CN108977529A - 一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒，所述试剂盒包括：用于检测TRECs基因的上游引物、下游引物和探针，用于检测KRECs基因的上游引物、下游引物和探针，及用于检测内参基因TRAC的上游引物、下游引物和探针。本发明仅需打孔钻取一片直径3mm的圆形干血片(约3μl的血量)提取DNA即可完成该项目的检测，用血量很少，非常适合不宜大量取血的新生儿筛查。本发明采用两轮顺序检测的策略，在第一轮检测中只需要单孔进行TRECs和KRECs基因拷贝数的同步检测，两者互为质控参考指标。只有当TRECs和KRECs基因拷贝数同时低于设定阈值时，需要进行第二轮内参基因TRAC的拷贝数检测，确定是否为样本质量问题导致的检测失控。

Description

一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检 测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体是涉及一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒及其在重症联合免疫缺陷病和无丙种球蛋白血症筛查中的应用。
背景技术
重症联合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency disease,SCID)是联合免疫缺陷病中最严重的类型，患者常常在出生后1年内死亡。根据国外大范围筛查得出SCID的发生率约为1/58000活产新生儿，显著高于以往认为的1/100000。SCID是由多种遗传因素引起的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞数量缺乏和(或)功能障碍，导致体液免疫、细胞免疫同时存在严重缺陷，这种原发性免疫缺陷常被定义为初始T细胞缺乏。不经治疗，SCID的病死率为100％。目前常用的治疗方法为造血干细胞移植(hematopoietic stem celltransplantation,HSCT)、基因治疗(gene therapy,GT)或酶替代治疗(enzymereplacement therapy,ERT)进行免疫重建。Pai等通过随访240例移植后的SCID患者，认为<3.5月龄的SCID患者移植的存活率显著高于>3.5月龄或继发感染的患儿，且移植后的存活率主要与患儿有无感染相关，与移植物的来源无明显关联。因此，对SCID患者进行早期诊断及早期治疗，可显著改善患儿的预后。
SCID患儿多数存在T细胞缺乏，因此淋巴细胞绝对计数可作为SCID的筛查手段之一。Chan和Puck在2005年首先报道了采用定量PCR方法检测T细胞受体切除环(T－cellreceptor excision circles,TRECs)。TRECs是TCR形成过程中产生的无功能的DNA片段，约70％的αβTCR在生成过程中可同时生成TRECs，这些DNA片段不随T细胞的分裂而复制，稳定存在于细胞内，因此TRECs定量可以间接反映胸腺输出的初始T淋巴细胞数量。若TRECs减少或缺失，则高度怀疑SCID，进一步进行流式细胞及基因诊断确诊。通过TRECs筛查SCID可以与其他新生儿常规筛查项目共用干血纸片，有利于该筛查方法的正式大范围推广。除了SCID外，TRECs检测还能发现包括21三体、DiGeorge综合征、特发性T淋巴细胞减少症等其他引起T淋巴细胞计数严重减少的疾病。
TRECs检测价格便宜，包括设备、劳务和试剂等所需要的费用约为4.25美元/婴儿，与其他筛查项目价格相当或更低；方法高度敏感、特异，筛选试验的灵敏度接近100％，可有效检出SCID患儿；因此采用TRECs进行SCID新生儿筛查可有效应用到公共卫生事业，被认为是美国"国家标准的新生儿筛查项目"。
一些非特异、表现延迟的SCID患者出生时仅通过TRECs检测可能遗漏，需要K－删除重组切除环等其他检测手段协诊。KRECs是B细胞成熟过程中，编码B细胞受体基因重排时产生的非复制的小片段DNA产物，可以作为伴有B细胞数量减少的B淋巴细胞免疫缺陷的筛查方法。例如延迟性ADA患者中，T细胞分裂可能对有毒代谢产物增加的耐受性较好，而B细胞则更容易裂解，KRECs有利于此类患者的早期发现；KRECs在X－连锁无丙种球蛋白血症(XLA)的筛查中也发挥着重要作用。理想情况下，应该联合TRECs－KRECs进行新生儿免疫缺陷的筛查。
据估计，SCID和无丙种球蛋白血症共同的发病率为1/50000～1/30000，同时检测TRECs及KRECs不仅可扩大疾病筛查谱，而且整体上可以提高新生儿疾病筛查的成本效益。法国一项研究对2006年至2010年的SCID筛查成本分析显示，SCID的早期检出可以使每例患者的治疗成本降低50000～100000欧元；假设测试的单位成本为5欧元，SCID收支平衡所需的疾病发生率约为1/20000；然而一旦3月龄内进行干细胞移植的生存优势被证实，人群大范围疾病筛查可以明显节省成本。最重要的是，SCID病例出生后的检出允许患儿及时得到治疗，避免了并发症出现后长期、昂贵的重症监护和显著增加的医疗成本。早期筛查可提高治愈率，大大改善了生活质量，降低了社会负担，尽早识别SCID显得至关重要。
