CN110117675B - 一种实时荧光定量pcr检测rcl的试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种实时荧光定量PCR检测有复制能力的慢病毒(Replication Competent Lentivirus，RCL)的试剂和方法。具体地，本发明提供了一种检测RCL的引物和探针组合，以及利用该引物和探针进行检测的方法，本发明还提供了包含该引物和探针的试剂盒。本发明的引物和探针组合检测RCL，扩增效率高、特异性好，可以用于产品生产过程中可能产生的RCL检测及临床病人外周血样本RCL的监测。

Description

一种实时荧光定量PCR检测RCL的试剂和方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，更具体地涉及一种实时荧光定量PCR检测RCL的试剂和方法。
背景技术
以慢病毒为载体的基因/细胞治疗中安全性的最大风险是产生具有复制能力的慢病毒(Replication Competent Lentivirus，RCL)。尽管现有的慢病毒生产体系已经极大地降低了产生RCL的可能性，但仍然存在一定的风险产生RCL，仍需恰当的检测方案来检测RCL。根据美国FDA在2006年颁布的FDA RCR Guidance和2010年颁布的FDARecommendations的建议，需对慢病毒为载体的基因/细胞治疗的产品和病人样本监测RCL情况。FDA Recommendations建议的检测方法包括：1)检测RCL相关蛋白；2)实时定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)方法检测样本中RCL特异性DNA序列。标准的检测RCL的细胞共培养方法周期较长，约需6周或者更长时间才能获得实验结果。
TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术。其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。FDA现允许用TaqMan探针即水解探针(hydrolysis probes)qPCR方法快速检测产品RCL情况。然而，目前的检测RCL引物和探针存在扩增效率不高，特异性不好的问题。本领域迫切需要开发新的实时荧光定量PCR检测RCL的试剂和方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种实时荧光定量PCR检测RCL的试剂和方法。
更具体地，本发明的目的在于提供TaqMan实时荧光定量PCR检测具有复制能力的慢病毒(RCL)特异性VSV-G基因拷贝数的试剂和方法
在本发明的第一方面，提供了一种试剂组合，其特征在于，所述的试剂组合包括：
(i)特异性扩增VSV-G基因的第一引物对和第一探针，
其中，所述的第一引物对包括：第一上游引物：序列如SEQ ID NO:1所示，和第一下游引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
并且，所述的第一探针如SEQ ID NO.:3所示；和/或
(ii)特异性扩增VSV-G基因的第二引物对和第二探针，
其中，所述的第二引物对包括：第二上游引物：序列如SEQ ID NO:4所示，和第二下游引物：序列如SEQ ID NO:5所示；
并且，所述的第二探针如SEQ ID NO.:6所示。
在另一优选例中，所述的试剂组合还包含：
(iii)特异性扩增内参基因的第三引物对和第三探针，
其中，所述的第三引物对包括：第三上游引物：序列如SEQ ID NO:27所示，和第三下游引物：序列如SEQ ID NO:28所示；
并且，所述的第三探针如SEQ ID NO.:29所示。
在另一优选例中，所述的探针偶联有或带有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选例中，所述试剂组合用于检测具有复制能力的慢病毒(ReplicationCompetent Lentivirus，RCL)。
在另一优选例中，所述的慢病毒以疱疹性口腔炎病毒G蛋白(Vesicularstomatitis virus-G protein，VSV-G)为包膜蛋白。
在另一优选例中，所述试剂组合检测RCL的扩增效率≥90％，较佳地≥92％，更佳地≥95％。
在本发明的第二方面，提供了一种PCR扩增体系，所述的扩增体系包括：用于扩增的缓冲体系以及位于所述体系中的本发明第一方面所述的引物组合。
在本发明的第三方面，提供了一种检测试剂，所述的检测试剂中含有本发明第一方面所述的引物组合。
在另一优选例中，所述的检测试剂用于检测RCL。
在本发明的第四方面，提供了一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒中包含一个或多个容器，和位于所述容器中的如本发明第一方面所述的引物组合。
在另一优选例中，所述的检测试剂盒用于检测RCL。
在另一优选例中，所述的第一引物对和第一探针位于相同或不同容器。
在另一优选例中，所述的第二引物对和第二探针位于相同或不同容器。
