CN114752663B - 一种荧光串扰校正方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种荧光串扰校正方法及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种荧光串扰校正方法，所述方法使用低成本、可控的添加剂调控荧光光谱红移或蓝移，使荧光染料的荧光光谱与标准PCR反应体系中产生的荧光光谱接近，实现了低成本、准确的荧光串扰校正，在实时荧光定量PCR以及数字PCR等的PCR检测中极具应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光串扰校正方法及其应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
多重核酸检测技术是在同一个PCR体系中同时加入多种靶标序列的特异性引物，对多个DNA或者RNA模板，或同一个模板当中多个区域同时进行PCR扩增。由于具备很强的高效性、可靠性和简便性，多重核酸检测技术已被广泛应用于核酸诊断的许多领域，包括基因敲除分析、突变和多态性分析、定量分析以及RNA检测等。
目前，实现10～50重以上靶标数目的超多重核酸检测技术一般需经由PCR扩增放大再“开管检测”，如芯片、质谱、微球、电泳、测序等。然而，这些技术普遍存在设备昂贵，操作复杂、周转时间长、易污染等缺点，且国产化率低，在国内外市场上不温不火，长期进展缓慢。
实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)是目前应用最广泛的核酸检测技术，可以精准定量分析基因突变、遗传变异、RNA表达和蛋白表达信息。最新的研究成果MeltArray利用qPCR可以实现单个通道12个熔解温度至多72重(6个荧光通道)的超多靶标检测(PNAS，2022)，显示出qPCR技术在超多重核酸检测方面的潜力，同时，qPCR相比其他开盖检测具有明显的成本低、操作简便、自动化程度高、周转时间短等诸多优势。
超多重核酸检测技术要求qPCR反应体系单管内能兼容更多的荧光探针/染料。由于常用的核酸检测荧光探针波长差距小，在荧光检测时存在荧光串扰，因此，在多重荧光检测时一般需要通过荧光补偿算法校正，得到每个荧光探针/染料的真实荧光信号。而常用的荧光补偿算法校正离不开标准荧光溶液的制备与检测，对单种荧光探针/染料在不同荧光通道下检测，再通过每个荧光通道的分量，建立荧光补偿算法，是目前荧光补偿算法校正不可或缺的步骤。
但是，荧光物质的荧光光谱往往受到基团修饰、溶液的极性、pH、离子浓度、荧光物质浓度、温度等多种因素的影响，并且，PCR反应体系恰好存在酶、核酸、buffer等多种影响荧光光谱的因素，导致纯染料水溶液的荧光光谱跟PCR反应体系中的荧光光谱存在较大差异，影响荧光补偿的准确性，因此，直接使用PCR反应试剂进行校正存在试剂扩增效率不一致、成本高、耗时长等缺点。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种荧光串扰校正方法，所述荧光串扰校正方法包括如下步骤：
步骤一：以添加有标准PCR反应体系的PCR板作为荧光检测板，以添加有水的PCR板作为背景板，分别使用荧光检测板和背景板在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行，检测反应终点每个荧光通道的荧光强度；根据荧光检测板和背景板测得的荧光强度，计算每个荧光通道的荧光串扰系数；
步骤二：用稀释buffer稀释荧光染料，得到荧光染料稀释液；以添加有荧光染料稀释液的PCR板作为荧光检测板，以添加有稀释buffer的PCR板作为背景板，分别使用荧光检测板和背景板在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行，检测反应终点每个荧光通道的荧光强度；根据荧光检测板和背景板测得的荧光强度，计算每个荧光通道的荧光串扰系数；
步骤三：比较步骤一和步骤二的荧光串扰系数，根据荧光染料与标准PCR反应体系的荧光串扰系数差值，在荧光染料稀释液和稀释buffer中加入使光谱红移或蓝移的添加剂；使用加入使光谱红移或蓝移的添加剂的荧光染料稀释液和稀释buffer重复步骤二～三，直至荧光染料与标准PCR反应体系的荧光串扰系数差值满足校正要求。所述使光谱红移的添加剂能够使荧光串扰系数变大，所述使光谱蓝移的添加剂能够使荧光串扰系数变小。
在本发明的一种实施方式中，所述荧光串扰校正方法用于PCR检测。
在本发明的一种实施方式中，所述PCR检测为实时荧光定量PCR检测或数字PCR检测。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤一为：将探针法预混液、荧光引物、探针和模板混合，得到标准PCR反应体系；在PCR板的每个孔中加入标准PCR反应体系10～50μL，得到荧光检测板；在PCR板的每个孔中加入水10～50μL，得到背景板；分别使用荧光检测板和背景板在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行，检测反应终点每个荧光通道的荧光强度；根据荧光检测板和背景板测得的荧光强度，计算每个荧光通道的荧光串扰系数；
