CN109679928A - 重组单纯疱疹病毒、试剂盒及其用途 - Google Patents

重组单纯疱疹病毒、试剂盒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及重组单纯疱疹病毒、试剂盒及其用途。本发明涉及体外诊断领域，特别涉及循环前列腺癌细胞的检测。本发明提供了重组单纯疱疹病毒，所述重组单纯疱疹病毒是含有感染细胞蛋白4基因的单纯疱疹病毒基因组中的ICP4基因启动子替换为人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp的单纯疱疹病毒，其中在病毒基因组中的除ICP4以外的基因中插入受前列腺特异性膜抗原启动子(PSMAp)控制的产生可检测光的蛋白质基因的表达盒。针对现有的方法对前列腺癌CTC的捕获和分离存在着灵敏度不足，特异性不强的缺陷，本发明提供了一种快速，高灵敏度和特异性的前列腺癌CTC检测方法。

Description

重组单纯疱疹病毒、试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及体外诊断领域，特别涉及循环前列腺癌细胞的检测，具体涉及重组单纯疱疹病毒、试剂盒及其用途。
背景技术
前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤。2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为9.92/10万，列男性恶性肿瘤发病率的第6位。发病年龄在55岁前处于较低水平，55岁后逐渐升高，发病率随着年龄的增长而增长，高峰年龄是70～80岁。在欧美发达国家，前列腺癌肿瘤中仅次于肺癌的致男性死亡的第二病因。近年来，随着老龄化的加剧及各种检测手段的更新和广泛应用，我国前列腺癌的发病率明显升高。
目前，前列腺癌的早期筛查主要是PSA筛查。虽然PSA是最常用的检测前列腺癌的手段，但良性前列腺增生和前列腺炎也会出现PSA阳性的结果，筛查的假阳性率高。而前列腺癌最常用的诊断方法是超声引导下经直肠前列腺穿刺，但这一方法存在诸多局限性。多数前列腺癌在超声上不能显示，因此穿刺是随机的“盲穿”，难以实现对病灶的精确定位，诊断灵敏性不够，漏诊风险较高。尤其是对于发生于中央腺体的前列腺癌，漏诊率更高，一些高危患者需经过多次穿刺才能确诊。因此急迫需要新型的筛查，诊断和检测方式提高前列腺癌诊断灵敏性及特异性。
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTC)是从肿瘤病灶脱离并播散到血液中的肿瘤细胞，这些CTC细胞正是造成恶性肿瘤转移和复发的原因。CTC检测是目前最具巨大发展潜力的无创诊断和实时疗效监测手段,对于前列腺癌患者早期转移、复发的筛查、诊断有重要意义。
目前，依据的原理可将检测CTC的方法分为免疫学方法捕获和物理学方法分离两大类。免疫学方法捕获是利用白细胞特异性表面抗原(如CD45，CD14，CD56等)来去除白细胞的负向筛选或用上皮细胞黏附分子，如EpCAM等抗体进行正向富集。现阶段，大部分设备和方法通过免疫学方法捕获CTC，其中Cellsearch是美国食品和药品管理局目前唯一批准使用的的CTC检测系统。这种检测方法存在大量缺陷，由于该方法只能检测到EpCAM表面抗原阳性的CTC，当肿瘤细胞表面抗原出现缺失或低表达的情况下，则出现假阴性结果。此外，Cellsearch的灵敏度不高，对部分CTC较少的患者，检测的灵敏度不足。物理学方法依据肿瘤细胞大小、通过滤膜直接富集CTC。其不足在于会漏检直径小于滤膜孔径的和存活状态不好或萎缩的CTC，而且CTC富集能力较差，背景较高。目前，也有部分方法将两者结合起来，提高了一定的捕获能力，但是其本质上的不足并没有得到一定的解决。
整体来讲，现有的方法对前列腺癌CTC的捕获和分离存在着灵敏度不足，特异性不强的缺陷，急需一种快速，高灵敏度和特异性的前列腺癌CTC检测方法。
发明内容
本发明为了克服上述方法的缺陷和不足，提供一种检测结果稳定，准确率高，灵敏度高，精密性好，适于临床推广的循环肿瘤细胞，优选前列腺癌循环肿瘤细胞的检测试剂盒以及其用途。通过本发明的检测试剂盒获得的检测结果稳定，可重复性好，准确率高，灵敏度高，精密性好。
本发明提供了重组单纯疱疹病毒，所述重组单纯疱疹病毒是含有感染细胞蛋白4(infected cell protein 4,ICP 4)基因的单纯疱疹病毒基因组中的ICP4基因启动子替换为人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp的单纯疱疹病毒或者以保藏编号CGMCC NO.6397保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的重组单纯疱疹病毒，其中在病毒基因组中的除ICP4以外的基因中插入受前列腺特异性膜抗原启动子(PSMAp)控制的产生可检测光的蛋白质基因的表达盒。
在一个实施方案中，重组单纯疱疹病毒的ICP 47基因是删除的，并且受前列腺特异性膜抗原启动子(PSMAp)控制的产生可检测光的蛋白质基因的表达盒插入删除的ICP 47基因位置。
在一个实施方案中，重组单纯疱疹病毒的ICP 34.5基因是删除的。
在一个实施方案中，产生可检测光的蛋白质是绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白和/或青色荧光蛋白；优选地，所述前列腺特异性膜抗原启动子包含以SEQ IDNO.1所示的序列。
在一个实施方案中，ICP 4基因中与17+毒株的127235-131131对应的位置是删除的，并且人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp插入相应的位置中。
在一个实施方案中，ICP 47基因中与17+毒株的145316-145582对应的位置是删除的，并且所述表达盒插入删除的位置中。
在一个实施方案中，ICP 34.5基因中与17+毒株的513-1259和/或125115-125861对应的位置是删除的。
本发明还提供了用于检测受试者中的循环前列腺癌细胞的试剂盒，其包含根据本发明的重组单纯疱疹病毒、以及任选地检测白细胞表面抗原的试剂和检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂；
其中任选地，所述试剂盒包含红细胞裂解液、洗涤液和/或转染试剂；
