0.1%，甚至0.001%）的优点。欧盟新颁布规定所有转基因成分含量超过 0.9% 的食品和饲料都必须进行强制性标识，澳大利亚、以色列、沙特阿拉伯等国家的阈值为1%，智利的阈值是2%，韩国、马来西亚的阈值为3%，日本、印尼等国家规定的标识阈值为5%，中国目前采取的是零容忍的强制性标签制度。本检测体系敏感性达到0.1%（0.1ng/100 ng样品DNA）甚至更优，超过欧盟标准，适合用于检测。因此，本发明设计的UP-MPCR体系具有高通量的优点，可以同时在一个PCR管中一次性检测13种转基因大豆（包含2种复合性状），与荧光定量PCR相比，提高了检测通量，节省试剂耗材以及人力。

本发明对市场上普通豆制品采样73种，首先用本发明多重体系进行检测，再使用农业部发布的转基因大豆检测方法的结果进行比较，评价本方法的实用性，同时根据具体实验结果对本方法体系敏感性和特异性等进行进一步验证。针对豆制品包括豆腐、腐竹、豆浆、豆干、豆腐乳和酱油等标本，本方法共检测出42份标本含有转基因，并经过法定方法鉴定和测序确认，其中检出的转基因品系都包括MON87701、GTS40-3-2、CV127、A2704、DP356043、MON87708，使用法定方法时还测出MON87769品系。本发明的多重检测方法可检出MON87705品系标准品，其检测敏感性达到了0.001%。在实际检验样品时发现，国家农业部规定的法定方法都是针对每一种品系的单重PCR，所以每一个样品需要做11个反应，但使用本发明UP-MPCR体系只需一管就足够说明，节省了耗材和精力。

综上所述，本课题设计的公共引物介导的多重PCR检测体系，具有高通量、高敏感性、高特异性的优势，可在一个反应管中检测出13种转基因大豆品系（包含2种复合性状），提高了检测通量和检测效率。

实施例一公共引物的特异性

本发明采用1条公共引物(UP, universal primer)介导的多重PCR（UP-MPCR）检测方案，即在特异性上下游引物5’端添加同一条公共引物组成嵌合引物，与现有技术添加2条公共引物相比，体系出现的问题会更少。由公共引物介导的多重PCR体系中拥有低浓度的嵌合引物和高浓度的公共引物，在扩增早期，进行高/低退火温度PCR，此时嵌合引物发挥作用，与模板结合扩增产生含有公共引物的第一PCR产物，随着循环的进行，低浓度的嵌合引物很快被消耗掉，循环进行到后期，退火温度为低温，此时只有公共引物发挥作用，以第一PCR产物为模板，大量扩增目的条带。

公共引物作为整个技术体系中的核心技术，其质量好坏直接影响着技术的成败。本发明所采用的公共引物SEQ ID NO.1与转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA进行PCR扩增，在退火温度梯度45℃--65℃范围内均不能扩增特异产物，如图1，a-k为公共引物与转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA扩增结果，结果显示，公共引物均不能扩增特异产物，其中，泳道0为空白对照，泳道M为100bp DNA Marker，泳道1-8为退火温度梯度45℃--65℃；a模板为非转基因大豆基因组DNA，b模板为GTS 40-3-2基因组DNA，c模板为A2704-12基因组DNA，d模板为MON89788基因组DNA，e模板为DP356043基因组DNA，f模板为DP305423基因组DNA，g模板为CV127-9基因组DNA，h模板为MON87701基因组DNA，i模板为A5547-127基因组DNA，j模板为MON87708基因组DNA，k模板为MON87769基因组DNA。

以新品种MON87705品系DNA为模板做温度梯度实验（45℃-66℃）检测公共引物UP4的特异性，新品种MON87705品系与公共引物的特异性如图2，0泳道为空白对照；1-8泳道分别表示退火温度为45℃、48℃、51℃、54℃、57℃、60℃、63℃、66℃，在每个泳道无特异性带产生，说明公共引物对于13种转基因在本发明UP-MPCR体系中特异性良好。