所述步骤二为：用稀释buffer将荧光染料稀释至浓度为50～400nM，得到荧光染料稀释液；在PCR板的每个孔中加入荧光染料稀释液10～50μL，得到荧光检测板；在PCR板的每个孔中加入稀释buffer 10～50μL，得到背景板；分别使用荧光检测板和背景板在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行，检测反应终点每个荧光通道的荧光强度；根据荧光检测板和背景板测得的荧光强度，计算每个荧光通道的荧光串扰系数。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤一为：将探针法预混液、荧光引物、探针和模板混合，得到标准PCR反应体系；在PCR板的每个孔中加入标准PCR反应体系20～30μL，得到荧光检测板；在PCR板的每个孔中加入水20～30μL，得到背景板；分别使用荧光检测板和背景板在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行，检测反应终点每个荧光通道的荧光强度；根据标准PCR反应体系测得的荧光强度，计算每个荧光通道的荧光串扰系数；
所述步骤二为：用稀释buffer将荧光探针稀释至浓度为100～200nM，得到荧光染料稀释液；在PCR板的每个孔中加入荧光染料稀释液20～30μL，得到荧光检测板；在PCR板的每个孔中加入稀释buffer 20～30μL，得到背景板；分别使用荧光检测板和背景板在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行，检测反应终点每个荧光通道的荧光强度；根据荧光检测板和背景板测得的荧光强度，计算荧光串扰系数。
在本发明的一种实施方式中，步骤二中，所述荧光串扰系数的计算方法为：先根据荧光串扰公式计算得到每个荧光通道的x，然后对每个荧光通道的x进行归一化，得到每个荧光通道的荧光串扰系数；
所述荧光串扰公式为：x＝荧光检测板测得的荧光强度-背景板测得的荧光强度；
所述归一化为：将每个荧光通道的x除以x的最大值。
在本发明的一种实施方式中，所述校正要求为：荧光串扰系数差值小于0.01。
在本发明的一种实施方式中，所述稀释buffer为pH缓冲液、离子型表面活性剂溶液或氨基酸类添加剂溶液中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述pH缓冲液的离子浓度为10～500mM、pH为4～10。
在本发明的一种实施方式中，所述pH缓冲液的离子浓度为50～300mM、pH为8～9。
在本发明的一种实施方式中，所述离子型表面活性剂溶液的浓度为质量百分比0.1～10％。
在本发明的一种实施方式中，所述离子型表面活性剂溶液的浓度为质量百分比0.2～2％。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基酸类添加剂溶液的浓度为10～500nM。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基酸类添加剂溶液的浓度为20～100nM。
在本发明的一种实施方式中，所述pH缓冲液为Tris-HCl缓冲液、TE缓冲液、PBS缓冲液、PB缓冲液或柠檬酸钠缓冲液中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述离子型表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基酸类添加剂为牛血清白蛋白、氨基酸或甜菜碱中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述使光谱红移的添加剂为有机溶剂。
在本发明的一种实施方式中，所述有机溶剂为DMF、DMSO、丙三醇、异丙醇或聚乙二醇中的一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述使光谱红移的添加剂在荧光染料稀释液或稀释buffer中的添加量占荧光染料稀释液或稀释buffer总体积的1～10％。
在本发明的一种实施方式中，所述使光谱蓝移的添加剂为非离子表面活性剂或聚阴离子电解质中的一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述非离子表面活性剂为TX-100、Tween-20或F-127中的一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述聚阴离子电解质为海藻酸钠、聚苯乙烯磺酸钠或聚丙烯酸钠中的一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述使光谱蓝移的添加剂在荧光染料稀释液或稀释buffer中的添加量占荧光染料稀释液或稀释buffer总质量的0.1～10％。