其中优选地，所述检测白细胞表面抗原的试剂和/或所述检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂是标记的，优选地所述检测白细胞表面抗原的试剂和/或所述检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂是抗体；
优选地，用不同的可检测标记物标记所述检测白细胞表面抗原的试剂和/或所述检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂。
在一个实施方案中，可检测标记物选自PE、APC、PE-CY5、PerCP-CY5.5、FITC、PerCP、CY-7、APC-CY7、eFluor/Super Bright系列荧光染料和Alexa Fluor系列荧光染料。
在一个实施方案中，白细胞表面抗原是CD45分子和/或所述循环前列腺癌细胞表面抗原是PSMA。
本发明还提供了试剂在制备用于检测受试者中的循环前列腺癌细胞的试剂盒中的用途，其中所述试剂是本发明的重组单纯疱疹病毒或者包含本发明的重组单纯疱疹病毒、检测白细胞表面抗原的试剂和检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂，任选包含红细胞裂解液、洗涤液和/或转染试剂，其中优选地，所述检测白细胞表面抗原的试剂和/或所述检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂是标记的，优选地所述检测白细胞表面抗原的试剂和/或所述检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂是抗体；
优选地，用不同的可检测标记物标记所述检测白细胞表面抗原的试剂和/或所述检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂；所述可检测标记物选自PE、APC、PE-CY5、PerCP-CY5.5、FITC、PerCP、CY-7、APC-CY7、eFluor/Super Bright系列荧光染料、和Alexa Fluor系列荧光染料。
在一个实施方案中，白细胞表面抗原是CD45分子和/或所述循环前列腺癌细胞表面抗原是PSMA。
附图说明
图1：质粒pH2dI34.5-GFP的构建。
图2：质粒pdICP47PSMApGFP的构建。
图3：17+hTERTpICP4PSMApGFP的构建。
图4：单纯疱疹病毒17+hTERTpICP4PSMApGFP与17+hTERTpICP4d34.5GFP对肺癌A549细胞及前列腺癌PC-3细胞的检测结果的比较。
图5：灵敏度特异性分析，对健康人群及前列腺癌患者检测结果进行ROC分析的图。
图6：对检测方法进行线性分析的图。
图7：待分析细胞群示意图。肿瘤细胞在流式图上显示位置为单核细胞群体位置，因为个数很少，在分析时需要将所在位置细胞群体全部圈选。
图8：CD45阴性细胞示意图。对圈选的待分析细胞群分析CD45阴性细胞群，因为外周血中免疫细胞群体通用标志物为CD45。CD45阴性细胞群体就是血液中的非免疫细胞群体。
图9：CTC检测结果示意图。
图10：ROC曲线分析图。
图11：17+hTERTpICP4-d34.5-GFP在三标记法中的性能检测。
图12：17+hTERTpICP4PSMApGFP在三标记法中的性能检测。通过对待分析细胞群群体位置图圈选后进行进一步分析的结果，即先获得单核细胞群体，在对单核细胞群体进行分析，分析其中的CD45阴性群体，在这部分阴性群体中获得GFP阳性，PSMA阳性的双阳细胞，就是右上角的部分。
具体实施方式
提供以下描述以帮助本领域技术人员理解本发明。
本说明书中使用的“受试者”，是指包含人、黑猩猩的灵长类、犬、猫等宠物动物、牛、马、绵羊、山羊等家畜动物、小鼠、大鼠等啮齿类等哺乳动物。
在本文中“敏感度”是指(真阳性的数)/(真阳性的数+假阴性的数)的值。如果敏感度高，则能够早期发现前列腺癌，致使完全的癌症部的切除、复发率的降低。
在本文中“特异性”，是指(真阴性的数)/(真阴性的数+假阳性的数)。如果特异性高，则防止实施由将正常体误判别成前列腺癌患者引起的无益的追加检查，致使患者的负担的减轻、医疗费的减少。
在本文中“肿瘤”是指以细胞过度生长为特征的病症。
在本文中，“循环肿瘤细胞”可以是任何类型的癌症的循环肿瘤细胞。优选地，循环肿瘤细胞是前列腺癌循环肿瘤细胞。
CD45分子在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原(leukocyte commonantigen,LCA)。CD45由一类结构相似，分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面。
前列腺特异性膜抗原(prostate-specificmembraneantigen，PSMA)是存在于前列腺细胞膜的一种多功能的Ⅱ型跨膜蛋白，由750个氨基酸残基组成。
在本发明中，可以通过CD45单克隆抗体在体外与白细胞CD45分子结合，从而通过抗体携带的APC-CY7荧光基团标记人外周血样品中的白细胞。
在本发明中，可以通过携带的APC荧光基团的人前列腺癌细胞表面标志物PSMA的抗体进一步标记细胞。经标记的外周血样品由流式细胞仪检测并计数。
在本发明中，GFP阳性及PSMA阳性且CD45分子阴性的细胞(CD45-/GFP+/PSMA+)被定义为前列腺癌患者外周血中的循环前列腺癌细胞。
本发明人构建了新的重组单纯疱疹病毒，其能够区别前列腺癌细胞与其它类型的癌细胞，这是通过在重组单纯疱疹病毒中同时加入人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp和前列腺特异性膜抗原启动子实现的。
本发明的重组单纯疱疹病毒在仅人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp被激活时不产生可检测光，而只有当人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp和前列腺特异性膜抗原启动子均被激活时才能产生可检测光。
发明人还发现与现有方法构建的重组单纯疱疹病毒相比，本发明的重组单纯疱疹病毒在检测前列腺癌细胞的方法，尤其是与CD45抗体和PSMA抗体结合检测前列腺癌细胞的方法中具有很高的灵敏度。