在另一优选例中，所述的第三引物对和第三探针位于相同或不同容器。
在另一优选例中，所述的第三引物对和第三探针与第一引物对和第一探针位于相同容器。
在另一优选例中，所述的第三引物对和第三探针与第二引物对和第二探针位于相同容器。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有用于扩增的试剂。
在另一优选例中，所述用于扩增的试剂包括缓冲剂、dNTP、和扩增酶。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括使用说明书。
在本发明的第五方面，提供了一种检测RCL的检测方法，所述的方法包括：
(a)提供一待测DNA样品；
(b)利用本发明第一方面所述的试剂组合，对待测DNA样品进行实时荧光定量PCR；和
(c)计算待测DNA样品的Cq值和VSV-G基因拷贝数，从而判断样品中是否含有RCL。
在另一优选例中，所述RCL的包膜蛋白为疱疹性口腔炎病毒G蛋白(Vesicularstomatitis virus-G protein，VSV-G)。
在另一优选例中，所述的方法为TaqMan探针法。
在另一优选例中，在步骤(b)中，在同一扩增体系中，利用特异性扩增VSV-G基因的第一引物对和第一探针，以及特异性扩增内参基因的第三引物对和第三探针，对待测DNA样品进行实时荧光定量PCR。
在另一优选例中，在步骤(b)中，在同一扩增体系中，利用特异性扩增VSV-G基因的第二引物对和第二探针，以及特异性扩增内参基因的第三引物对和第三探针，对待测DNA样品进行实时荧光定量PCR
在另一优选例中，在步骤(b)中，包含阳性对照和阴性对照。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性方法。
在另一优选例中，所述的方法是体外方法。
在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的待测DNA样品提取自选自下组的样本：(i)有复制能力的慢病毒，(ii)以慢病毒为载体的生物制品、或(iii)人或动物(如啮齿类动物、灵长类动物)的血液，骨髓液，组织器官。
在另一优选例中，(iii)中所述的人或动物接受过以慢病毒为载体的生物制品。
在另一优选例中，所述的慢病毒为有复制能力的慢病毒。
在另一优选例中，所述的以慢病毒为载体的生物制品选自下组：
原始细胞库(Master Cell Bank,MCB)、工作细胞库(Working Cell Bank,WCB)、终末包装细胞(End of Produciton(EOP)Cells)、病毒上清液(Vector-ContainingSupernatant)、病毒感染细胞(Ex Vivo Transduced Cells)、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种实时荧光定量PCR检测RCL的引物和探针组合，以及利用该引物和探针进行检测的方法，本发明还提供了包含该引物和探针的试剂盒。实验表明，利用本发明的引物和探针组合检测RCL，扩增效率高、特异性好，适用于临床和实验室检测。在此基础上完成本发明。
具体地，本发明的引物和探针组合可以用于产品生产过程中可能产生的RCL检测及临床病人外周血样本RCL的监测。本发明还以人基因组DNA为背景，建立和验证了用Taqman探针法，以本发明的引物和探针组合检测样本VSV-G序列的方法。
水疱性口炎病毒的促融合包膜G糖蛋白(Vesicular stomatitis virus-Gprotein，VSV-G)是一种糖基化的膜蛋白，在病毒进入宿主细胞的两个初始步骤中起决定作用：病毒附着到宿主细胞表面和病毒诱导的pH依赖性内体膜融合。VSV-G是一种宿主范围很广泛的包膜蛋白，能够感染大多数人类细胞，以及和人类相距较远的物种如斑马鱼和果蝇，目前普谝运用在慢病毒载体中，可扩大的慢病毒载体侵染谱系。VSV-G在基因和细胞治疗中起重要作用。
TaqMan qPCR
TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术。其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。
在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中
Figure BDA0001570158270000041
包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter，R)如FAM、VIC等；3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
如本文所用，术语“探针”是指基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。
试剂组合
本发明涉及一种检测RCL的试剂组合，包括：
(i)序列如SEQ ID NO:1所示的上游引物，序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物和序列如SEQ ID NO.:3所示的探针(即为下文所述的VSV-G9试剂组合)；
