CN111910015A - 一种检测复制型慢病毒的探针、引物对、荧光定量pcr试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测复制型慢病毒的探针，所述探针包括一段单链核苷酸片段，所述单链核苷酸片段的5’端标记有荧光报告基团，所述核苷酸片段的3’端标记有荧光淬灭基团，所述单链核苷酸片段包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。所述探针具有特异性高和灵敏度高的优点，该探针可以用于快速、定量分析VSV‑G基因的拷贝数，并用于定量分析复制型慢病毒的拷贝数；特别是经VSV‑G包膜的慢病毒基因介导的CAR‑T中的复制型慢病毒拷贝数。本发明还提供了一种检测复制型慢病毒的引物对、荧光定量PCR试剂盒及方法。

Description

一种检测复制型慢病毒的探针、引物对、荧光定量PCR试剂盒 及方法
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种检测慢病毒的探针、引物对、荧光定量PCR试剂盒及方法。
背景技术
免疫细胞治疗是现有科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法，被认为是二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最有发展前途的一种治疗手段。与传统治疗手段相比，免疫细胞治疗技术在治疗恶性肿瘤方面，具有特异性强、几乎无毒副作用的巨大优势，它弥补了传统的手术、放疗和化疗的弊端，成为肿瘤治疗的第四种手段。其中，嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor–Modified T Cells，CAR-T)技术作为当前最新的免疫细胞治疗技术之一，受到广泛的关注和研究。
目前，凭借慢病毒载体(lentiviral vector)的整合位点更安全，转基因负荷量更大和基因毒性更小等优势，大部分CAR-T的制备均采用慢病毒转染方法进行基因转导以使其表达嵌合抗原受体(CAR)；并且，现在应用最广泛的慢病毒异源包膜蛋白之一为水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)。由于制备过程中需要使用到慢病毒感染T细胞，而生成CAR-T，因此CAR-T的质量控制非常严格。虽然慢病毒包装的进展已经历经数代，安全性有了极大的提高，但在CAR-T中仍可能存在复制型慢病毒(RCL)，从而严重影响CAR-T的安全质量。因此，如何快速、灵敏地定量检测经慢病毒转染方法基因介导的CAR-T中的复制型慢病毒，对于CAR-T的质量控制和后续的CAR-T产业化应用均具有重要作用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种检测复制型慢病毒的探针、引物对、荧光定量PCR试剂盒及方法。其中，所述探针具有特异性高和灵敏度高的优点，该探针可以用于快速、定量分析VSV-G基因的拷贝数，并基于VSV-G基因的拷贝数用于定量分析复制型慢病毒的拷贝数；该探针可以用于检测经VSV-G包膜的慢病毒基因介导的CAR-T中的复制型慢病毒拷贝数。
第一方面，本发明提供了一种检测复制型慢病毒的探针，所述探针包括一段单链核苷酸片段，所述单链核苷酸片段的5’端标记有荧光报告基团，所述核苷酸片段的3’端标记有荧光淬灭基团，所述单链核苷酸片段包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明中，所述探针是用于特异性检测VSV-G基因序列的荧光探针。所述VSV-G为目前应用最广泛的慢病毒异源包膜蛋白之一，其在慢病毒用于其感染细胞中起着重要作用；本发明所述探针通过VSV-G的检测，可以用于复制型慢病毒的检测。可选地，所述VSV-G基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
进一步地，可选地，所述VSV-G基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明中，所述探针两端分别标记的荧光报告基团和荧光淬灭基团在相互靠近时，被激发后的荧光报告基团所发射的荧光信号会被荧光淬灭基团吸收。但当VSV-G的目的基因存在或扩增时，所述荧光报告基团可以与VSV-G的目的基因特异性识别，所述荧光报告基团与所述荧光淬灭基团分离后，荧光报告基团发射荧光信号，从而通过检测所述荧光信号可以达到检测目的基因的拷贝数的目的。其中，目的序列每复制一次，就有一个探针与之对应，所以荧光信号累积与目的基因扩增产物完全同步。
可选地，所述探针可以但不限于用于特异性检测多种对象中的VSV-G基因拷贝数，所述对象包括质粒、载体、病毒、细菌的基因组或细胞的基因组。例如，所述探针用于检测含有VSV-G基因的重组慢病毒或CAR-T细胞中的VSV-G基因序列。