数字PCR是普通PCR、荧光定量PCR技术后的第三代PCR技术。ddPCR指微滴式数字PCR，是当前最主流的数字PCR技术。ddPCR系统结合了油包水乳化微滴技术与微流体技术。首先在微滴生成器上将每个样品生成20000个均一的纳升级微滴，目的片段和背景序列在微滴中随机分布，每个微滴都是一个独立的反应器。随后微滴被转移到96孔PCR板中，在普通PCR仪上完成扩增。PCR扩增后，用微滴分析仪对微滴逐个进行荧光检测。相比于阴性微滴，包含至少一个目标DNA或RNA分子的阳性微滴的荧光信号强度增加。最后根据泊松分布，通过阳性微滴的比例给出目标分子的绝对拷贝数。数字PCR方法具有灵敏度超高、准确性高、可绝对定量及对复杂样本适应性好，对PCR抑制物相对耐受等优点。
申请号为201210470713.5的中国专利申请提供了定量检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒以及应用。该专利采用包括巢式PCR扩增和实时荧光定量PCR扩增的两步法，操作复杂繁琐、耗时长，巢式PCR带来的扩增误差、巢式PCR之后的移液操作带来的样本污染，诸多环节累计的误差最终导致漏检的可能性大。同时，实时荧光定量扩增法主要通过标准质控品的曲线对目标序列拷贝数进行相对定量，其检测结果的准确性和稳定性受标准品影响较大，最终导致较高的假阳性和假阴性。在筛查过程中如发生漏检，患儿将错过最佳诊断和治疗时机。
针对上述问题，尤其是两步法漏检阳性样本可能性较大及荧光定量PCR无法绝对定量的问题，本发明的目的在于提供一种能减少扩增误差和样品污染，具有更高灵敏度和特异性，能够对目标序列进行拷贝数绝对定量，同时操作简便快速的TRECs和KRECs基因检测试剂盒。传统的检测方法通常需要同步进行两个反应孔的检测，本发明改进了检测流程，采用两轮顺序检测的策略，在第一轮检测中只需要单孔进行TRECs和KRECs基因拷贝数的同步检测，两者互为质控参考指标。只有当TRECs和KRECs基因拷贝数同时低于设定阈值时，需要进行第二轮内参基因TRAC的拷贝数检测，确定是否为样本质量问题导致的检测失控。由于本试剂盒涉及罕见遗传病的筛查检测，在实际应用中，绝大部分样本都为阴性结果，仅需第一轮单孔即可完成检测，因此能显著减少临床检测成本及工作量，有利于实际应用。本发明提供的TRECs和KRECs基因检测试剂盒，其特征在于操作简便、耗时短、成本低、绝对定量，实验结果准确可靠，有利于实际应用。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足，本发明的主要目的是提供一种利用数字PCR技术检测新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供上述新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒在重症联合免疫缺陷病和无丙种球蛋白血症筛查中的应用。
本发明的第一个方面，提供了一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒，所述的试剂盒包括：用于检测TRECs基因的上游引物、下游引物和TRECs基因检测探针，用于检测KRECs基因的上游引物、下游引物和KRECs基因检测探针，及用于检测内参基因TRAC的上游引物、下游引物和内参基因TRAC检测探针。
进一步地，其中所述上游引物和下游引物的含量分别为400～1000nM，优选为900nM；所述TRECs基因检测探针、KRECs基因检测探针、内参基因TRAC检测探针的含量分别为200～400nM，优选为250nM。
进一步地，其中所述用于检测TRECs基因的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，所述TRECs基因检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；所述用于检测KRECs基因的上游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，所述KRECs基因检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述用于检测内参TRAC基因的上游引物的序列如SEQ ID NO:7所示，其下游引物的序列如SEQID NO:8所示，所述内参基因TRAC检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
进一步地，其中所述TRECs基因检测探针、KRECs基因检测探针、内参基因TRAC检测探针均为Taqman探针，所述TRECs基因检测探针标记的5’端为FAM荧光基团，3’端为BHQ1淬灭基团；所述KRECs基因检测探针标记的5’端为HEX荧光基团，3’端为BHQ1淬灭基团；所述内参基因TRAC检测探针标记的5’端为FAM荧光基团，3’端为BHQ1淬灭基团。
进一步地，所述试剂盒中还含有通用型2X ddPCR扩增预混液和使用说明书。
本发明的第二个方面，提供了一种如本发明第一个方面所述的试剂盒的用途，包括(a)用于检测或初步判断新生儿是否存在重症联合免疫缺陷病；(b)用于检测或初步判断新生儿是否存在无丙种球蛋白血症。
进一步地，所述试剂盒的应用，包括第一轮检测和第二轮检测，分别包括以下步骤：
一、第一轮检测
1)提取待检干血片样本的DNA；