或者，
(ii)序列如SEQ ID NO:4所示的上游引物，序列如SEQ ID NO:5所示的下游引物和序列如SEQ ID NO.:6所示的探针(即为下文所述的VSV-G8试剂组合)。
本发明的试剂组合用于Taqman探针法检测RCL，扩增效率高、特异性好。
检测方法和检测试剂盒
本发明涉及一种检测RCL的检测方法，所述的方法包括：利用本发明第一方面所述的试剂组合，对待测DNA样品进行实时荧光定量PCR；并计算待测DNA样品的Cq值和VSV-G基因拷贝数，从而判断样品中是否含有RCL。
本发明的方法可以检测选自下组的样本：(i)有复制能力的慢病毒，(ii)以慢病毒为载体的生物制品、或(iii)人或动物(如啮齿类动物、灵长类动物)的血液，骨髓液，组织器官。
本发明的主要优点包括：
(a)适用于以VSV-G为包膜的慢病毒载体基因/细胞治疗的RCL检测
(b)特异性高与基因组背景无特异性反应
(c)提供了可以同时测定内参基因的双重PCR方法
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用材料
1.主要试剂
Figure BDA0001570158270000061
Figure BDA0001570158270000071
2.引物和探针信息
VSV-G1至VSV-G4引物由金斯瑞合成，探针由英潍捷基合成(VSV-G2未放入)
VSV-G5和VSV-G6引物和探针均由金斯瑞合成
VSV-G7至VSV-G10引物和探针由英潍捷基合成
VSV-G1 5’to 3’序列 SEQ ID NO.
正向引物 CGAGATGGCTGATAAGGATCTC SEQ ID NO.:7
反向引物 ATTGATTATGGTGAAAGCAGGAC SEQ ID NO.:8
探针 6FAM-TGCTGCAGCCAGATTCCCTGAATG-TAMARA SEQ ID NO.:9
VSV-G1引物和探针参考Escarpe P,Zayek N,Chin P,Borellini F,Zufferey R,Veres G,Kiermer V.大规模基于HIV载体的制品中重组慢病毒重复组分检测的敏感试验的发展(Development of a sensitive assay for detection of replication-competentrecombinant lentivirus in large-scale HIV-based vector preparations).MolTher.2003Aug；8(2):332-41设计。
Figure BDA0001570158270000072
Figure BDA0001570158270000081
RPP30和TERT引物由金斯瑞合成，RPP30和TERT探针由英潍捷基合成
Figure BDA0001570158270000082
Figure BDA0001570158270000091
4.C8166细胞系
C8166细胞系为人白血病细胞，易于慢病毒感染和进入。在细胞共培养方法检测RCL中作为慢病毒的易感宿主，利于低水平的RCL进入复制扩增。
5.标准品(Standard)
用标准品制备标准曲线用来建立定量循环值(Quantification cycle，Cq)和拷贝数之间的定量关系。在本方案中用含VSV-G序列的CBMG-PRM1质粒倍比稀释并加入100ng人类基因组DNA为背景作为标准品。
6.阴性质控对照品(Quality control-Negative Control，NC)
阴性质控对照品包括：无模板对照(No template control，NTC)，在qPCR反应体系中仅仅缺少模板，用以检测有无二聚体和试剂有无污染。背景阴性对照(Backgroundnegative control，BNC),在qPCR反应体系中以C8166基因组DNA(Genomic DNA，gDNA)或未转染慢病毒的人T细胞(Human non transduced Tcells，hNT)gDNA为模板，用以检测gDNA对qPCR扩增的影响，同时也可监测试剂和加样过程有无污染。
7.阳性质控对照品(Quality control-Positive Control，PC)
阳性质控对照品为同一浓度(本实验设定为100ng)的背景gDNA中含有不同拷贝数的CBMG-PRM1质粒。阳性质控对照品用来评估实验的性能。
通用方法
TaqMan qPCR方法筛选VSV-G引物/探针
筛选标准：1)相关系数(correlation coefficient，R2)≥0.99；2)扩增效率(Efficiency):90％-110％；3)NTC和BNC无扩增。
qPCR检测实验过程
1.基因组DNA提取、质量控制与保存
(1)2×106cel ls/管细胞，步骤参考QIAamp DNA blood midi kits操作手册提取基因组DNA；