可选地，所述荧光报告基团包括羧基荧光素(FAM)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)和六氯-6-甲基荧光素(HEX)中的一种或多种；所述荧光淬灭基团包括羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、4-[(2-氯-4-硝基-苯基)-偶氮基]-苯胺(Eclipse)和黑洞淬灭剂(black hole quencher，BHQ)中的一种或多种。其中，所述羧基荧光素(FAM)包括5-羧基荧光素(5-FAM)或6-羧基荧光素(6-FAM)。所述黑洞淬灭剂(BHQ)包括黑洞淬灭剂1(BHQ-1)、黑洞淬灭剂2(BHQ-2)或黑洞淬灭剂(BHQ-3)。
可选地，所述荧光报告基团还可以但不限于包括四氯-6-羧基荧光素(TET)、花青素染料(Cyanines dyes)、羧基-X-罗丹明(carboxy-X-rhodamine，ROX)、德克萨斯红染料(Texas Red)、异硫氰酸荧光素(FITC)和吖啶橙(Acridine orange)中的一种或多种。可选地，所述花青素染料可以但不包括Cy3、Cy5或Cy5.5等多种不同发射波长的荧光染料。所述羧基-X-罗丹明包括5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)或6-羧基-X-罗丹明(6-ROX)。
可选地，所述荧光淬灭基团还可以但不限于包括4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)或4-(N,N-二甲基氨基)偶氮苯-4’-磺酸氯(DABSYL)。
本发明所述探针通过选择匹配的荧光报告基团和荧光淬灭基团，或是背景荧光低的荧光报告基团可以一定程度的增加检测的灵敏度。
目前市场上VSV-G检测的灵敏度只能达到200copy，不足以检测到微量复制型慢病毒的产生，无法满足CAR-T产品的早期快速放行条件，而本发明所述探针的灵敏度很高，能够满足CAR-T产品快速检测标准。
第二方面，本发明提供了一种检测复制型慢病毒的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述反向引物包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
本发明中，所述单链核苷酸片段包括多聚脱氧核糖核苷酸、多聚核糖核苷酸和其他类型的多核苷酸中的一种或几种；例如其他类型的多核苷酸中的嘌呤或嘧啶碱基经过修饰后的嘧啶或嘌呤碱基。本发明所述的单链核苷酸片段来源为本领域常规来源，例如，所述单链核苷酸片段的来源可以包括人工合成方法或从天然存在的基因组中提取获得所述的单链核苷酸片段。其中所述单链核苷酸片段的人工合成方法包括：磷酸三酯法、磷酸二酯法、二乙基磷酸酰胺法和固相载体法中的一种或几种。
本发明中，所述引物对的反应效率高，可以快速、特异性检测VSV-G基因，灵敏度高；在PCR扩增反应时，可以不断扩增所述VSV-G基因，所述扩增的VSV-G基因的分子量大小为162bp。本发明所述引物对尤其适用于慢病毒包膜蛋白的VSV-G基因序列片段的特异性检测。
第三方面，本发明还提供了一种荧光定量PCR试剂盒，包括如本发明第一方面所述的探针和/或如本发明第二方面所述的引物对。
具体地，所述荧光定量PCR试剂盒可以但不限于包括如本发明第一方面所述的探针。或所述荧光定量PCR试剂盒可以但不限于包括如本发明第二方面所述的引物对。或所述荧光定量PCR试剂盒可以但不限于包括本发明第一方面所述的探针和如本发明第二方面所述的引物对。
可选地，当所述荧光定量PCR试剂盒包括如本发明第一方面所述的探针时，所述荧光定量PCR试剂盒还包括其他用于VSV-G基因扩增的PCR引物对。
可选地，当所述荧光定量PCR试剂盒包括如本发明第二方面所述的引物对时，所述荧光定量PCR试剂盒还可以包括其他探针。
可选地，所述荧光定量PCR试剂盒还包括反应缓冲液、阳性对照品和阴性对照品。
可选地，所述反应缓冲液还可以但不限于包括PCR缓冲液。所述反应缓冲液中可以但不限于包含有PCR扩增反应必要的盐离子、酶或稳定的pH缓冲体系中的一种或多种。所述反应缓冲液可以但不限于为现有反应缓冲液。例如，所述反应缓冲液中含有dNTP、氯化镁和DNA聚合酶等。可选地，所述dNTP可以为本领域常规的dNTP，包括dATP、dGTP、dTTP和dCTP。所述DNA聚合酶包括热稳定DNA聚合酶。
可选地，所述阳性对照品中含有所述VSV-G基因。所述VSV-G基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
可选地，所述阴性对照品可以但不限于包括DEPC水。所述DEPC水是用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水，无色液体；不含杂质RNA、DNA和蛋白质。
第四方面，本发明还提供了一种检测复制型慢病毒的方法，包括：
提取待测样本的DNA，所述待测样本包括经含有VSV-G基因的第一重组基因传递载体转染的靶细胞，对所述待测样本的DNA进行定量PCR扩增反应；所述定量PCR扩增反应中，使用本发明第一方面所述的探针和/或如本发明第二方面所述的引物对；