本发明中，当以转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA为模板进行扩增时，不论扩增条件如何优化，均应没有扩增产物；当带有公共引物的多重嵌合引物有扩增产物时，通过公共引物一定可以扩增出特异性产物。

实施例二

检测转基因大豆的多重PCR试剂盒，包括常规多重PCR组件，还包括针对转基因大豆的嵌合引物和公共引物；嵌合引物和公共引物序列见表1，常规多重PCR组件包括Taq 聚合酶、dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液、去离子水、阳性对照引物对；

阳性对照正引物SEQ ID NO.24、阳性对照反引物SEQ ID NO.25，产物长度都为210bp；可用来检测DNA模板质量和反应体系扩增效率；SEQ ID NO.24：GGGTGAGGATAGGGTTCTCTG；SEQ ID NO.25：GCGATCGAGTAGTGAGAGTCG。

表1 针对我国进口的13种转基因大豆嵌合引物和公共引物

仅仅将公共引物、SEQ ID NO.14至SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列与常规多重PCR组件组合，则得到检测转基因大豆新品种MON87705品系的普通PCR试剂盒。

实施例三嵌合引物的特异性、敏感性检测

转基因成分的核酸检测中，根据扩增目的序列位置的不同，其检测特异性的差别很大，可分为筛选检测、基因特异性检测、构建特异性检测和品系特异性检测，其中品系特异性检测的特异性最高。

采用单引物多模板的方法检测嵌合引物特异性。混合模板为将11种转基因大豆基因组DNA（浓度均为25ng/ul）混合在一起，取4ul作为PCR模板，检测每对特异性嵌合引物的特异性，PCR程序见表2，具体PCR反应体系见表3。

表2 PCR程序

表3 PCR反应体系

其中公共引物的终浓度为1600nM，针对转基因大豆的嵌合引物对的终浓度如下：M7SF53.6nM、M7SR 53.6nM、D6SF 52.8nM、D6SR 52.8nM、D2SF 54.4nM、D2SR 54.4nM、CVSF24nM、CVSR 24nM、M69SF16nM、M69SR 64nM、A2SF 64nM、A2SR 16nM、GSF 52nM、GSR 52nM、M05SR 40nM、M08SF32nM、M9SF 64nM、A5SR 64nM、A5SF 64nM。嵌合引物特异性检测结果如图3，泳道M为100bpDNA Ladder，泳道0为空白对照，泳道1~11所用嵌合引物分别对应转基因大豆MON87701、DP356043、DP305423、CV127、MON87769、A2704-12、GTS40-3-2、MON7705、MON87708、MON89788、A5547-127；每一个泳道都出现预期的目的条带，并且清晰明亮，说明11对特异性嵌合引物特异性良好，和靶标基因以外的其他转基因品系不发生特异性反应；扩增产物经进一步测序，证明为相对应的转基因大豆检测序列。本部分的实验结果表明，本发明的多重体系具有高特异性。

将11种转基因大豆基因组DNA（初始浓度为25ng/μL）与非转基因大豆基因组混合，使每种转基因大豆浓度在混合液中分别为25%、10%、1%、0.1%、0.01%、0.001% 稀释度的基因组DNA溶液，每个稀释度取1μL作为模板，对11对特异性嵌合引物进行模板浓度梯度PCR反应。扩增体系见表4，扩增程序见表2。

表4 PCR扩增体系

嵌合引物敏感性检测结果如图4，泳道M为100bpDNA Ladder，泳道0为去离子水为模板的空白阴性对照，图a-k分别对应转基因大豆MON87701、DP356043、DP305423、CV127、MON87769、A2704-12、GTS40-3-2、MON87705、MON87708、MON89788、A5547-127，1-6分别对应加入转基因大豆DNA含量为25%，10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%。MON87701、DP356043、DP305423、GTS40-3-2、MON87705、MON87708的特异性嵌合引物的敏感性达到0.1%，A5547-127、A2704-12品系的特异性嵌合引物敏感性达到了0.01%，MON87769、MON89788、CV127品系的特异性嵌合引物敏感性达到了0.001%，这充分说明了本发明的11对特异性嵌合引物具有极高的敏感性，可以适用于接下来的多重PCR检测体系，取得了意想不到的技术效果。