2)以步骤1)得到的DNA为模板，将待测的该DNA模板、用于检测TRECs基因的上下游引物、TRECs基因检测探针、用于检测KRECs基因的上下游引物、KRECs基因检测探针以及2XddPCR扩增预混液混合，制备ddPCR混合液I；
3)使用ddPCR混合液I制作ddPCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；
4)PCR扩增反应后的产物使用微滴读取仪进行信号收集，根据荧光信号类型判读待测样品中含有TRECs基因和KRECs基因的拷贝数，并统一换算至copies/μl blood；
5)根据样本检测结果，判断是否进行第二轮检测。只有当TRECs和KRECs基因的拷贝数均低于设定阈值时，继续进行第二轮内参基因TRAC的检测；其它情况时检测结束，第二轮检测无需进行。
二、第二轮检测
6)以步骤1)得到的DNA为模板，将待测的该DNA模板、用于检测TRAC基因的上下游引物、TRAC基因检测探针以及2X ddPCR扩增预混液混合，制备ddPCR混合液II；
7)使用ddPCR混合液II制作ddPCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；
8)PCR扩增反应后的产物使用微滴读取仪进行信号收集，根据荧光信号类型判读待测样品中含有TRAC基因的拷贝数，并统一换算至copies/μl blood。
进一步地，所述ddPCR混合液I和ddPCR混合液II中DNA模板的体积为2～8μl。
更进一步地，所述ddPCR混合液I和ddPCR混合液II中DNA模板的体积为5μl。
进一步地，所述ddPCR混合液I和ddPCR混合液II中用于检测TRECs基因、KRECs基因或TRAC基因的上游引物和下游引物的含量均为400～1000nM，TRECs基因检测探针、KRECs基因检测探针或内参基因TRAC检测探针的含量均为200～400nM。
更进一步地，所述ddPCR混合液I和ddPCR混合液II中用于检测TRECs基因、KRECs基因或TRAC基因上游引物和下游引物的含量均为900nM，TRECs基因检测探针、KRECs基因检测探针或内参基因TRAC检测探针含量均为250nM。
进一步地，步骤3)和步骤7)中，使用所述ddPCR混合液I和ddPCR混合液II制作ddPCR微反应液滴的方法为：将ddPCR混合液I和ddPCR混合液II加入微滴发生器，生成10000-20000个微反应液滴。
进一步地，步骤3)和步骤7)中，所述PCR扩增反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟；93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环；95-98℃酶失活10分钟；2-12℃终止反应。
更进一步地，步骤3)和步骤7)中，所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，60℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环；98℃酶失活10分钟；12℃终止反应。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明的引物和探针的设计特异性强，应用于ddPCR检测时灵敏度高(样本中含有一个目的基因TRECs或KRECs时即可检出)，避免产生假阴性结果；
(2)本发明仅需打孔钻取一片直径3mm的圆形干血片(约3μl的血量)提取DNA即可完成该项目的检测，用血量很少，非常适合不宜大量取血的新生儿筛查。
(3)本发明的方法对模板中所含的蛋白质、多糖、盐离子残留等的耐受性强，结果重复性高，稳定性好。
(4)本发明的方法中采用两轮顺序检测的策略，在第一轮检测中单孔同时检测两个基因TRECs和KRECs的拷贝数，当两个基因拷贝数都低于检测阈值时，补充内参基因TRAC检测，确定样本质量是否达标；该方法改进了检测流程，操作过程更加简便。由于本发明的应用方向为罕见遗传病的筛查，绝大部分的待检样本预期均仅需要一轮检测，本发明方法大大减少了临床检测成本及工作量，有利于实际应用。
附图说明
图1为实施例中空白对照品的TRECs和KRECs基因ddPCR检测二维分析图；
图2为实施例中空白对照品的TRAC基因ddPCR检测二维分析图；
图3为本发明正常样本的TRECs和KRECs基因检测结果参考值图；
图4为本发明方法的检测流程示意图；
图5为实施例中样本1的TRECs和KRECs基因ddPCR检测二维分析图；
图6为实施例中样本2的TRECs和KRECs基因ddPCR检测二维分析图；
图7为实施例中样本3的TRECs和KRECs基因ddPCR检测二维分析图；
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的精神和范围之内。
以下材料或试剂，除非特别说明，均为市售。
实施例1：ddPCR技术检测TRECs基因、KRECs基因、及内参基因TRAC拷贝数的引物和探针的设计与合成
针对TRECs基因、KRECs基因、及内参基因TRAC基因，以UCSC的基因序列为来源，使用Primer 3.0软件设计PCR引物和Taqman探针，从中选择最佳组合如下：
用于检测TRECs基因的上、下游引物：
上游引物SEQ ID NO:1：5’-CCATGCTGACACCTCTGGTT-3’