反应结束后，检测所述待测样本的DNA是否含有所述VSV-G基因，以及检测所述待测样本中的所述VSV-G基因的拷贝数。
可选地，反应结束后，通过记录所述待测样本的Ct值，检测所述待测样本的DNA是否含有所述VSV-G基因，以及检测所述待测样本中的所述VSV-G基因的拷贝数，实现对复制型慢病毒的检测。
本发明中，所述Ct值是指在荧光定量PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数(Cycle Threshold)。
可选地，经所述含VSV-G的慢病毒转染的靶细胞制备过程包括：
在宿主细胞内组装所述含VSV-G的慢病毒，然后将所述含VSV-G的慢病毒转染靶细胞，所述靶细胞包括肿瘤细胞、干细胞和免疫细胞中的一种或多种。
可选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞或NK细胞。优选地，所述免疫细胞包括CD3阳性T淋巴细胞。
本发明中，所述含VSV-G的慢病毒是指采用VSV-G的包膜蛋白的各种慢病毒。
可选地，所述含VSV-G的慢病毒可以通过三质粒或四质粒的系统制备获得。本发明一实施方式中，将含VSV-G的包膜质粒、包装质粒和载体质粒共转染宿主细胞，得到含VSV-G的慢病毒。其中，所述载体质粒是通过在基因传递载体基础上经基因改造后的得到。所述载体质粒可以但不限于为pWPXLD质粒载体、pLEX-MCS载体、pSico载体和pCgpV载体。所述包装质粒可以但不限于为psPAX2。
可选地，所述包膜质粒可以但不限于为PMD2.G，所述包膜质粒中含有VSV-G基因序列。
可选地，所述含VSV-G的慢病毒内还含有靶基因；所述靶基因包括靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体基因。在本发明一实施方式中，采用pWPXLD质粒载体，通过基因工程方法将靶基因片段插入至所述pWPXLD质粒载体上得到pWPXLD重组质粒，然后将实施pWPXLD重组质粒作为载体质粒，与含VSV-G的包膜质粒和包装质粒共转染宿主细胞得到含VSV-G的慢病毒，该含VSV-G的慢病毒中含有靶基因，该含VSV-G的慢病毒可以高效地将靶基因片段均整合至靶细胞的基因组上。
本发明所述含VSV-G的慢病毒的组装过程通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。
可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞或COS7细胞。
进一步地，可选地，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
本发明中，所述含VSV-G的慢病毒一般仅将载体质粒中的目的基因片段整合在靶细胞的基因组上，而VSV-G基因一般在靶细胞中很少存在，尤其是伴随对慢病毒的不断改进过程中。但当所述VSV-G基因在靶细胞中存在时，尤其是当所述含VSV-G的慢病毒在靶细胞中能够实现自主复制时，本发明所述荧光定量PCR检测方法可以快速、灵敏地检测到所述VSV-G基因的拷贝数，从而得到所述复制型慢病毒拷贝数。
可选地，所述靶基因还可以但不限于为其他功能性基因，例如所述其他功能性基因可以为用于实现基因沉默、基因敲除或基因干扰的基因片段。或所述其他功能性基因可以为表达细胞表面受体蛋白的基因。
例如，当靶细胞为CD3阳性T淋巴细胞时，所述靶基因为CAR基因时，所述待测样本为可以靶向目的抗原的CAR-T细胞。进一步地，所述CAR基因的编码基因可以但不限于包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因。例如所述CAR基因可为靶向CD19、CD22、CD33或BCMA等的嵌合抗原受体基因，得到靶向CD19、CD22、CD33或BCMA的CAR-T。
可选地，当所述靶细胞为肿瘤细胞时，所述靶基因可以为用于基因沉默的基因片段。或当所述靶细胞为干细胞时，所述靶基因可以为用于基因敲除的基因片段，所述靶细胞可以用于研究干细胞分化等问题。
可选地，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。进一步可选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
具体地，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：向外周血单个核细胞中按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。
可选地，检测所述待测样本中的所述VSV-G基因的拷贝数，包括绘制标准曲线，包括以下步骤：
提供多个不同浓度梯度的标准品，所述标准品为含有所述VSV-G基因的第一重组基因传递载体；
对各个所述标准品中的所述VSV-G基因进行定量PCR扩增反应；反应完成后，根据所述不同浓度梯度的标准品中的所述VSV-G基因的拷贝数对应的Ct值绘制得到标准曲线。
可选地，绘制标准曲线时，所述定量PCR扩增反应的反应条件与检测所述待测样本时的一致。