(2)通过NanoDrop 2000检测DNA浓度、OD260/280数值。将待测样本与用来做基因组背景的人细胞(包括C8166细胞和hNT)基因组DNA浓度均调节至25ng/μl，若DNA浓度偏高，加无酶H2O进行稀释，若DNA浓度偏低，用真空离心浓缩仪进行浓缩。将基因组DNA原液和25ng/μl于-80℃冻存。
2.质粒稀释
(1)按下公式计算每微升原液中所含质粒的拷贝数：(6.02×1014)×(ng/μl))/(DNA length×660)＝copies/μl；
(2)将质粒稀释成1010copies/μl储存液；
(3)将1010copies/μl储存液按11μl/tube分装，-80℃冻存，避免反复冻融。
3.阳性质控对照品
在本方法验证中需要以下阳性质控对照品:
Figure BDA0001570158270000101
以上阳性质控对照品一批次稀释后按15μl/tube/assay分装，-80℃冰箱，避免反复冻融。
4.标准品的倍比稀释
从-80℃冰箱取出以下试剂，融化后放置4℃待用：1010copies/μl CBMG-PRM1质粒储存液、1010copies/μlpUC57-TERT质粒储存液、1010copies/μlpUC57-RPP30质粒储存液、T细胞gDNA(C8166gDNA或hNTgDNA)、阳性质控对照品；
4.1 CBMG-PRM1质粒+背景基因组DNA标准品(单质粒标准品)的倍比稀释
(1)按下表所示方法，在1.5ml离心管中用稀释液依次稀释，用微型离心机离心，冰上操作，4℃待用，得到不同浓度/拷贝数的CBMG-PRM1质粒溶液：
Figure BDA0001570158270000111
注：单纯CBMG-PRM1质粒做标准品，无gDNA做背景对照时，第(1)即可。
(2)取上述不同浓度的质粒溶液，按下表所示方法，在1.5ml离心管中配制CBMG-PRM1质粒+100ng gDNA标准品溶液，用微型离心机离心，冰上操作，4℃待用，得到不同浓度的标准品溶液：
Figure BDA0001570158270000112
Figure BDA0001570158270000121
4.2双质粒标准品(含VSV-G质粒和内参基因质粒，无背景gDNA)的倍比稀释
按下表所示方法，在1.5ml离心管中用稀释液依次稀释，用微型离心机离心，冰上操作，4℃待用，得到不同浓度/拷贝数的双质粒标准品溶液：
Figure BDA0001570158270000122
5.配置反应体系(Mix)
5.1CBMG-PRM1质粒+100ng gDNA反应体系(含标准品和阳性质控对照)(Mix-VSV-G)的配置
溶液 1× (n+n×10％)×
2×Taqman基因分型Master Mix 10μl μl
20×VSV-G引物/探针Mix 1μl μl
模板(1μl CBMG-PRM1质粒+4μl gDNA) 5μl ---
H<sub>2</sub>O 4μl μl
总体积 20μl μl
n＝assay×3
模板上样量：5μl/孔
将上述溶液加入到1个1.5ml离心管中，冰上操作，颠倒混匀，微型离心机离心，4℃待用。
5.2样本VSV-G目的基因检测反应体系(Mix-Sample)的配置
溶液 1× (n+n×10％)×
2×Taqman基因分型Master Mix 10μl μl
20×VSV-G引物/探针mix 1μl μl
模板(来自样本的gDNA) 8μl ---
H<sub>2</sub>O 1μl μl
总体积 20μl μl
n＝assay×3
模板上样量：8μl/孔，即200ng/孔
将上述溶液加入到1个1.5ml离心管中，冰上操作，颠倒混匀，微型离心机离心，4℃待用。
5.3内参基因标准曲线检测反应体系(Mix-Reference-Std)的配置
溶液 1× (n+n×10％)×
2×Taqman基因分型Master Mix 10μl μl
20×RPP30or TERT引物/探针mix 1μl μl
模板(1μl pUC57-RPP30or pUC57-TERT质粒) 1μl ---
H<sub>2</sub>O 8μl μl
总体积 20μl μl
n＝assay×3
模板上样量：1μl/孔
将上述溶液加入到1个1.5ml离心管中，冰上操作，颠倒混匀，微型离心机离心，4℃待用。
5.4内参基因样本检测反应体系(Mix-Reference)的配置
溶液 1× (n+n×10％)×
2×Taqman基因分型Master Mix 10μl μl
20×RPP30or TERT引物/探针mix 1μl μl
模板(1μl pUC57-RPP30or pUC57-TERT质粒) 1μl ---
H<sub>2</sub>O 8μl μl
总体积 20μl μl
n＝assay×3
模板上样量：1μl/孔，即25ng/孔
将上述溶液加入到1个1.5ml离心管中，冰上操作，颠倒混匀，微型离心机离心，4℃待用。
5.5双质粒标准品双重qPCR反应体系的配置
溶液 1× (n+n×10％)×
2×Taqman基因分型Master Mix 10μl μl
20×VSV-G引物/探针Mix 1μl μl
20×Reference引物/探针Mix 1μl μl
模板(CBMG-PRA3质粒+pUC57-RPP30质粒) 1μl ---
H<sub>2</sub>O 7μl μl