下游引物SEQ ID NO:2：5’-TCGTGAGAACGGTGAATGAAG-3’
利用上述的引物进行PCR扩增时，扩增片段为138bp；
用于检测KRECs基因的上、下游引物：
上游引物SEQ ID NO:4：5’-TCCCTTAGTGGCATTATTTGTATCACT-3’
下游引物SEQ ID NO:5：5’-AGGAGCCAGCTCTTACCCTAGAGT-3’
利用上述的引物进行PCR扩增时，扩增片段为90bp；
用于检测TRAC基因的上、下游引物：
上游引物SEQ ID NO:7：5’-TGGCCTAACCCTGATCCTCTT-3’
下游引物SEQ ID NO:8：5’-GGATTTAGAGTCTCTCAGCTGGTACAC-3’
利用上述的引物进行PCR扩增时，扩增片段为80bp；
设计的基因检测探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团，其序列如下：
TRECs基因检测探针为SEQ ID NO:3：5’-FAM-CACGGTGATGCATAGGCACCTGC-BHQ1-3’
KRECs基因检测探针为SEQ ID NO:6：5’-HEX-TCTGCACGGGCAGCAGGTTGG-BHQ1-3’
内参基因TRAC检测探针为SEQ ID NO:9：5’-FAM-TCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCC-BHQ1-3’
本发明的引物和探针的设计特异性强，应用于ddPCR检测时灵敏度高，能从DNA中检测到低丰度的目的基因，对于新生儿SCID和XLA的判断有重要作用；本实施例中提供的引物和探针应用于SCID和XLA检测时能同时检测两种目的基因的拷贝数，大大降低临床检测成本及工作量。
实施例2：干血片样本中TRECs基因、KRECs基因、及内参基因TRAC拷贝数的检测
一、第一轮检测
(1)干血片DNA的提取：
A.使用洁净打孔器取直径3mm的待测干血片(本具体案例中由北京妇产医院赠与)，并放入1.5mlEP管，加入100μl含0.5％(V/V)Triton X-100的PBS(市售)，800rpm震荡10min，尽量吸去溶液；
B.加入100μl PBS(市售)，12000rpm离心1min，尽量吸去溶液；
C.加入100μl Generation DNA Elution Solu II(市售)，800rpm震荡10min，尽量吸去溶液；
D.加入30μl Generation DNA Elution Solu II，在99度水浴锅水浴30min后，12000rpm离心1min，转移溶液至新管保存。
(2)在PCR板中按照以下配比制备ddPCR混合液I：2X ddPCR扩增预混液10μl、用于检测TRECs基因的上下游引物(900nM)和TRECs基因检测探针(250nM)、用于检测KRECs基因的上下游引物(900nM)和KRECs基因检测探针(250nM)、与待测DNA模板(5μl)或空白对照品(5μl无核酸酶水)混合，用无核酸酶水补足至终体积20μl，配制成ddPCR混合液I。
(3)将配制好的20μl ddPCR混合液I加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内。在DG8 cartridge最底下一排8个孔中各加入70μl ddPCR微滴发生油，盖上胶垫，将DG8cartridge轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴。微滴生成于DG8 cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴转移至新的96孔PCR板中。
(4)将装有ddPCR微反应液滴的96孔PCR板用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。
(5)将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，60℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环；98℃酶失活10分钟；12℃终止反应。
(6)PCR扩增反应后将PCR反应板放置于ddPCR微反应液滴信号读取仪中进行信号收集，检测FAM和HEX的荧光信号。
(7)结果计算
用QuantaSoft软件进行数据分析，结果如图5、图6、图7所示。将待检样本进行ddPCR反应体系中基因拷贝数向每单位体积(μl)原始血液中基因拷贝数的换算，该步骤结果为最终的样本检测结果，用于样本结果判定。
待测样本的ddPCR反应体系中基因拷贝数向原始血液中基因拷贝数的换算公式如下：基因copies/μl blood＝(每个反应基因拷贝数/每个反应样本体积)*(样本洗脱体积/干血片含血量)。
在本实施例中，待检样本中DNA的提取采用一个直径3mm的干血片(约含3μl血量)，洗脱体积为30μl，每个反应样本体积为5μl，根据计算公式：基因copies/μl blood＝(每个反应基因拷贝数/5)*(30/3)＝每个反应基因拷贝数*2。
(8)质控标准
各类对照质控品判断结果如下表1所示：
表1质控品标准检测结果
空白对照品为市购的无菌的无核酸酶水。
图1为空白对照品TRECs和KRECs基因ddPCR检测二维分析图，相应基因拷贝数为0。