在本发明的一种实施方式中，所述荧光探针包含一段寡聚核苷酸序列和荧光基团；所述荧光基团修饰在寡聚核苷酸序列的中间、3端或5端。
在本发明的一种实施方式中，所述荧光基团为AMCA、Pacific Blue、Atto425、BODIPY FL、FAM、Oregon Green 488、TET、JOE、R6G、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、AquaPhluor 593、Texas Red、Atto 590、IR Dye 650、Cy5、Quasar670、Cy5.5、Cy7、IR Dye 750或Alexa Flour。
在本发明的一种实施方式中，所述荧光染料为荧光探针所携带荧光基团的衍生化合物。
在本发明的一种实施方式中，所述PCR板为96孔PCR板。
本发明还提供了上述荧光串扰校正方法在PCR检测中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述PCR检测为实时荧光定量PCR检测或数字PCR检测。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种荧光串扰校正方法，所述方法使用低成本、可控的添加剂调控荧光光谱红移或蓝移，使荧光染料的荧光光谱与标准PCR反应体系中产生的荧光光谱接近，实现了低成本、准确的荧光串扰校正，在实时荧光定量PCR以及数字PCR等的PCR检测中极具应用前景。
附图说明
图1：实验组一的扩增曲线。
图2：实验组二的扩增曲线。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实验例1
实验例1对具有6通道的荧光定量PCR仪(ABI QuantStudio 7flex)进行荧光校正，以TARMA荧光探针为例，研究了不同添加剂对荧光光谱的影响。此实验共分为五组，五组实验的实验设计如下：
实验组一：配置由探针法预混液(诺唯赞，Taq Pro HS Probe Master Mix，QN111-02)、荧光引物、探针和模板(荧光引物、探针和模板均由生工生物合成，上游引物、下游引物、探针和模板的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4，其中，探针的5’端连接有TAMRA荧光基团、3’端连接有BHQ2淬灭基团)按照标准配比混合而得的标准PCR反应体系(具体配方见表1)；在PCR板的每个孔中加入标准PCR反应体系25μL，得到荧光检测板；在PCR板的每个孔中加入纯水25μL，得到背景板；分别使用荧光检测板和背景板在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行95℃30s，95℃10s，60℃30s 40个循环，PCR结束后，设置温度程序60℃2min，60℃30s 12个循环，在循环中采集每个荧光通道(X1-M1、X2-M2、X3-M3、X4-M4、X5-M5、X6-M6)信号，导出原始数据后，计算TARMA荧光探针在每个荧光通道的荧光串扰系数(荧光串扰系数见表2)；
其中，荧光串扰系数的计算方法为：先根据荧光串扰公式x＝荧光检测板测得的荧光强度-背景板测得的荧光强度，计算得到每个荧光通道的x，然后对每个荧光通道的x进行归一化(每个荧光通道数据除以6个中最强的数)，得到TARMA荧光探针在每个荧光通道的荧光串扰系数；
实验组二：用稀释buffer将TARMA荧光染料(购自AAT Bioquest)稀释至浓度为200nM，得到荧光染料稀释液，其中，稀释buffer为添加有CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)0.5wt％、BSA(牛血清白蛋白)2wt％的Tris-HCl缓冲液(50mM、pH＝8)；在PCR板的每个孔中加入荧光染料稀释液25μL，得到荧光检测板；在PCR板的每个孔中加入稀释buffer 25μL，得到背景板；分别使用荧光检测板和背景板在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行60℃2min，60℃30s 12个循环，在循环中采集每个荧光通道(X1-M1、X2-M2、X3-M3、X4-M4、X5-M5、X6-M6)信号，导出原始数据后，计算TARMA荧光染料在每个荧光通道的荧光串扰系数(荧光串扰系数见表2)；
其中，荧光串扰系数的计算方法为：先根据荧光串扰公式x＝荧光检测板测得的荧光强度-背景板测得的荧光强度，计算得到每个荧光通道的x，然后对每个荧光通道的x进行归一化(每个荧光通道数据除以6个中最强的数)，得到TARMA荧光染料在每个荧光通道的荧光串扰系数；