可选地，所述第一重组基因传递载体是通过在基因传递载体基础上经基因改造后的得到。可选地，所述第一重组基因传递载体可以为病毒载体或质粒载体，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体和腺病毒载体中的至少一种。
进一步地，可选地，所述第一重组基因传递载体为PMD2.G。
可选地，所述阳性对照品可以为所述标准品经不同稀释倍数得到的。
可选地，所述标准曲线可以但不限于以测得所述标准品的Ct值为横坐标，以所述各个浓度的标准品的有VSV-G基因拷贝数的对数值为纵坐标。
本发明中，所述待测样本经检测后测得的Ct值可以根据标准曲线获得其原始拷贝数。本发明所述检测复制型慢病毒的方法，可以大大提高待测样本中的复制型慢病毒拷贝数的定量分析数据的真实性和准确性，提高所述荧光定量PCR检测方法的定量分析效率。
可选地，所述定量PCR扩增反应的程序包括：45-55℃培育2-5min；95-98℃预变性1-2min；94-98℃变性10-30秒，55-65℃退火延伸1-3分钟，共35-45个循环。
进一步地，可选地，所述定量PCR扩增反应的程序包括：45-55℃培育2min；95-98℃预变性2min；94-98℃变性15秒，55-65℃退火延伸1分钟，共35-45个循环。
本发明所述检测复制型慢病毒的方法是基于荧光定量PCR检测的原理，所述检测复制型慢病毒的方法还可以用于检测任何含VSV-G基因的对象，所述对象包括质粒、载体、病毒、细菌的基因组或细胞的基因组。
例如，所述检测复制型慢病毒的方法还可以用于检测经含VSV-G基因的第二重组基因传递载体转染的靶细胞中的VSV-G基因。
可选地，所述经含VSV-G基因的第二重组基因传递载体转染的靶细胞的制备过程包括：
在宿主细胞内组装重组病毒，所述重组病毒内含有所述VSV-G基因；将所述重组病毒转染靶细胞，所述靶细胞包括肿瘤细胞、干细胞和免疫细胞中的一种或多种。可选地，所述重组病毒可以为慢病毒载体、逆转录病毒载体和腺病毒载体中的至少一种。
本发明所述的检测复制型慢病毒的方法以灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确、速度快等诸多优点，可以成为VSV-G基因序列的定量分析、CAR-T中复制型慢病毒的拷贝数定量分析的重要工具。
本发明所述检测复制型慢病毒的方法的检测下限可达到0.42copies/μL的DNA。所述检测下限值远远低于传统的检测方法，因此，本发明所述检测复制型慢病毒的方法具有更高的灵敏性，以及更强的特异性。目前市场上VSV-G检测的灵敏度只能达到200copy，不足以检测到微量复制型慢病毒的产生，无法满足CAR-T产品的早期快速放行条件，而本发明所述检测复制型慢病毒的方法的灵敏度很高，能够满足CAR-T产品快速检测标准。
第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述检测复制型慢病毒的探针、如第二方面所述检测复制型慢病毒的引物对或如第四方面所述检测复制型慢病毒的方法在CAR-T的复制型慢病毒拷贝数检测方面的应用。
本发明所述探针、引物对或所述的检测复制型慢病毒的方法可以实现对VSV-G基因序列的特异性、灵敏性的定量分析，可以用于复制型慢病毒拷贝数的定量分析。由于CAR-T在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的具有重要前景；因此，该应用CAR-T在产业化和临床应用的过程中，对CAR-T中复制型慢病毒拷贝数，尤其是微量的复制型慢病毒拷贝数，的定量检测具有重要意义。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述检测复制型慢病毒的探针特异性强，且两端的荧光报告基团和淬灭基团非常靠近时，荧光淬灭效率高；可高特异性检测VSV-G基因，并用于检测检测复制型慢病毒。
(2)本发明所述检测复制型慢病毒的引物对可以特异性识别VSV-G基因序列，并在PCR扩增反应中快速扩增VSV-G基因。
(3)本发明提供的荧光定量PCR试剂盒能够对含VSV-G基因的慢病毒拷贝数或经慢病毒转染方法基因介导的CAR-T中的慢病毒VSV-G基因的拷贝数进行定量检测，可以有效监测CAR-T中的复制型慢病毒拷贝数；具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确、速度快等诸多优点。
(4)本发明提供的检测复制型慢病毒的方法简单实用，可以对经慢病毒转染方法基因介导的CAR-T中的复制型慢病毒的拷贝数进行定量检测，为CAR-T制备生产工艺的稳定性、批量生产后的放行标准提供了重要检测手段。
附图说明
图1为本发明一实施例提供的包膜质粒pMD2.G的质粒图谱。
图2为本发明一实施例提供的检测复制型慢病毒的方法的标准曲线。
图3为本发明一实施例提供的标准曲线的荧光定量PCR扩增图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