总体积 20μl μl
n＝assay×3
模板上样量：1μl/孔
将上述溶液加入到1个1.5ml离心管中，冰上操作，颠倒混匀，微型离心机离心，4℃待用。
5.6单粒标准品双重qPCR反应体系的配置
Figure BDA0001570158270000141
Figure BDA0001570158270000151
模板上样量：1μl/孔
将上述溶液加入到1个1.5ml离心管中，冰上操作，颠倒混匀，微型离心机离心，4℃待用。
6.qPCR检测
6.1单重qPCR检测
(1)按下表分布将上述配置的反应体系“Mix-VSV-G”吸取15μl，“Mix-Sample”吸取12μl添加到96孔PCR反应板中，“Mix-Reference-Std”“Mix-Reference”吸取19μl添加到96孔PCR反应板中；
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A NTC NTC NTC
B BNC BNC BNC
C Std1 Std1 Std1 PC PC PC 样本 样本 样本
D Std2 Std2 Std2
E Std3 Std3 Std3
F Std4 Std4 Std4
G Std5 Std5 Std5
H Std6 Std6 Std6
Std:CBMG-PRM1质粒+100ng gDNA标准品或pUC57-RPP30 or pUC57-TERT质粒；
NTC:无模板对照(No Template Control；)
BNC:背景阴性对照(Background Negative Control；)
PC:阳性对照(Positive Control，___copies CBMG-PRM1质粒+100nggDNA)
(2)将标准品：std6、std5、std4、std3、std2、std1和NC或PC依次加入对应的孔中，检测VSV-G标曲为5μl/孔；检测“待测样本”VSV-G依次加入对应的孔中，8μl/孔；检测内参基因标曲和“待测样本”均为1μl/孔。
(3)用密封膜将96孔PCR反应板封闭，然后200×g，离心2分钟；
(4)板放入Quant Studio Dx Real-time PCR，Taqman通用PCR Master Mix设置反应条件如下：
标准条件:
UNG温育:2min at 50℃
聚合酶激活:10min at 95℃
PCR:40 cycles
变性:15 sec at 95℃
退火/延伸:60 sec at 60℃。
6.2双质粒标准品双重qPCR检测
(1)按下表分布将上述配置的双重PCR反应体系“Std”吸取19μl添加到96孔PCR反应板中；
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A NTC NTC NTC
B Std0 Std0 Std0
C Std1 Std1 Std1 PC PC PC 样本 样本 样本
D Std2 Std2 Std2
E Std3 Std3 Std3
F Std4 Std4 Std4
G Std5 Std5 Std5
H Std6 Std6 Std6
Std:含CBMG-PRM1质粒和pUC57-RPP30质粒标准品；
NTC:无模板对照(no template control)；
(2)将标准品std6、std5、std4、std3、std2、std1、std0和空白对照B依次加入对应的孔中，1μl/孔；
(3)用密封膜将96孔PCR反应板封闭，然后200×g，离心2分钟；
(4)板放入Quant Studio Dx Real-time PCR，Taqman genotyping Master Mix设置反应条件如下：
标准条件:
聚合酶激活:10min at 95℃
PCR:40循环
变性:15sec at 95℃
退火/延伸:60sec at 60℃。
7.实验数据质控参数
(1)扩增效率90％～110％；
(2)标准品标准曲线R2≥0.99；
(3)阴性对照包括NTC和BNC：3复孔中至少2复孔无扩增即Cq>40，如果有1复孔有扩增需Cq>mean CqLOD。
以上3点如果有1点不符合要求，需要重做实验。
8.数据处理与分析
(1)反应结束后，软件输出标准曲线，标准曲线至少由5个点构成；
9.RCL检测结果判定
根据标准曲线，软件自动输出每个样品的Cq值及100ng基因组的VSV-G基因拷贝数；
为了便于判定RCL结果的阳性和阴性，在实验中以LOD的拷贝数+100ngC8166gDNA做为阳性质控对照品(PC)，以其每次实验的平均Cq值作为阳性阈值。
Figure BDA0001570158270000171
Figure BDA0001570158270000181
实施例1
筛选内参基因引物/探针对
用293T gDNA倍比稀释做标准曲线，测试RPP30和TERT两对引物/探针对。
结果如表1所示，RPP30扩增效率为99.24％，TERT扩增效率为83.22％。
表1 2对内参基因引物/探针对浓度及结果参数信息
引物/探针名称 引物(μM) 探针(μM) 阈值 扩增效率 R<sup>2</sup>
TERT 0.4 0.2 0.04 83.22％ 0.997