实验组三：在实验组二的基础上，在稀释buffer中添加占稀释buffer总体积1％的二甲基亚砜(DMSO)，并使用添加有二甲基亚砜的稀释buffer将TARMA荧光染料稀释至浓度为200nM，得到荧光染料稀释液(荧光串扰系数见表2)；
实验组四：在实验组二的基础上，在稀释buffer中添加占稀释buffer总体积1％的丙三醇，并使用添加有丙三醇的稀释buffer将TARMA荧光染料稀释至浓度为200nM，得到荧光染料稀释液(荧光串扰系数见表2)；
实验组五：在实验组二的基础上，在稀释buffer中添加占稀释buffer总体积1％的丙三醇和占稀释buffer总体积1％的TX-100，并使用添加有丙三醇和TX-100的稀释buffer将TARMA荧光染料稀释至浓度为200nM，得到荧光染料稀释液(荧光串扰系数见表2)。
由实验组一～二的检测结果可知，相比于实验组一使用的标准PCR反应体系，实验组二使用的纯染料体系在通道2串扰多，通道4串扰少，光谱需要红移；由实验组三～五的检测结果可知，添加有机溶剂可实现光谱红移动，再加入表面活性剂可使光谱微小蓝移，接近PCR中的光谱。
表1标准PCR反应体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| 预混液(2×) | 12.5 |
| 上游引物(10μM) | 0.5 |
| 下游引物(10μM) | 0.5 |
| 探针(10μM) | 0.25 |
| 水 | 6.25 |
| 模板 | 5 |
| 总计 | 25 |
表2不同实验组所得荧光串扰系数
| 组别 | 通道1 | 通道2 | 通道3 | 通道4 | 通道5 | 通道6 |
| 实验组一 | 0.0664 | 0.2026 | 1 | 0.3072 | 0.0014 | -0.0008 |
| 实验组二 | -0.0244 | 0.2386 | 1 | 0.2602 | -0.0028 | 0.0118 |
| 实验组三 | -0.0199 | 0.2230 | 1 | 0.2726 | -0.0005 | 0.0027 |
| 实验组四 | -0.0282 | 0.1920 | 1 | 0.3167 | -0.0004 | 0 |
| 实验组五 | 0.0458 | 0.1974 | 1 | 0.2993 | 0.0018 | 0.0006 |
实验例2
实验例2对具有6通道的荧光定量PCR仪(ABI QuantStudio 7flex)进行荧光校正，以CY5.5荧光探针为例，研究了不同添加剂对荧光光谱的影响。此实验共分为四组，四组实验的实验设计如下：
实验组一：配置由探针法预混液(诺唯赞，Taq Pro HS Probe Master Mix，QN111-02)、荧光引物、探针和模板(荧光引物、探针和模板均由生工生物合成，上游引物、下游引物、探针和模板的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4，其中，探针的5’端连接有CY5.5荧光基团、3’端连接有BHQ3淬灭基团)按照标准配比混合而得的标准PCR反应体系(具体配方见表1)；在PCR板的每个孔中加入标准PCR反应体系25μL，得到荧光检测板；在PCR板的每个孔中加入纯水25μL，得到背景板；分别使用荧光检测板和背景板在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行95℃30s，95℃10s，60℃30s 40个循环，PCR结束后，设置温度程序60℃2min，60℃30s 12个循环，在循环中采集每个荧光通道(X1-M1、X2-M2、X3-M3、X4-M4、X5-M5、X6-M6)信号，导出原始数据后，计算CY5.5荧光探针在每个荧光通道的荧光串扰系数(荧光串扰系数见表3)；
其中，荧光串扰系数的计算方法为：先根据荧光串扰公式x＝荧光检测板测得的荧光强度-背景板测得的荧光强度，计算得到每个荧光通道的x，然后对每个荧光通道的x进行归一化(每个荧光通道数据除以6个中最强的数)，得到CY5.5荧光探针在每个荧光通道的荧光串扰系数；
实验组二：用稀释buffer将CY5.5荧光染料(购自AAT Bioquest)稀释至浓度为200nM，得到荧光染料稀释液，其中，稀释buffer为添加有SDS(十二烷基硫酸钠)0.5wt％、BSA 1wt％的的Tris-HCl缓冲液(50mM、pH＝8)；在PCR板的每个孔中加入荧光染料稀释液25μL，得到荧光检测板；在PCR板的每个孔中加入稀释buffer 25μL，得到背景板；分别使用荧光检测板和背景板在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行60℃2min，60℃30s 12个循环，在循环中采集每个荧光通道(X1-M1、X2-M2、X3-M3、X4-M4、X5-M5、X6-M6)信号，导出原始数据后，计算CY5.5荧光染料在每个荧光通道的荧光串扰系数(荧光串扰系数见表3)；