若无特别说明，下面实施例使用的化学试剂均为市售试剂。其中，荧光定量PCR检测方法中使用PCR管为Real-time PCR管，采购自BIOplastics公司，货号：B60109；Real-timePCR管盖，采购自BIOplastics公司，货号：B57801；所述Probe qPCR Mix，采购自TOYOBO公司，货号：QPS-101。
实施例一
一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建pWPXLD-CAR重组质粒
将嵌合抗原受体(CAR)基因片段插入到pWPXLD质粒载体中真核启动子下游的一对酶切位点之间，然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建含有CAR靶基因的pWPXLD-CAR重组质粒。
(2)重组慢病毒构建
将pWPXLD-CAR重组质粒、包装质粒psPAX2、和如图1所示的包膜质粒pMD2.G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μL，2×108个/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到重组慢病毒。
(3)嵌合抗原受体T细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)慢病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞
取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的所述重组慢病毒进行培养。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。
(4)将得到CAR-T，进行流式细胞术检测其CAR表达率以判断是否成功转染；并对CAR阳性的CAR-T细胞提取DNA，使用检测复制型慢病毒的探针、引物对，按所述检测复制型慢病毒的方法对VSV-G基因拷贝数进行检测，以检测CAR-T中复制型慢病毒的拷贝数。
其中，使用的引物对，包括正向引物和反向引物：
正向引物：5’-GATGAGAGTTTATTTTTTGGTG-3’
反向引物：5’-GCAAAGATGGATACCAACTCG-3’
所述引物对可以特异性识别VSV-G基因的核苷酸序列，扩增目的片段大小为162bp。
其中，所述探针为：5’-FAM-TCAGTAGTTGGAAAAGCTCTA-BHQ-1-3’
反应过程包括：正向引物和方向引物各取500nmol，探针取250nmol，10μL反应缓冲液Probe qPCR Mix，2μL提取的DNA模板，加超纯水调节至20μL反应体系；荧光定量PCR的反应条件为：50℃培育2min；95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。
上述荧光定量PCR检测方法的检测下限为可达到0.42copies/μL DNA。
为了评估本发明所描述的荧光定量PCR检测方法的检测效果，进行如下效果实施例。
效果实施例
1、评估评估制备成功的CAR-T细胞中是否会产生复制型慢病毒
(a)建立标准曲线：将含有VSV-G基因的标准pMD2.G质粒载体作为标准品(采购自Addgene公司)，检测其浓度为26.8ng/uL，将此浓度换算成拷贝数/μL为：4200000000copies/μL，进行10个浓度梯度稀释，最低浓度梯度为0.42copies/μL；所述标准品的10个浓度梯度及其相对应的对数值如下表1所示：
表1：标准品的10个浓度梯度及其对应的对数值
质粒浓度(copies/μL) 相对应的对数值
4200000000 9.62324929
420000000 8.62324929
42000000 7.62324929
4200000 6.62324929
420000 5.62324929
42000 4.62324929
420 2.62324929
42 1.62324929
4.2 0.62324929
0.42 -0.37675071
配置荧光定量PCR的反应体系(20μL)为：正向引物、反向引物各500nmol，探针250nmol，反应缓冲液Probe qPCR Mix 10μL，各个浓度梯度标准品DNA2μL，用DEPC水进行定容；
所述荧光定量PCR扩增反应的程序为：50℃培育2min；95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环；每个样品进行3个重复孔。
反应结束后，记录数据，参见表2，将测得的10个浓度梯度的浓度相应对数值为纵坐标，以测得的Ct值为横坐标，绘制得到标准曲线y＝-0.3609x+14.209，(R2＝0.9937)，具体一并参见图2和图3。
表2：标准曲线的横、纵坐标相应数据表
Figure BDA0002053076240000131
(b)待测样本的检测评估
所述荧光定量PCR检测方法过程中的实验组具体为：1、DEPC水为阴性对照品；2、pMD2.G载体质粒为阳性对照品(将26.8ng/μL标准品pMD2.G载体质粒稀释1000倍后得到浓度为2.68pg/μL的所述阳性对照品)；3、待测样本1为加入0μL重组慢病毒转染后的CAR-T细胞；4、待测样本2为加入5μL重组慢病毒转染后的CAR-T细胞；5、待测样本2为加入10μL重组慢病毒转染后的CAR-T细胞；6、待测样本4为加入20μL重组慢病毒转染后的CAR-T细胞。