(9)结果判定
样本结果判定方式如下表2所示：
表2
样本1-3为三个有代表性的干血片样本(由北京妇产医院赠与)，其中1为健康儿童来源的干血片，2为经临床诊断确诊为SCID的儿童来源的干血片，3为经临床诊断确诊为XLA的儿童来源的干血片。
根据表2的样本检测结果，在第一轮检测时，样本1-3均未出现TRECs和KRECs基因拷贝数极低或未检出的情况(本实施例中指TRECs拷贝数小于10copies/μl blood，且KRECs拷贝数小于10copies/μl blood)，可直接进行结果判定，无需进行第二轮检测。
图3为本发明正常样本的TRECs和KRECs基因检测结果参考值图，横轴为原始血液中TRECs基因拷贝数，纵轴为原始血液中KRECs基因拷贝数，根据此图划定正常样本检测阈值线为TRECs拷贝数≥10copies/μl blood，KRECs拷贝数≥10copies/μl blood。根据划定的阈值线，得到四个象限。当样本检测结果落入左上角象限内，则该样本为SCID阳性；当样本检测结果落入右上角象限内，则该样本为正常样本；当样本检测结果落入左下角象限内，则增加第二轮内参基因TRAC的检测；当样本检测结果落入右下角象限内，则该样本为XLA阳性。
图4为本发明方法检测流程示意图，提取干血片DNA后，在第一轮检测中，单孔检测TRECs和KRECs，若两者均正常(本实施例中指TRECs拷贝数≥10copies/μl blood，且KRECs拷贝数≥10copies/μl blood)，判定为阴性；若KRECs正常(本实施例中指KRECs拷贝数≥10copies/μl blood)，TRECs极低或未检出(本实施例中指TRECs拷贝数小于10copies/μlblood)，判定SCID阳性；若TRECs正常(本实施例中指TRECs拷贝数≥10copies/μl blood)，KRECs极低或未检出(本实施例中指KRECs拷贝数小于10copies/μl blood)，判定XLA阳性；若TRECs和KRECs均极低或未检出(本实施例中指TRECs拷贝数小于10copies/μl blood，且KRECs拷贝数小于10copies/μl blood)，增加第二轮内参基因TRAC的检测。若内参基因TRAC正常(本实施例中指TRAC拷贝数≥5000copies/μl blood)，判定为阳性；若内参基因TRAC极低或未检出(本实施例中指TRAC拷贝数小于5000copies/μl blood)，则样本不合格，需重新提取样本DNA，重新进行检测。
图5为样本1的TRECs和KRECs基因ddPCR检测二维分析图，横轴为KRECs基因相关荧光通道强度，纵轴为TRECs基因相关荧光通道强度。根据空白对照品所得结果划定相应通道的阈值线，得到4个象限。左上角象限内的点表示TRECs阳性微滴，右下角象限内的点表示KRECs阳性微滴，经仪器自带软件进行计算后，定量结果是TRECs基因拷贝数为420copies/μl blood，KRECs基因拷贝数为120copies/μl blood，为SCID和XLA阴性样本。
图6为样本2的TRECs和KRECs基因ddPCR检测二维分析图，横轴为KRECs基因相关荧光通道强度，纵轴为TRECs基因相关荧光通道强度。根据空白对照品所得结果划定相应通道的阈值线，得到4个象限。右下角象限内的点表示KRECs阳性微滴，经仪器自带软件进行计算后，定量结果是TRECs基因拷贝数为0copies/μl blood，KRECs基因拷贝数为72copies/μlblood，为SCID阳性样本。
图7为样本3的TRECs和KRECs基因ddPCR检测二维分析图，横轴为KRECs基因相关荧光通道强度，纵轴为TRECs基因相关荧光通道强度。根据空白对照品所得结果划定相应通道的阈值线，得到4个象限。左上角象限内的点表示TRECs阳性微滴，经仪器自带软件进行计算后，定量结果是TRECs基因拷贝数为184copies/μl blood，KRECs基因拷贝数为0copies/μlblood，为XLA阳性样本。
二、第二轮检测
(10)在PCR板中按照以下配比制备ddPCR混合液II：2X ddPCR扩增预混液10μl、用于检测TRAC基因的上下游引物(900nM)和TRAC基因检测探针(250nM)、与待测DNA模板(5μl)或空白对照品(5μl无核酸酶水)混合，用无核酸酶水补足至终体积20μl，配制成ddPCR混合液II。
(11)将配制好的20μl ddPCR混合液II加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内。在DG8 cartridge最底下一排8个孔中各加入70μl ddPCR微滴发生油，盖上胶垫，将DG8cartridge轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴。微滴生成于DG8 cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴转移至新的96孔PCR板中。
(12)将装有ddPCR微反应液滴的96孔PCR板用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。