其中，荧光串扰系数的计算方法为：先根据荧光串扰公式x＝荧光检测板测得的荧光强度-背景板测得的荧光强度，计算得到每个荧光通道的x，然后对每个荧光通道的x进行归一化(每个荧光通道数据除以6个中最强的数)，得到CY5.5荧光染料在每个荧光通道的荧光串扰系数；
实验组三：在实验组二的基础上，在稀释buffer中添加占稀释buffer总体积2％的聚丙烯酸钠，并使用添加有聚丙烯酸钠的稀释buffer将CY5.5荧光染料稀释至浓度为200nM，得到荧光染料稀释液(荧光串扰系数见表3)；
实验组四：在实验组二的基础上，在稀释buffer中添加占稀释buffer总体积2％的聚丙烯酸钠和占稀释buffer总体积1％的二甲基亚砜(DMSO)，并使用添加有丙三醇和二甲基亚砜的稀释buffer将CY5.5荧光染料稀释至浓度为200nM，得到荧光染料稀释液(荧光串扰系数见表3)。
由实验组一～二的检测结果可知，相比于实验组一使用的标准PCR反应体系，实验组二使用的纯染料体系在通道5的串扰少，光谱需要蓝移；由实验组三～四的检测结果可知，添加聚阴离子电解质可实现光谱蓝移，再加入有机溶剂可使光谱红移，接近PCR中的光谱。
表3不同实验组所得荧光串扰系数
实验例3
实验例3对具有6通道的荧光定量PCR仪(ABI QuantStudio 7flex)进行荧光校正，以CY5.5荧光探针为例，研究了不同添加剂对荧光串扰校正效果的影响。此实验共分为两组，两组实验的实验设计如下：
实验组一：用稀释buffer将CY5.5荧光染料(购自AAT Bioquest)稀释至浓度为200nM，得到荧光染料稀释液，其中，稀释buffer为添加有SDS(十二烷基硫酸钠)0.5wt％、BSA 1wt％的Tris-HCl缓冲液(50mM、pH＝8)；使用荧光染料稀释液在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行软件，并根据提示完成多通道荧光定量PCR仪的染料荧光串扰校正，依次存储在仪器中；校正结束后，配置由探针法预混液(诺唯赞，Taq Pro HS Probe Master Mix，QN111-02)、荧光引物、探针和模板(荧光引物、探针和模板均由生工生物合成，上游引物、下游引物、探针和模板的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQID NO.4，其中，探针的5’端连接有CY5.5荧光基团、3’端连接有BHQ2淬灭基团)按照标准配比混合而得的标准PCR反应体系(具体配方见表1)；使用标准PCR反应体系在经校正多通道荧光定量PCR仪上运行95℃30s，95℃10s，60℃30s 40个循环，PCR结束后，设置温度程序60℃2min，60℃30s 12个循环，在循环中采集每个荧光通道(X1-M1、X2-M2、X3-M3、X4-M4、X5-M5、X6-M6)信号，得到扩增曲线(扩增曲线见图1)；
实验组二：在实验组一的基础上，在稀释buffer中添加占稀释buffer总体积1％的海藻酸钠，并使用添加有海藻酸钠的稀释buffer将CY5.5荧光染料稀释至浓度为200nM，得到荧光染料稀释液(扩增曲线见图2)。
由图1可知，经实验组一的纯染料体系校正后，CY5通道产生不应该有的荧光信号，说明出现荧光串扰；由图2可知，使用实验组二的添加有聚阴离子电解质的染料体系可以正常校正无串扰。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 苏州国科芯感医疗科技有限公司
<120> 一种用于实时荧光定量PCR的荧光串扰校正方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agtcttccag tgtgatgatg g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gttggctctg actgtaccac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgggcctcc ggttcatgcc 20
<210> 4
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccagtgtgca gggtggcaag tggctcctga cctggagtct tccagtgtga tgatggtgag 60
gatgggcctc cggttcatgc cgcccatgca ggaactgtta cacatgtagt tgtagtggat 120
ggtggtacag tcagagccaa cctaggagat aacacaggcc caagatgagg c 171
Claims (6)
1.一种荧光串扰校正方法，其特征在于，所述荧光串扰校正方法为非疾病的诊断和治疗目的，包括如下步骤：
步骤一：将探针法预混液、引物、荧光探针和模板混合，得到标准PCR反应体系；以添加有标准PCR反应体系的PCR板作为荧光检测板，以添加有水的PCR板作为背景板，分别使用荧光检测板和背景板在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行，检测反应终点每个荧光通道的荧光强度；根据荧光检测板和背景板测得的荧光强度，计算每个荧光通道的荧光串扰系数；