RPP30 0.4 0.2 0.05 99.24％ 0.985
再次用pUC57-RPP30质粒倍比稀释做标准曲线检测RPP30引物/探针的效能。结果显示，RPP30引物/探针的扩增效率为93.77％，R2为0.995。后续实验选择RPP30的引物/探针对进行。
实施例2
筛选VSV-G基因检测用探针/引物对
用293T gDNA倍比稀释做标准曲线，测试VSV-G1，VSV-G3，VSV-G4，VSV-G5，VSV-G6，VSV-G7，VSV-G8，VSV-G9引物/探针对。
结果如表2所示，从扩增效率来看，VSV-G4，VSV-G6，VSV-G8，VSV-G9的扩增效率在90％-110％之间。但VSV-G6的背景较高，单纯以293T gDNA为背景模板，Cq值为38.6；而VSV-G4的敏感度较低，VSV-G模板为10copies时Cq值为39.2，106copies时Cq值为21.8。VSV-G1的敏感度也比较低，VSV-G模板为10copies时Cq值为38.3。
表2各VSV-G引物/探针对浓度及以293T gDNA为背景对照的结果参数信息
Figure BDA0001570158270000182
Figure BDA0001570158270000191
*ND指Not detectable，即未检测到
分别改用CAR-NCgDNA和C8166gDNA为背景模板，再次测试VSV-G6，VSV-G8，VSV-G9引物/探针的扩增效率、R2和背景情况。
以CAR-NCgDNA为背景对照的结果如表3所示。以C8166gDNA为背景的结果如表4所示。结果显示，VSV-G6引物/探针和293T gDNA有非特异性的结合与扩增。VSV-G8和VSV-G9引物/探针在三种基因组背景：293T、C8166、NC(non-transduced T cells)下，特异性都很好，扩增效率也在90％～110％。在后续的双探针/引物测试中，用VSV-G8和VSV-G9引物/探针进行测试。
表3 VSV-G6，VSV-G8，VSV-G9引物/探针对浓度及以CAR-NCgDNA为背景对照的结果参数
Figure BDA0001570158270000192
表4 VSV-G6，VSV-G8，VSV-G9引物/探针对浓度及以C8166gDNA为背景对照的结果参数
Figure BDA0001570158270000193
Figure BDA0001570158270000201
实施例3
双质粒法测试VSV-G引物/探针和内参基因引物/探针在同一反应孔中的扩增效率
将VSV-G质粒(CBMG-PRM1)和内参基因质粒(pUC57-RPP30)做10倍倍比稀释，放在同一孔中做为模板(template)建立标准曲线,做双重PCR检测两对探针/引物对是否有干扰。本实施例测试了VSV-G8和内参RPP30组合和VSV-G9和内参RPP30组合。
结果如表5所示，在VSV-G8/RPP30引物探针组合的双重PCR反应中，VSV-G8的扩增和RPP30的扩增都没有受到明显影响。在VSV-G9/RPP30引物探针组合的双重PCR反应中，VSV-G9的扩增和RPP30扩增也都没有受到明显影响。
双重PCR检测两对探针/引物对结果参数如下：
Figure BDA0001570158270000202
实施例4
单质粒+高质量背景下测试双引物/探针PCR反应
单质粒做标曲，高质量背景(C8166和NT，1000ng)双重PCR检测VSV-G基因拷贝数检测，测试VSV-G引物/探针和内参基因引物/探针在同一反应孔中的扩增效率和高质量背景对双重PCR的影响。
结果如表6所示，VSV-G8和VSV-G9在高质量基因组背景下扩增效率都比较好，VSV-G9的扩增效率更高一些。
表6以1000ng C8166和NT gDNA为背景，双重PCR检测两对探针/引物对结果
Figure BDA0001570158270000203
Figure BDA0001570158270000211
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海赛比曼生物科技有限公司
无锡赛比曼生物科技有限公司
<120> 一种实时荧光定量PCR检测RCL的试剂和方法
<130> P2017-2074
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
gaaagggaac tgtgggatga ct 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
gaactggtcc tcagaactcc att 23
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
catatgaaga cgtggaaatt ggaccc 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
ggatgtgtca tgcttccaaa tgg 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