(13)将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，60℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环；98℃酶失活10分钟；12℃终止反应。
(14)PCR扩增反应后将PCR反应板放置于ddPCR微反应液滴信号读取仪中进行信号收集，检测FAM和HEX的荧光信号。
(15)结果计算
结果计算方法同步骤(7)所述。
(16)质控标准
对照质控品判断结果如下表3所示：
表3质控品标准检测结果
空白对照品为市购的无菌的无核酸酶水。
图2为空白对照品TRAC基因ddPCR检测二维分析图，TRAC基因的拷贝数为0。
(17)结果判定
在第二轮内参基因TRAC检测时，若内参基因TRAC正常(本实施例中指TRAC拷贝数≥5000copies/μl blood)，判定为阳性；若内参基因TRAC极低或未检出(本实施例中指TRAC拷贝数小于5000copies/μl blood)，则样本不合格，需重新提取样本DNA，重新进行检测。
本发明的试剂盒临床样本检测结果与该样本使用流式细胞仪检测样本血液中的T细胞、B细胞数量、基因测序结果及临床症状相一致，说明此方法结果可靠，灵敏度高，重复性好，为临床筛查新生儿SCID及XLA提供了有效的诊断手段。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 朱智；陈珺
<120> 一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒及其应用
<130> 20181042cn
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificially synthesized）
<400> 1
ccatgctgac acctctggtt 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificially synthesized）
<400> 2
tcgtgagaac ggtgaatgaa g 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificially synthesized）
<400> 3
cacggtgatg cataggcacc tgc 23
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificially synthesized）
<400> 4
tcccttagtg gcattatttg tatcact 27
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificially synthesized）
<400> 5
aggagccagc tcttacccta gagt 24
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificially synthesized）
<400> 6
tctgcacggg cagcaggttg g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificially synthesized）
<400> 7
tggcctaacc ctgatcctct t 21
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificially synthesized）
<400> 8
ggatttagag tctctcagct ggtacac 27
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificially synthesized）
<400> 9
tcccacagat atccagaacc ctgaccc 27

Claims (12)

1.一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：用于检测TRECs基因的上游引物、下游引物和探针，用于检测KRECs基因的上游引物、下游引物和探针，及用于检测内参基因TRAC的上游引物、下游引物和探针；所述上游引物和下游引物的含量分别为400～1000nM；所述TRECs基因检测探针、KRECs基因检测探针、内参基因TRAC检测探针的含量分别为200～400nM。
2.如权利要求1所述的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物和下游引物的含量分别为900nM；所述TRECs基因检测探针、KRECs基因检测探针、内参基因TRAC检测探针的含量分别为250nM。
3.如权利要求2所述的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于，所述用于检测TRECs基因的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，其下游引物的序列如SEQ IDNO:2所示，所述TRECs基因检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述用于检测KRECs基因的上游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，所述KRECs基因检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述用于检测内参TRAC基因的上游引物的序列如SEQ ID NO:7所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO:8所示，所述内参基因TRAC检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