步骤二：用稀释buffer稀释荧光染料，得到荧光染料稀释液；以添加有荧光染料稀释液的PCR板作为荧光检测板，以添加有稀释buffer的PCR板作为背景板，分别使用荧光检测板和背景板在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行，检测反应终点每个荧光通道的荧光强度；根据荧光检测板和背景板测得的荧光强度，计算每个荧光通道的荧光串扰系数；
步骤三：比较步骤一和步骤二的荧光串扰系数，根据荧光染料与标准PCR反应体系的荧光串扰系数差值，在荧光染料稀释液和稀释buffer中加入使光谱红移或蓝移的添加剂；使用加入使光谱红移或蓝移的添加剂的荧光染料稀释液和稀释buffer重复步骤二~三，直至荧光染料与标准PCR反应体系的荧光串扰系数差值满足校正要求；
所述荧光串扰系数的计算方法为：先根据荧光串扰公式计算得到每个荧光通道的x，然后对每个荧光通道的x进行归一化，得到每个荧光通道的荧光串扰系数；所述荧光串扰公式为：x=荧光检测板测得的荧光强度-背景板测得的荧光强度；所述归一化为：将每个荧光通道的x除以x的最大值；
步骤三中，所述校正要求为：荧光串扰系数差值小于0.01；
所述使光谱红移的添加剂为DMSO或丙三醇；所述使光谱蓝移的添加剂TX-100、聚丙烯酸钠或海藻酸钠；所述稀释buffer为pH缓冲液、离子型表面活性剂溶液或氨基酸类添加剂溶液中的一种以上。
2.如权利要求1所述的荧光串扰校正方法，其特征在于，所述步骤一为：将探针法预混液、引物、荧光探针和模板混合，得到标准PCR反应体系；在PCR板的每个孔中加入标准PCR反应体系10~50μL，得到荧光检测板；在PCR板的每个孔中加入水10~50μL，得到背景板；分别使用荧光检测板和背景板在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行，检测反应终点每个荧光通道的荧光强度；根据荧光检测板和背景板测得的荧光强度，计算每个荧光通道的荧光串扰系数；
所述步骤二为：用稀释buffer将荧光染料稀释至浓度为50~400nM，得到荧光染料稀释液；在PCR板的每个孔中加入荧光染料稀释液10~50μL，得到荧光检测板；在PCR板的每个孔中加入稀释buffer 10~50μL，得到背景板；分别使用荧光检测板和背景板在待校正多通道荧光定量PCR仪上运行，检测反应终点每个荧光通道的荧光强度；根据荧光检测板和背景板测得的荧光强度，计算每个荧光通道的荧光串扰系数。
3.如权利要求1所述的荧光串扰校正方法，其特征在于，所述pH缓冲液的离子浓度为10~500mM、pH为4~10；所述离子型表面活性剂溶液的浓度为质量百分比0.1~10%；所述氨基酸类添加剂溶液的浓度为10~500nM。
4.如权利要求1所述的荧光串扰校正方法，其特征在于，所述pH缓冲液为Tris-HCl缓冲液、TE缓冲液、PBS缓冲液、PB缓冲液或柠檬酸钠缓冲液中的一种以上；所述离子型表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠或十六烷基三甲基溴化铵中的一种以上；所述氨基酸类添加剂为牛血清白蛋白、氨基酸或甜菜碱中的一种以上。
5.如权利要求1~3任一项所述的荧光串扰校正方法，其特征在于，所述使光谱红移的添加剂在荧光染料稀释液或稀释buffer中的添加量占荧光染料稀释液或稀释buffer总体积的1~10%。
6.如权利要求1~3任一项所述的荧光串扰校正方法，其特征在于，所述使光谱蓝移的添加剂在荧光染料稀释液或稀释buffer中的添加量占荧光染料稀释液或稀释buffer总质量的0.1~10%。
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| CN113358609A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-09-07 | 公安部第一研究所 | 一种利用多色荧光内标动态校正dna荧光光谱的方法 |
Non-Patent Citations (3)
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| 丁基罗丹明B-表面活性剂体系荧光光谱法测定人血清蛋白;汪新等;光谱实验室;第22卷(第02期);第115-118页 * |
| 多重定量PCR系统中多色荧光检测和光谱串扰校正方法;臧留琴等;光学学报;第34卷(第01期);第195-201页 * |
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| CN114752663A (zh) | 2022-07-15 |
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