实施例
以下实施例选用I型单纯疱疹病毒毒株常用标准毒株：17+株(GenebankJN555585.1)，为从英国HPA(Health Protection Agency)公司购买。17+株全基因序列已知。如无特别说明，所用酶及质粒均为购买所得。pSP73来自Promega；pcDNA3来自Invitrogen；pcDNA3.1-eGFP来自YRGGENE。
实施例1：构建剔除ICP4基因的重组I型单纯疱疹病毒oHSV1d4-GFP
a.病毒DNA制备
用BHK(地鼠肾)细胞(购自ATCC，商品货号CCL-10TM)培养野生型17+病毒，用DNAzolTM基因组DNA分离试剂盒(Helena Biosciences Cat.No.DN127200)纯化病毒DNA。将BHK细胞生长于175平方厘米的培养瓶中，培养液为含10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM。培养条件为37℃，5％二氧化碳。当细胞长至90％饱和时，接种病毒。继续孵化24-48小时，当90％以上细胞出现细胞病变时，去除培养液，并加入10ml的DNAzol。用10ml吸管吸吹5次、并将细胞裂解液转移到50ml的Falcon试管中，加入5ml的100％乙醇，轻轻地作圆周运动摇动试管，让病毒DNA充分析出。用吸头将DNA挑到另一试管中，用70％的乙醇洗一遍，再用吸头将DNA挑到小离心管中。吸净残留的乙醇，将DNA溶于1ml灭菌水中，分装后存于-20℃备用。
b.构建pICP4del-eGFP质粒
扩增ICP4基因上游侧翼序列：以步骤a中所得17+病毒基因组DNA为模板，用ICP4USf(正向引物：CCCTCCAGACGCACCGGAGTCGGGGG)和ICP4USr(反向引物：AAGTCGACTCTAGAGGATCGATCTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTGAGGTA)扩增出ICP4基因上游侧翼序列；
扩增ICP4基因下游侧翼序列：以所得17+病毒基因组DNA为模板，用ICP4DSf(正向引物：AAAAGTCGACCTGCAGGCATGCTAACGAGGAACGGGCAGGGGGC)和ICP4DSr(反向引物：AAAAAAGCTTGCATGCCCACGTGCGCGGGGCCAGACGGGCT)扩增出ICP4基因下游侧翼序列；
将上下游侧翼序列克隆到pSP73质粒(从Promega公司购得)上，构建pICP4del及pICP4del-eGFP质粒：将SalI酶切的前述扩增出的ICP4基因的上游侧翼序列及SalI/HindIII双酶切的前述扩增出的ICP4基因的下游侧翼序列混合并连接到pSP73的EcoRV/HindIII位点，得到pICP4del。序列分析证实该pICP4del质粒无突变。用EcoRI/XhoI从pcDNA3.1-eGFP(从YRGENE购得，北京)切下CMV启动子(巨细胞病毒早期启动子)控制的eGFP表达盒，经T4DNA聚合酶补平末端后插入到pICP4del的EcoRV位点，得到pICP4del-eGFP。
c.构建剔除ICP4基因的重组I型单纯疱疹病毒(oHSV1d4-GFP)
所使用的溶液和细胞：
A、野生型17+病毒DNA,1毫克/毫升，用DNAzol试剂盒制备(同上)。
B、质粒pICP4del-eGFP DNA 1毫克/毫升。
C、Hepes转染缓冲液，140mM NaCL，5mM KCL，0.75mM Na2HPO4,5.5mM D-glucose，20mMHepes，pH为7.05。(0.22μm孔径滤膜常温过滤除菌)
D、2M CaCl2(过滤除菌，室温保存)
E、6孔培养板上有80-90％密度生长的BHK细胞。
F、1.6％的羧甲基纤维素(CMC，121℃下20分钟高压灭菌)
操作步骤：
1)取两个无菌的eppendorf试管，在其中一个里加入400微升的Hepes转染缓冲液。
2)在另一试管中加入31微升2M CaCl2，20微升病毒DNA，8微升质粒DNA。轻轻混匀后，用移液器将其缓慢加入到400微升的Hepes转染缓冲液中。
3)轻轻混匀后，于室温下静置40分钟。
4)40分钟后，在6孔培养板中吸去BHK细胞的培养液，将上述转染混合液缓慢加入培养板中，每一孔对应一个转染混合液，然后5％CO2、37℃孵箱中放置30分钟。
5)30分钟后在每孔中加入1毫升细胞培养液，然后再将细胞培养板放回37℃孵箱中，孵育5小时。
6)用Hepes缓冲液配制20％DMSO溶液，置于冰中。
7)5小时后，移去培养板中的所有培养液，并用1毫升新鲜培养液清洗细胞2次。
8)每孔加入1毫升20％DMSO液，室温下放置90秒。
9)迅速移去20％DMSO液、并用新鲜培养液小心清洗细胞2次。
10)每孔中加入2毫升新鲜细胞培养液，置37℃，5％CO2孵化箱。48小时可观察到病毒噬斑。将培养板置于-70℃冰箱冻存一次。解冻后，收获细胞和培养液。
11)用6孔培养板培养BHK-ICP4细胞(如下文所述构建)，待细胞达70％密度时，吸除培养液并每孔加入1ml无血清培养液，然后每孔加入0.1或10微升收获液并覆盖2ml的CMC:完全培养液(配方或来源)(2:5)(CMC购自国药集团，完全培养基为DMEM/F12加10％胎牛血清，DMEM/F12和胎牛血清购自Gibco美国)。培养两天后，在显微镜直视下，用20微升移液枪挑取带有绿色荧光的病毒噬斑，即为剔除了ICP4基因的17+重组病毒(oHSV1d4-GFP)。经5次挑斑纯化重组病毒，再用如前所述的方法培养病毒并制备提取病毒基因组DNA。
d.构建重组病毒(17+hTERTpICP4)
分三次PCR扩增出ICP4基因中三段序列：首先，使用表1所示的引物，以步骤a中所得17+病毒基因组DNA为模板，分别扩增出三段基因片段ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd，而后分别将该三段基因片段插入pSP73的EcoRV位点构建出以下三种质粒：pSP73-ICP4-1st、pSP73-ICP4-2nd、pSP73-ICP4-3rd。在证实序列无突变后，从该三种质粒中用EcoRI和BsrGI剪切出ICP4-1st、用BsrGI和PvuI剪切出ICP4-2nd及用PvuI和XhoI剪切出ICP-3rd待用；
表1