实施例四多重检测体系的特异性、敏感性检测

采用UP-MPCR检测体系，即采用本发明的多重PCR试剂盒，分别以11种转基因大豆品系和非转基因大豆基因组DNA为模板进行扩增检测体系特异性，PCR程序见表2，具体PCR反应体系见表3。

本发明UP-MPCR体系特异性检测结果如图5，PM：PCR产物marker；M：100bp marker；N：非转基因大豆基因组为模板；0：空白对照；1-11：分别以MON87701、DP356043、DP305423、CV127、MON87769、A2704-12、GTS40-3-2、MON87705、MON87708、MON89788、A5547-127为模板，每个泳道都跑出预期的明亮的目的条带；所有PCR反应产物均经测序结果进一步确认了扩增出了预期的目的条带，说明本发明设计的针对13种转基因大豆品系（包括2种复合性状）的UP-MPCR能够准确的扩增出大小可分的目的条带。

分别用11种转基因大豆基因组DNA（初始浓度为25ng/μL）与非转基因大豆基因组混合，使混合液中转基因大豆基因组的百分含量为10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%。稀释度的基因组DNA溶液，每个稀释度取1μL作为模板，采用UP-MPCR程序分别对11个靶标基因进行模板梯度PCR反应。扩增体系见表4，扩增程序见表2。

本发明UP-MPCR体系敏感性检测结果如图6，a-e：各个模板浓度为10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%；M：100bp marker；0：空白对照；N：以非转基因大豆基因组作为模板；1-11：分别以MON87701、DP356043、DP305423、CV127、MON87769、A2704-12、GTS40-3-2、MON87705、MON87708、MON89788、A5547-127为模板，图中可以看出，检测转基因大豆的UP-MPCR的体系敏感性超过0.1%（0.1ng/100 ng样品DNA），超过欧盟标准（0.9%），更可喜的是，多数敏感性达到0.01%、0.001%。

上述PCR中，公共引物的终浓度为1600nM，针对转基因大豆的嵌合引物对的终浓度如下：M7SF53.6nM、M7SR 53.6nM、D6SF 52.8nM、D6SR 52.8nM、D2SF 54.4nM、D2SR 54.4nM、CVSF 24nM、CVSR 24nM、M69SF16nM、M69SR 64nM、A2SF 64nM、A2SR 16nM、GSF 52nM、GSR52nM、M05SR 40nM、M08SF32nM、M9SF 64nM、A5SR 64nM、A5SF 64nM。如果采用本课题组12种基因检测时嵌合引物浓度的话得到的结果不理想，6条泳道无法显示条带，5条泳道条带非常弱，不明显。

如果采用“PCR反应条件为：95℃预变性 5min；95℃ 变性30s，61℃退火 30s，72℃延伸30s，共10个循环；72℃ 延伸2min；95℃ 变性30s，54℃退火 30s，72℃ 延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸7min”，模板浓度为0.1%，得到的结果不理想，5条泳道无法显示条带，4条泳道条带非常弱，不明显。