根据制备的标准曲线：y＝-0.3609x+14.209，可以得快速、定量测得各个实验组的复制型慢病毒VSV-G基因拷贝数，即复制型慢病毒拷贝数，参见表3所示(其中国际标准为VSV-G拷贝数低于50拷贝/μg总DNA，即为阴性结果)。
表3：荧光定量PCR检测数据表
Figure BDA0002053076240000132
由本发明所述检测复制型慢病毒的方法测得的各个待测样本的复制型慢病毒拷贝数数据可以看出，本发明效果实施例中使用不同浓度病毒制备的CAR-T细胞，没有产生可复制的慢病毒。
由于现有方法中，针对复制型慢病毒拷贝数的实验室鉴定方法有血清学方法(P24ELISA)和核酸检测技术。传上述传统的检测方法主要通过检测目的基因在T细胞中表达的特定蛋白表达来确定T细胞转染后是否会产生复制型慢病毒，或者通过检测复制型慢病毒核酸，来定性分析是否会产生复制型慢病毒。这些方法从蛋白和总的核酸角度来检测复制型慢病毒的产生，检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求，且需要野生型HIV作为阳性对照，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段，而且不能定量分析转染慢病毒后的CAR-T中产生复制型慢病毒的拷贝数。而本发明提供的检测复制型慢病毒的方法以灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确、速度快等诸多优点，可以作为CAR-T产业化应用过程中的复制型慢病毒定量分析的重要工具。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳宾德生物技术有限公司
<120> 一种检测复制型慢病毒的探针、引物对、荧光定量PCR试剂盒及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcagtagttg gaaaagctct a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatgagagtt tattttttgg tg 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcaaagatgg ataccaactc g 21
<210> 4
<211> 1536
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaagtgcc ttttgtactt agccttttta ttcattgggg tgaattgcaa gttcaccata 60
gtttttccac acaaccaaaa aggaaactgg aaaaatgttc cttctaatta ccattattgc 120
ccgtcaagct cagatttaaa ttggcataat gacttaatag gcacagcctt acaagtcaaa 180
atgcccaaga gtcacaaggc tattcaagca gacggttgga tgtgtcatgc ttccaaatgg 240
gtcactactt gtgatttccg ctggtatgga ccgaagtata taacacattc catccgatcc 300
ttcactccat ctgtagaaca atgcaaggaa agcattgaac aaacgaaaca aggaacttgg 360
ctgaatccag gcttccctcc tcaaagttgt ggatatgcaa ctgtgacgga tgccgaagca 420
gtgattgtcc aggtgactcc tcaccatgtg ctggttgatg aatacacagg agaatgggtt 480
gattcacagt tcatcaacgg aaaatgcagc aattacatat gccccactgt ccataactct 540
acaacctggc attctgacta taaggtcaaa gggctatgtg attctaacct catttccatg 600
gacatcacct tcttctcaga ggacggagag ctatcatccc tgggaaagga gggcacaggg 660
ttcagaagta actactttgc ttatgaaact ggaggcaagg cctgcaaaat gcaatactgc 720
aagcattggg gagtcagact cccatcaggt gtctggttcg agatggctga taaggatctc 780
tttgctgcag ccagattccc tgaatgccca gaagggtcaa gtatctctgc tccatctcag 840