从含人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp的质粒pcDNA3-NHN-hTERTp(用NruI和HindIII切下hTERTp片段(hTERT基因启动子序列(SEQ ID No.1)：tcgcgagtttaaactggcccctccctcgggttaccccacagcctaggccgattcgacctctctccgctggggccctcgctggcgtccctgcaccctgggagcgcgagcggcgcgcgggcggggaagcgcggcccagacccccgggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggcacagacgcccaggaccgcgctccccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccacccccgcgaagctt，由北京英茂盛业生物科技有限公司合成，NCBI Reference Sequence:NC_000005.10(Homosapiens chromosome 5,GRCh38.p12Primary Assembly))，取代从pcDNA3-NHN(pcDNA3从Invitrogen公司购得，在pcDNA3的NheI位点插入NheI-HapI-NheI酶切位点序列，构建成pcDNA3-NHN)上用NruI和HindIII切除的CMV启动子，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp)中将ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd混合并连接到pcDNA3-NHN-hTERTp的EcoRI及XhoI位点，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4；
用SalI酶切含ICP4基因上下游侧翼序列的质粒pICP4del，并补平末端待用，用PmeI和HpaI从质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表达盒片段，并将其与该酶切后待用的pICP4del载体连接，构建出质粒pICP4del-hTERTp_ICP4。
构建BHK-ICP4辅助细胞：用EcoRI和XhoI从获得的质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV启动子的下游EcoRI和XhoI位点，得到pcDNA3-CMV-ICP4质粒；将该pcDNA3-CMV-ICP4质粒转染BHK细胞，该pcDNA3-CMV-ICP4质粒DNA可重组到BHK细胞基因组中，使有些BHK重组细胞获得对新霉素(neomycin)的抗性和表达ICP4。用抗菌素G418杀死未重组的BHK细胞。经过几轮的亚克隆筛选，用RT-PCR方法筛选到表达ICP4的BHK-ICP4辅助细胞。
用6孔培养板准备80-90％密度的BHK-ICP4细胞。将上述oHSV1d4-GFP病毒DNA与pICP4del-hTERTp-ICP4质粒DNA共同转染BHK-ICP4细胞内，经同源重组，oHSV1d4-GFP荧光蛋白质表达盒与pICP4del-hTERTp-ICP4质粒上的人端粒酶逆转录酶表达基因的启动子连接ICP4基因表达盒发生同源重组，发生重组病毒的毒斑无荧光产生,挑选无绿荧光毒斑，就能纯化重组病毒17+hTERTpICP4。实施例中使用的重组病毒也可以是以保藏编号CGMCCNO.6397购自中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的病毒株。重组病毒(17+hTERTpICP4)经培养扩增，最终得到1010pfu的重组病毒溶液，溶剂为DMEM培养基。
实施例2：构建剔除ICP34.5基因的重组I型单纯疱疹病毒
17+hTERTpICP4d34.5
1.构建含有ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pH2dI34.5-GFP
PCR扩增出ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列(Flanking Region,简称FLR)。所用PCR引物序列见表2。
表2
PCR(50ul反应体积)扩增上游和下游FLR时，均用以下反应条件：20ng17+病毒基因组DNA；30mM Tris-HCl(pH9.2)；10mM硫酸镁；15mM氯化钠；100uM dNTPs；50pMol正向引物；50pMol反向引物；1U(酶反应单位)TaqDNA聚合酶。35个循环扩增，每个循环的温度和时间为：95℃，60秒；62℃，20秒；72℃，120秒。将上下游侧翼序列克隆到pSP72(从Promega购得)质粒上，构建pdICP34.5及pdICP34.5-eGFP质粒：用重叠聚合酶链反应(72℃，10分钟，4℃，10分钟)(overlapping PCR)连接ICP34.5上下游侧翼序列，并与用BamHI/Xhol双切并补平的pSP72载体连接，得到pdICP34.5。用EcoRI/XhoI从pcDNA3.1-eGFP切下eGFP表达盒，经T4DNA聚合酶补平末端后插入到pdICP34.5的AfeI位点，得到pdICP34.5-eGFP。
将以上步骤所得17+hTERTpICP4基因组DNA与所得的pdICP34.5-eGFP共转染BHK-ICP4细胞。同源重组后，经过几轮的噬斑纯化，挑选绿色荧光毒斑，就能得到纯的重组病毒17+hTERTpICP4-d34.5-GFP。
以上述同样的方法用pdICP34.5剔除17+hTERTpICP4-d34.5-GFP中GFP表达盒，得到17+hTERTpICP4d34.5。具体地，将pdICP34.5与17+hTERTpICP4-d34.5-GFP共转染BHK-ICP4细胞，发生重组病毒的毒斑无荧光产生，挑选无绿荧光毒斑，就能纯化重组病毒17+hTERTpICP4d34.5。
实施例3：构建重组I型单纯疱疹病毒17+hTERTpICP4PSMApGFP
本发明所述的重组I型单纯疱疹病毒，剔除了ICP34.5的基因及ICP47基因，并将病毒基因组ICP4野生型启动子替换为人端粒酶逆转录酶的启动子，并在ICP47的位置加入由前列腺特异性膜抗原启动子调控表达的荧光蛋白表达盒，从而特异性的在前列腺癌细胞中生长增殖。
1.人前列腺特异性膜抗原表达基因的启动子的获得