gtgaaggatc ggatggaatg tgtta 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
accagcggaa atcacaagta gtg 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
cgagatggct gataaggatc tc 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
attgattatg gtgaaagcag gac 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
tgctgcagcc agattccctg aatg 24
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
gacctcagtg gatgtaag 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 11
ctggagagat tggaagac 18
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 12
ctaattcagg acgtt 15
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 13
gcaaggaaag cattgaac 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 14
ctggacaatc actgcttc 18
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 15
catccgtcac agttgc 16
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 16
ccagaagggt caagtatc 18
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 17
cagagggaat aatccaaga 19
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 18
tgctccatct cagacctcag t 21
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 19
gcaaggaaag cattgaac 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 20
ccgtcacagt tgcatatc 18
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 21
aacttggctg aatccaggct t 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 22
agtcagactc ccatcaggtg t 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 23
ttgacccttc tgggcattca g 21
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 24
ccttatcagc catctcgaac cag 23
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 25
gtggtagtgc atagacttta 20
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 26
gaggacattt gaggagtg 18
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 27
catccgtcac agttgc 16
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 28
ggatcttgta gatgttgg 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 29
tcccagagag gtttctac 18
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 30
ctgttcacct agagtcgcca ag 22

Claims (17)

1.一种试剂组，其特征在于，所述的试剂组包括：
(i) 特异性扩增VSV-G基因的第一引物对和第一探针，
其中，所述的第一引物对包括：
第一上游引物：5’-GAAAGGGAACTGTGGGATGACT-3’，序列如SEQ ID NO: 1所示，和
第一下游引物：5’-GAACTGGTCCTCAGAACTCCATT-3’，序列如SEQ ID NO: 2所示；