acctcagtgg atgtaagtct aattcaggac gttgagagga tcttggatta ttccctctgc 900
caagaaacct ggagcaaaat cagagcgggt cttccaatct ctccagtgga tctcagctat 960
cttgctccta aaaacccagg aaccggtcct gctttcacca taatcaatgg taccctaaaa 1020
tactttgaga ccagatacat cagagtcgat attgctgctc caatcctctc aagaatggtc 1080
ggaatgatca gtggaactac cacagaaagg gaactgtggg atgactgggc accatatgaa 1140
gacgtggaaa ttggacccaa tggagttctg aggaccagtt caggatataa gtttccttta 1200
tacatgattg gacatggtat gttggactcc gatcttcatc ttagctcaaa ggctcaggtg 1260
ttcgaacatc ctcacattca agacgctgct tcgcaacttc ctgatgatga gagtttattt 1320
tttggtgata ctgggctatc caaaaatcca atcgagcttg tagaaggttg gttcagtagt 1380
tggaaaagct ctattgcctc ttttttcttt atcatagggt taatcattgg actattcttg 1440
gttctccgag ttggtatcca tctttgcatt aaattaaagc acaccaagaa aagacagatt 1500
tatacagaca tagagatgaa ccgacttgga aagtaa 1536

Claims (10)

1.一种检测复制型慢病毒的探针，其特征在于，所述探针包括一段单链核苷酸片段，所述单链核苷酸片段的5’端标记有荧光报告基团，所述核苷酸片段的3’端标记有荧光淬灭基团，所述单链核苷酸片段包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团包括羧基四甲基罗丹明、羧基荧光素、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素和六氯-6-甲基荧光素中的一种或多种；所述荧光淬灭基团包括4-[(2-氯-4-硝基-苯基)-偶氮基]-苯胺和黑洞淬灭剂中的一种或多种。
3.一种检测复制型慢病毒的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述反向引物包括如SEQID NO：3所示的核苷酸序列。
4.一种荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-2任意一项所述的探针和/或如权利要求3所述的引物对。
5.如权利要求4所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂盒还包括反应缓冲液、阳性对照品和阴性对照品。
6.一种检测复制型慢病毒的方法，其特征在于，包括：
提取待测样本的DNA，所述待测样本包括经含VSV-G的慢病毒转染的靶细胞，对所述待测样本的DNA进行定量PCR扩增反应；所述定量PCR扩增反应中，使用如权利要求1或2所述的探针和/或如权利要求3所述的引物对；
反应结束后，检测所述待测样本的DNA是否含有所述VSV-G基因，以及检测所述待测样本中的所述VSV-G基因的拷贝数。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，经所述含VSV-G的慢病毒转染的靶细胞制备过程包括：
在宿主细胞内组装所述含VSV-G的慢病毒，然后将所述含VSV-G的慢病毒转染靶细胞，所述靶细胞包括肿瘤细胞、干细胞和免疫细胞中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述含VSV-G的慢病毒内还含有靶基因；所述靶基因包括靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体基因。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，检测所述待测样本中的所述VSV-G基因的拷贝数，包括绘制标准曲线，包括以下步骤：
提供多个不同浓度梯度的标准品，所述标准品为含有所述VSV-G基因的第一重组基因传递载体；
对各个所述标准品中的所述VSV-G基因进行定量PCR扩增反应；反应完成后，根据所述不同浓度梯度的标准品中的所述VSV-G基因的拷贝数对应的Ct值绘制得到标准曲线。
10.一种如权利要求1-2任一项所述检测复制型慢病毒的探针、如权利要求3所述检测复制型慢病毒的引物对或如权利要求6-9任一项所述检测复制型慢病毒的方法在CAR-T中的复制型慢病毒拷贝数检测方面的应用。
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