人前列腺特异性膜抗原表达基因的启动子序列通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)查询获得(GenBank登录号：AF007544.1，SEQ ID NO.2)，并通过碱基合成分别得到带有NruI/HindⅢ位点的正义链和反义链两条单链DNA，将单链DNA退火形成双链DNA。退火(50ul反应体积)体系及反应条件：
50uMol正向引物；50uMol反向引物；30mM Tris-HCl(pH9.2)；95℃5分钟，70℃10分钟，逐渐冷却到室温。
人前列腺特异性膜抗原表达基因的启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)
2.提取野生型I型单纯疱疹病毒17+株的全长病毒DNA；
3.构建pcDNA3PSMApGFP质粒
将pcDNA3.1-eGFP质粒用限制性内切酶NruI和HindⅢ将原载体上的CMV片段切下，将人前列腺特异性膜抗原表达基因的启动子双链DNA分别插入pcDNA3CMVGFP的NruI和HindⅢ的位点，形成pcDNA3PSMApGFP质粒构建含有ICP47基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pdICP47H2：
a.使用下表所示的引物，以步骤1得到的全长病毒DNA为模板，PCR扩增ICP47基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列；
表3
b.将步骤a扩增所得PCR产物上游侧翼区序列插入到pSP73质粒的SmaI位点，得到pSP73ICP47US质粒；
c.将步骤a扩增所得PCR产物下游侧翼区序列插入到pSP73质粒的SmaI位点，得到pICP47DS质粒；
d.用限制性内切酶SacI和BamHI从步骤c获得的pICP47DS质粒中酶切出下游侧翼区序列，并将该下游侧翼区序列插入到步骤b获得的pSP73ICP47US质粒的BglII位点，得到含ICP47基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的pdICP47H2质粒，
e.将获得的pcDNA3PSMApGFP质粒插入到步骤d获得的pdICP47H2质粒的EcoRV位点，得到pdICP47PSMApGFP质粒；
4.构建替换ICP47基因的含有PSMA启动子(PSMAp)的重组I型单纯疱疹病毒17+hTERTpICP4PSMApGFP
用如前所述的方法培养病毒并制备提取病毒基因组DNA。将纯化的17+hTERTpICP4d34.5重组病毒DNA与pdICP47PSMApGFP质粒DNA一起转染BHK细胞，17+hTERTpICP4d34.5上的ICP47位点经重组后被剔除，得到17+hTERTpICP4PSMApGFP重组病毒。此轮重组病毒形成的病毒噬斑发绿色荧光，故挑选发绿色荧光的病毒斑，经5次的挑斑纯化，然后进行重组病毒的培养及病毒DNA的提取。
实施例4：单纯疱疹病毒17+hTERTpICP4PSMApGFP与17+hTERTpICP4-d34.5-GFP的 比较
分别将肺癌A549细胞及前列腺癌PC-3细胞培养至对数生长期，生长状态良好时，用胰酶将其消化制成单细胞悬液，800rpm-1000rpm(120g-190g)离心5分钟，完成后在弃掉上清，加入适量含10％FBS的RPMI培养基重悬细胞并计数。
分别将1x106的上述细胞加入六孔板中，放置于CO2培养箱培养12小时，至细胞完全贴壁。
分别用17+hTERTpICP4d34.5GFP与17+hTERTpICP4PSMApGFP病毒，按照MOI＝1:1的比例(即加入1x106PFU的上述病毒)，加入上述细胞系中，分别于不同时间点在荧光显微镜下观察GFP的表达状态。
结果显示：17+hTERTpICP4d34.5GFP与17+hTERTpICP4PSMApGFP两种病毒，都可与24小时后在前列腺癌PC-3细胞系中表达GFP达到示踪目的，而在肺癌A549细胞中，只有17+hTERTpICP4d34.5GFP可以表达GFP达到示踪目的，17+hTERTpICP4PSMApGFP并不表达GFP。结果提示我们，17+hTERTpICP4d34.5GFP对于肿瘤细胞的示踪具有广谱性，而17+hTERTpICP4PSMApGFP则只能示踪前列腺癌细胞，其示踪性具有肿瘤瘤种的特异性。
实施例5：试剂盒以及性能分析
材料和方法
表4试剂盒组成
表5试剂盒使用仪器
表6试剂盒原料及试剂
名称 生产厂家
CD45抗体 ebioscience
PSMA抗体 ebioscience
KHCO<sub>3</sub> 国药集团化学试剂有限公司
NH<sub>4</sub>CL 国药集团化学试剂有限公司
EDTA-Na<sub>2</sub> 国药集团化学试剂有限公司
KCl 国药集团化学试剂有限公司
NaCl 国药集团化学试剂有限公司
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 国药集团化学试剂有限公司
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 国药集团化学试剂有限公司
洗涤液配制方式：
称7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，1.8g K2HPO4，调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。
红细胞裂解液配制方式：
KHCO31.0g，NH4CL8.3g，EDTA-Na2 0.037g，调节溶液的pH值至7.2，最后加蒸馏水定容至1L。
表7RPMI-1640细胞培养基成分(配制时添加碳酸氢钠2000mg/L)
检测流程：
1.样品的收集：静脉取血4mL，至EDTA抗凝管中。
2.取出试剂盒A中除抗体以外的其他组分，在室温下平衡30分钟。
3.将血样700g离心5分钟，去掉血浆。
4.将去除血浆后的剩下的细胞全部转移至50ml离心管，加入裂解液(体积比1:12)，混匀静置10min。
5.500g离心5min，弃上清。
6.离心完成以后，将最上层的液体弃掉，用6mL洗涤液重悬细胞。
7.离心完成以后弃掉上清，用1mL无血清细胞培养液(1640培养基：培养基成分见表1)重悬洗涤细胞，轻轻混匀后700g离心5分钟。然后弃掉上清加入1mL细胞培养液(含有10％胎牛血清的1640培养基)重悬细胞。将1mL细胞悬液铺至六孔板。