4.如权利要求3所述的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于，所述TRECs基因检测探针、KRECs基因检测探针、内参基因TRAC检测探针均为Taqman探针，所述TRECs基因检测探针标记的5’端为FAM荧光基团，3’端为BHQ1淬灭基团；所述KRECs基因检测探针标记的5’端为HEX荧光基团，3’端为BHQ1淬灭基团；所述内参基因TRAC检测探针标记的5’端为FAM荧光基团，3’端为BHQ1淬灭基团。
5.如权利要求1所述的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有通用型2X ddPCR扩增预混液和使用说明书。
6.权利要求1-5任一项所述的试剂盒在重症联合免疫缺陷病和无丙种球蛋白血症筛查中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待检干血片样本的DNA；
2)以步骤1)得到的DNA为模板，将待测的该DNA模板、用于检测TRECs基因的上下游引物、TRECs基因检测探针、用于检测KRECs基因的上下游引物、KRECs基因检测探针以及2XddPCR扩增预混液混合，制备ddPCR混合液I；
3)使用ddPCR混合液I制作ddPCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；
4)PCR扩增反应后的产物使用微滴读取仪进行信号收集，根据荧光信号类型判读待测样品中含有TRECs基因和KRECs基因的拷贝数，并统一换算至copies/μl blood。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，当步骤4)中样本的检测结果显示：TRECs和KRECs基因的拷贝数均低于设定阈值时，步骤4)之后还包括以下步骤：
5)以步骤1)得到的DNA为模板，将待测的该DNA模板、用于检测TRAC基因的上下游引物、TRAC基因检测探针以及2X ddPCR扩增预混液混合，制备ddPCR混合液II；
6)使用ddPCR混合液II制作ddPCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；
7)PCR扩增反应后的产物使用微滴读取仪进行信号收集，根据荧光信号类型判读待测样品中含有TRAC基因的拷贝数，并统一换算至copies/μl blood。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述ddPCR混合液I和ddPCR混合液II中DNA模板的体积为2～8μl；优选地，所述ddPCR混合液I和ddPCR混合液II中DNA模板的体积为5μl。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述ddPCR混合液I和ddPCR混合液II中用于检测TRECs基因、KRECs基因或TRAC基因的上游引物和下游引物的含量均为400～1000nM，TRECs基因检测探针、KRECs基因检测探针或内参基因TRAC检测探针的含量均为200～400nM；
优选地，所述ddPCR混合液I和ddPCR混合液II中用于检测TRECs基因、KRECs基因或TRAC基因上游引物和下游引物的含量均为900nM，TRECs基因检测探针、KRECs基因检测探针或内参基因TRAC检测探针含量均为250nM。
11.如权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤3)和步骤6)中，使用所述ddPCR混合液I和ddPCR混合液II制作ddPCR微反应液滴的方法为：将ddPCR混合液I和ddPCR混合液II加入微滴发生器，生成10000-20000个微反应液滴。
12.如权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤3)和步骤6)中，PCR扩增反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟；93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环；95-98℃酶失活10分钟；2-12℃终止反应；
优选地，步骤3)和步骤6)中，PCR扩增反应条件为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，60℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环；98℃酶失活10分钟；12℃终止反应。
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