并且，所述的第一探针为：
5’-6-FAM-CATATGAAGACGTGGAAATTGGACCC-MGB-3’，序列如SEQ ID NO: 3所示；和/或
(ii) 特异性扩增VSV-G基因的第二引物对和第二探针，
其中，所述的第二引物对包括：
第二上游引物：5’-GGATGTGTCATGCTTCCAAATGG-3’，序列如SEQ ID NO: 4所示，和
第二下游引物：5’-GTGAAGGATCGGATGGAATGTGTTA-3’，序列如SEQ ID NO: 5所示；
并且，所述的第二探针为：
5’-6-FAM-ACCAGCGGAAATCACAAGTAGTG-MGB-3’，序列如SEQ ID NO: 6所示；
所述试剂组用于检测具有复制能力的慢病毒RCL，并且所述的慢病毒以疱疹性口腔炎病毒G蛋白(VSV-G)为包膜蛋白。
2.如权利要求1所述的试剂组，其特征在于，所述的试剂组还包含：
(iii)特异性扩增内参基因的第三引物对和第三探针，
其中，所述的第三引物对包括：
第三上游引物：序列如SEQ ID NO: 27所示，和
第三下游引物：序列如SEQ ID NO: 28所示；
并且，所述的第三探针序列如SEQ ID NO: 29所示。
3.如权利要求1所述的试剂组，其特征在于，所述的试剂组还包含：
(iii)特异性扩增内参基因的第三引物对和第三探针，
其中，所述的第三引物对包括：
第三上游引物：序列如SEQ ID NO: 25所示，和
第三下游引物：序列如SEQ ID NO: 26所示；
并且，所述的第三探针序列如SEQ ID NO: 27所示。
4.如权利要求1所述的试剂组，其特征在于，所述试剂组包括所述的(i) 特异性扩增VSV-G基因的第一引物对和第一探针；和所述的(ii) 特异性扩增VSV-G基因的第二引物对和第二探针。
5.如权利要求2所述的试剂组，其特征在于，所述试剂组包括所述的(i) 特异性扩增VSV-G基因的第一引物对和第一探针；所述(ii) 特异性扩增VSV-G基因的第二引物对和第二探针，和所述的(iii) 特异性扩增内参基因的第三引物对和第三探针。
6.如权利要求1所述的试剂组，其特征在于，所述试剂组检测RCL的扩增效率≥90%。
7.如权利要求1所述的试剂组，其特征在于，所述试剂组检测RCL的扩增效率≥92%。
8.如权利要求1所述的试剂组，其特征在于，所述试剂组检测RCL的扩增效率≥95%。
9.一种PCR扩增体系，其特征在于，所述的扩增体系包括：用于扩增的缓冲体系以及位于所述体系中的权利要求1所述的试剂组。
10.一种检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂中含有权利要求1所述的试剂组。
11.一种检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒中包含一个或多个容器，和位于所述容器中的如权利要求1所述的试剂组。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂组还包含：
(iii)特异性扩增内参基因的第三引物对和第三探针，
其中，所述的第三引物对包括：
第三上游引物：序列如SEQ ID NO: 27所示，和
第三下游引物：序列如SEQ ID NO: 28所示；
并且，所述的第三探针序列如SEQ ID NO: 29所示，
其中，所述的第三引物对和第三探针与第一引物对和第一探针位于相同容器。
13.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂组还包含：
(iii)特异性扩增内参基因的第三引物对和第三探针，
其中，所述的第三引物对包括：
第三上游引物：序列如SEQ ID NO: 27所示，和
第三下游引物：序列如SEQ ID NO: 28所示；
并且，所述的第三探针序列如SEQ ID NO: 29所示，
其中，所述的第三引物对和第三探针与第二引物对和第二探针位于相同容器。
14.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有用于扩增的试剂。
15.一种检测RCL的检测方法，其特征在于，所述的方法包括：
(a) 提供一待测DNA样品；
(b) 利用权利要求1所述的试剂组，对待测DNA样品进行实时荧光定量PCR；和
(c) 计算待测DNA样品的Cq值和VSV-G基因拷贝数，从而判断样品中是否含有RCL。
16.如权利要求15所述的检测方法，其特征在于，所述的方法为TaqMan探针法。
17.如权利要求15所述的检测方法，其特征在于，在步骤(b)中，在同一扩增体系中，利用特异性扩增VSV-G基因的第一引物对和第一探针，以及特异性扩增内参基因的第三引物对和第三探针，对待测DNA样品进行实时荧光定量PCR；
其中，所述的第三引物对包括：
第三上游引物：序列如SEQ ID NO: 27所示，和
第三下游引物：序列如SEQ ID NO: 28所示；
并且，所述的第三探针序列如SEQ ID NO: 29所示。
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