8.转染：取出转染试剂(重组17+hTERTpICP4PSMApGFP病毒)，用移液器将转染试剂吹打几次混匀后，每孔100uL加入转染试剂感染细胞，轻轻晃匀。在37℃二氧化碳细胞培养箱(5％)中孵育1小时，然后每孔补加1mL完全细胞培养液。继续放置在细胞培养箱内孵育，16-24小时后收集细胞。
9.收集细胞：将六孔板中的细胞吹打吸至5mL离心管中，700g离心5分钟。
10.弃上清液，每支离心管加3mL洗涤液重悬洗涤细胞，700g离心5分钟。
11.抗体标记细胞。向细胞悬液中加入CD45抗体标记白细胞，加入PSMA抗体标记前列腺细胞。
12.洗涤，孵育完成后向离心管中加入3mL洗涤液混匀，700g离心5分钟。离心完成后弃掉上清，加0.5mL洗涤液重悬，确保细胞已经完全分散，无其它不溶杂物，再使用流式细胞分析仪检测CD45-/GFP+/PSMA+细胞。
试剂盒的性能分析
1.回收率
a)分别取50个阳性质控品细胞(LNCaP人源前列腺癌细胞系，购自北京协和细胞资源中心)和100个阳性质控品细胞加入到含2.5x106个白细胞(采集健康人外周血后分离的白细胞)的阴性参考品中，每个浓度的阳性质控品制备3个样品，为回收样本，每个样本测定1次。同法制备不加阳性质控品细胞的样品，作为基础样本，如上述用流式细胞分析仪回收CD45-/GFP+/PSMA+细胞。按照公式(1)计算回收率，回收率大于60％(流式检测细胞仪无特殊型号，具备双激光即可，488,640双激光管)。结果以体外模拟真实情况说明检测方式可行。该检测方式可以有效检测外周血循环肿瘤细胞。
b)对5份准确性临床样本(中国医学科学院肿瘤医院受诊前列腺癌癌症患者)，按照上文检测流程检测，结果为阳性。结果从临床角度判定检测方式可行。该检测方式可以有效检测外周血循环肿瘤细胞。
2.精密度
分别取阳性质控品细胞50个和100个加入到含2.5x106个白细胞的阴性参考品，进行检测，检测10次，分别计算10次检测到的阳性质控品细胞数的平均值(Mean)和标准差(SD)，按照公式(2)和(3)，计算变异系数(CV)，50个细胞，CV＝5％；100个细胞，CV＝6％，说明，该检测方法批间平行性较好，重复性较强，可以正确反应检测结果。
CV＝(SD/平均值)×100％.........................(3)
式中：
x为阳性质控品细胞数的检测值；
n为检测次数。
3.线性
将20个、50个、100个、150个和200个阳性质控品细胞分别加入到含2.5x106个白细胞的阴性参考品中检测，以阳性质控品细胞加入量(20、50、100、150和200)作为自变量，阳性质控品细胞检测结果均值为因变量进行线性拟合，相关系数不低于0.9500。该结果显示，该检测方式回收率有很好的线性结果，检测回收率具有很高的稳定性，样本检测结果稳定性高。
表8检测结果判读：
检测结果 参考区间 结果判定
CD45(-)/GFP(+)/PSMA(+)细胞数 >0 阳性
CD45(-)/GFP(+)/PSMA(+)细胞数 ＝0 阴性
实施例6：用试剂盒对健康志愿者和前列腺癌患者的检测
1.使用试剂盒对100个健康志愿者的血液样品进行研究，如下表：
表9：循环肿瘤细胞(CTC)检测结果
对健康人检测值均为0，证明该检测试剂盒假阳性率极低。
2.本试剂盒对50个前列腺癌患者的血液样品进行研究，如下表：
表10：循环肿瘤细胞(CTC)检测结果
对前列腺癌患者均值为2.3，检出数值区间为0-8不包含0。
3.灵敏度特异性分析
对上述健康人群及前列腺癌患者检测结果进行ROC分析，分析结果如图5：
图5结果显示当检测值>0时，检测的敏感度为80％，特异性为100％。图中的直线代表健康人群的测定结果，折线代表前列腺癌患者检测结果。
4.检测方法线性分析：
对检测方法进行线性分析，将20个、50个、100个、150个、200个阳性质控品细胞分别加入到含2.5x106个白细胞的阴性参考品中检测，分析结果如图2：
线性范围检测结果，20个细胞检测结果为11和12个；50个细胞检测结果为25和34个；100个细胞检测结果为57和49个；150个细胞检测结果为90和82个；200个细胞检测结果为122和122个。结果说明该检测方式检测结果稳定，检测线性范围较宽，具有很好的检测效能。
实施例7：CD45-/GFP+双标记或金标准病理学与CD45-/GFP+/PSMA+三标记检测方法的比较
三标记及双标记实验流程:(病理学诊断方式为病理活检结果报告)
1.样品的收集：静脉取血4mL，至EDTA抗凝管中。
2.取出试剂盒A中除抗体以外的其他组分，在室温下平衡30分钟。
3.将血样700g离心5分钟，去掉血浆。
4.将去除血浆后的剩下的细胞全部转移至50ml离心管，加入裂解液(体积比1:12)，混匀静置10min。
5.500g离心5min，弃上清。
6.离心完成以后，将最上层的液体弃掉，用6mL洗涤液重悬细胞。
7.离心完成以后弃掉上清，用1mL无血清细胞培养液(1640培养基：培养基成分见表1)重悬洗涤细胞，轻轻混匀后700g离心5分钟。然后弃掉上清加入1mL细胞培养液(含有10％胎牛血清的1640培养基)重悬细胞。将1mL细胞悬液铺至六孔板。
8.转染：取出转染试剂(重组17+hTERTpICP4PSMApGFP病毒)，用移液器将转染试剂吹打几次混匀后，每孔100uL加入转染试剂感染细胞，轻轻晃匀。在37℃二氧化碳细胞培养箱(5％)中孵育1小时，然后每孔补加1mL完全细胞培养液。继续放置在细胞培养箱内孵育，16-24小时后收集细胞。
9.收集细胞：将六孔板中的细胞吹打吸至5mL离心管中，700g离心5分钟。
10.弃上清液，每支离心管加3mL洗涤液重悬洗涤细胞，700g离心5分钟。
11.抗体标记细胞。向细胞悬液中加入CD45抗体标记白细胞，加入PSMA抗体标记前列腺细胞(对于双标记法缺乏步骤8中的转染步骤)。
12.洗涤，孵育完成后向离心管中加入3mL洗涤液混匀，700g离心5分钟。离心完成后弃掉上清，加0.5mL洗涤液重悬，确保细胞已经完全分散，无其它不溶杂物，再使用流式细胞分析仪检测CD45-/GFP+/PSMA+细胞及CD45-/GFP+细胞(图9中Q2为CD45-/GFP+/PSMA+细胞，Q2+Q3为CD45-/GFP+细胞)。