实施例五豆制品检测

采用本发明的多重PCR试剂盒，根据表2、表3的参数；将从73份豆制品提取的核酸进行多重检测，共检测出42份阳性标本（57.5%，42/73），其中36种DP356043（49.3%，36/73），8种GTS40-3-2（11.1%，8/73），3种CV127（4.1%，3/73），9种MON87701（12.3%，9/73），3种A2704-12（4.1%，3/73）1种MON87708（1.4%，1/73）。将阳性标本的PCR原液送至测序确认。以豆制品提取的核酸为模板用国家农业部规定的方法进行检测，共测出42份阳性标本（57.5%，42/73），其中36种DP356043（49.3%，36/73），11种GTS40-3-2（15.1%，11/73），3种CV127（4.1%，3/73），8种MON87701（11.1%，8/73），4种A2704-121（5.5%，4/73），1种MON87708（1.4%，1/73），3种MON87769（4.1%，3/73）。两种方法对于DP356043品系和CV127的检出数量是一致的，如表5。对于GTS40-3-2品系和A2704-121品系以及MON87769品系，法定方法的检出数比UP-MPCR要多，而对于MON87701，UP-MPCR的检出数多，综合来看，UP-MPCR对于检测豆制品中是否含有转基因成分具有实用性。

表5 UP-MPCR检测结果与法定方法检测结果

本发明创造性的公开针对MON87705品系的引物，通过限定引物对之间的浓度比以及多重体系，建立针对13种转基因大豆的以“公共引物”介导的多重PCR分子诊断技术，并研究该多重PCR体系的包容性。结果显示，本发明建立的公共引物介导的多重PCR的敏感性可检测稀释1000倍11种转基因大豆基因组DNA稀释混合液，体系敏感性超过0.1%，甚至达到0.01%、0.001%，优于国家对于转基因食品检测标准要求。

序列表

<110> 苏州市食品检验检测中心

苏州大学

<120> 十三种转基因大豆检测用多重PCR试剂盒及检测方法

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcgtcaact ccgcaag 17

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcgtcaact ccgcaagata ttgaccatca tactcattgc tg 42

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcgtcaact ccgcaagtca ctttcttgaa ttagcttgct 40

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgtcaact ccgcaagctt ttgcccgagg tcgttag 37

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcgtcaact ccgcaaggcc ctttggtctt ctgagactg 39

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcgtcaact ccgcaagcgt caggaataaa ggaagtacag ta 42

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcgtcaact ccgcaagatt tctaacctgg ctgctatagt ta 42

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcgtcaact ccgcaagtgt ataggaaagc gcaaactgat g 41

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctcgtcaact ccgcaagatt agggtttcag caggttcgt 39

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctcgtcaact ccgcaagatg agaagatggt tttttccaag gt 42

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcgtcaact ccgcaagtgt cgtttcccgc cttcag 36

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctcgtcaact ccgcaagtac caatgcttaa tcagtgaggc 40

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctcgtcaact ccgcaaggaa tgcaacacac tgtaacaatt tg 42

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctcgtcaact ccgcaagata ttgaccatca tactcattgc tg 42

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctcgtcaact ccgcaagata gggctttgtg ggatctat 38

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctcgtcaact ccgcaagaac ccttcaattt aaccgatgc 39

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctcgtcaact ccgcaagttg cgaaggatag tgggattgt 39

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctcgtcaact ccgcaagggc agtaacttga aagactatga ac 42

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctcgtcaact ccgcaagtgt cgtttcccgc cttcag 36

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctcgtcaact ccgcaagtac caatgcttaa tcagtgaggc 40

<210> 21

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctcgtcaact ccgcaagaaa atacaaattt aacacttcat tgg 43

<210> 22

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctcgtcaact ccgcaagggt aatctaaaca tgcatgagaa atg 43

<210> 23

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctcgtcaact ccgcaagtgt cgtttcccgc cttcag 36

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gggtgaggat agggttctct g 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gcgatcgagt agtgagagtc g 21

Claims

1.十三种转基因大豆检测用多重PCR试剂盒，包括公共引物、针对转基因大豆的嵌合引物；所述公共引物的序列为SEQ ID NO.1；所述针对转基因大豆的嵌合引物为SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述PCR试剂盒，其特征在于：所述PCR试剂盒还包括Taq 聚合酶、dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液、去离子水、阳性对照引物对。

3.根据权利要求2所述PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照引物对的序列为SEQ IDNO.24、SEQ ID NO.25。

4.权利要求1所述PCR试剂盒在检测豆制品中转基因大豆成分中的应用。