以20名健康志愿者的样品及20名前列腺癌患者(表11)的样品进行检测对比研究，分别统计检测的CD45-/GFP+/PSMA+细胞及CD45-/GFP+细胞个数，并进行ROC分析(图10)，分析结果如表12所示，在特异性为100％的情况下，CD45-/GFP+/PSMA+细胞个数为2的时候即可到达，同时检测灵敏度在85％，而CD45-/GFP+细胞个数为4的时候才可保证特异性为100％，同时检测灵敏度为70％。说明相同特异性的检测效能下，本发明的三标记检测方法有更低的检测阈值，即检测的敏感度更高。
1.相同特异性的检测效能下，本发明的三标记检测方法有更低的检测阈值，即检测的敏感度更高。
以前列腺癌患者检测结果为例，其中Q2为CD45-/GFP+/PSMA+细胞，其细胞数为3，Q2+Q3为CD45-/GFP+细胞，其细胞数为5，显示三标记具有更高的灵敏度。
2.对比CD45-/GFP+/PSMA+三标记检测方法与金标准病理学的匹配比较。结果显示，三标记方法检测CTC与病理学检测结果一致性可以达到100％，可以有效地区分癌与非癌前列腺结节。单独使用PSMA检测CTC，其检测结果与病理学比较，阳性率只有40％左右，不能有效区分癌与非癌前列腺结节。
表11：20名健康志愿者的样品及20名前列腺癌患者的样品检测结果
表12：双标法和三标法检测灵敏度和特异性
实施例8：17+hTERTpICP4PSMApGFP和17+hTERTpICP4-d34.5-GFP在三标记法中的 性能检测
1.分别取10个阳性质控品细胞(LNCap人源前列腺癌细胞系，购自北京协和细胞资源中心)加入到含2.5x106个白细胞(采集健康人外周血后分离的白细胞)的阴性参考品中。
2.按照三标记法的检测流程进行检测，分为两个实验组别，转染试剂分别为17+hTERTpICP4PSMApGFP和17+hTERTpICP4-d34.5-GFP。
3.对比17+hTERTpICP4PSMApGFP和17+hTERTpICP4-d34.5-GFP用三标记法检测前列腺癌细胞的能力。
4.如图11和12中显示，用三标记法检测前列腺癌细胞17+hTERTpICP4PSMApGFP比17+hTERTpICP4-d34.5-GFP(在图中显示为oHSV1-hTERTp-eGFP)的检测，细胞回收率更高，10个阳性质控品细胞17+hTERTpICP4PSMApGFP检测率为80％，17+hTERTpICP4-d34.5-GFP检测率为60％。17+hTERTpICP4PSMApGFP相对于17+hTERTpICP4-d34.5-GFP在灵敏度上要更高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 重庆点检生物科技有限公司
<120> 重组单纯疱疹病毒、试剂盒及其用途
<130> C18P2838
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 475
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
tcgcgagttt aaactggccc ctccctcggg ttaccccaca gcctaggccg attcgacctc 60
tctccgctgg ggccctcgct ggcgtccctg caccctggga gcgcgagcgg cgcgcgggcg 120
gggaagcgcg gcccagaccc ccgggtccgc ccggagcagc tgcgctgtcg gggccaggcc 180
gggctcccag tggattcgcg ggcacagacg cccaggaccg cgctccccac gtggcggagg 240
gactggggac ccgggcaccc gtcctgcccc ttcaccttcc agctccgcct cctccgcgcg 300
gaccccgccc cgtcccgacc cctcccgggt ccccggccca gccccctccg ggccctccca 360
gcccctcccc ttcctttccg cggccccgcc ctctcctcgc ggcgcgagtt tcaggcagcg 420
ctgcgtcctg ctgcgcacgt gggaagccct ggccccggcc acccccgcga agctt 475
<210> 2
<211> 1570
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
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gtgctcttta aatattagtc actattatta gccatctctg attagatttg acaataggaa 120
cattaggaaa gatatagtac attcaggatt ttgttagaaa gagatgaaga aattcccttc 180
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catctttttc cacttaactc atactgtgct ctccctttct caaagcaaac tgtttgctat 360
tccttgaata cactctgagt tttctgcctt tgcctactca gctggcccat ggcccctaat 420
gtttcttctc atctccactg ggtcaaatcc tacctgtacc ttatggttct gttaaaagca 480
gtgcttccat aaagtactcc tagcaaatgc acggcctctc tcacggatta taagaacaca 540
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gattctcctg cctcagcctc ctgagtagct gggactacag gagcccgcca ccacgcccag 960
ctaatttttg tatttttagt agagatgggg tttcaccatg ttggccagga tggtctcgat 1020
ttctcgactt cgtgatccgc ctgtctgggc ctcccaaagt gctgggatta caggcgtgag 1080
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gtttattaat aacaataata ttctttagga aaaagggcgc ggtggtgatt tacactgatg 1200
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gagtattgta gagattgtat agaatttcag agttgaataa aagttcctca taattatagg 1320
agtggagaga ggagagtctc tttcttcctt tcatttttat atttaagcaa gagctggaca 1380
ttttccaaga aagttttttt tttttaaggc gcctctcaaa aggggccgga tttccttctc 1440
ctggaggcag atgttgcctc tctctctcgc tcggattggt tcagtgcact ctagaaacac 1500
tgctgtggtg gagaaactgg accccaggtc tggagcgaat tccagcctgc agggctgata 1560
agcgaggcat 1570

Claims (10)

1.重组单纯疱疹病毒，所述重组单纯疱疹病毒是含有感染细胞蛋白4(infected cellprotein 4,ICP 4)基因的单纯疱疹病毒基因组中的ICP4基因启动子替换为人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp的单纯疱疹病毒，优选17+单纯疱疹病毒毒株；或者以保藏编号CGMCCNO.6397保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的重组单纯疱疹病毒，
其中在病毒基因组中的除ICP4以外的基因中插入受前列腺特异性膜抗原启动子(PSMAp)控制的产生可检测光的蛋白质基因的表达盒。
2.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述重组单纯疱疹病毒的ICP 47基因是删除的，并且受前列腺特异性膜抗原启动子(PSMAp)控制的产生可检测光的蛋白质基因的表达盒插入删除的ICP 47基因位置。
3.根据权利要求1或2所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述重组单纯疱疹病毒的ICP34.5基因是删除的。
4.根据前述权利要求中任一项所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述产生可检测光的蛋白质是绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白和/或青色荧光蛋白；优选地，所述前列腺特异性膜抗原启动子包含以SEQ ID NO.1所示的序列。
5.根据前述权利要求中任一项所述的重组单纯疱疹病毒，其中ICP 4基因中与17+单纯疱疹病毒毒株的127235-131131对应的位置是删除的，并且人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp插入相应的位置中；
且ICP 47基因中与17+单纯疱疹病毒毒株的145316-145582对应的位置是删除的，并且所述表达盒插入删除的位置中；
优选地，ICP 34.5基因中与17+单纯疱疹病毒毒株的513-1259和/或125115-125861对应的位置是删除的。
6.用于检测受试者中的循环前列腺癌细胞的试剂盒，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的重组单纯疱疹病毒、以及任选地检测白细胞表面抗原的试剂和检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂；
其中任选地，所述试剂盒包含红细胞裂解液、洗涤液和/或转染试剂；
其中优选地，所述检测白细胞表面抗原的试剂和/或所述检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂是标记的，优选地所述检测白细胞表面抗原的试剂和/或所述检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂是抗体；
优选地，用不同的可检测标记物标记所述检测白细胞表面抗原的试剂和/或所述检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述可检测标记物选自PE、APC、PE-CY5、PerCP-CY5.5、FITC、PerCP、CY-7、APC-CY7、eFluor/Super Bright系列荧光染料和Alexa Fluor系列荧光染料。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述白细胞表面抗原是CD45分子和/或所述循环前列腺癌细胞表面抗原是PSMA。
9.试剂在制备用于检测受试者中的循环前列腺癌细胞的试剂盒中的用途，其中所述试剂是根据权利要求1-5中任一项所述的重组单纯疱疹病毒或者包含根据权利要求1-5中任一项所述的重组单纯疱疹病毒、检测白细胞表面抗原的试剂和检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂，任选包含红细胞裂解液、洗涤液和/或转染试剂，其中优选地，所述检测白细胞表面抗原的试剂和/或所述检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂是标记的，优选地所述检测白细胞表面抗原的试剂和/或所述检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂是抗体；
优选地，用不同的可检测标记物标记所述检测白细胞表面抗原的试剂和/或所述检测循环前列腺癌细胞表面抗原的试剂；所述可检测标记物选自PE、APC、PE-CY5、PerCP-CY5.5、FITC、PerCP、CY-7、APC-CY7、eFluor/Super Bright系列荧光染料、和Alexa Fluor系列荧光染料。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述白细胞表面抗原是CD45分子和/或所述循环前列腺癌细胞表面抗原是PSMA。
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