CN110408713A - 一种检测新生儿trec和krec的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒及方法，属于生物医学领域。该试剂盒包括PCR预混液、去离子水、标准品、TREC上游引物、TREC下游引物、KREC上游引物、KREC下游引物、RNase P上游引物、RNase P下游引物、TREC探针、KREC探针和RNase P探针。使用该试剂盒可以对新生儿DNA基因组中的TREC、KREC和RNase P同时进行检测，且具有性能优异、操作简单、灵敏度高、特异性强等特点，从而可以为TREC和KREC相关的免疫缺陷疾病的诊断提供参考依据，以及可以扩大新生儿疾病筛查谱和提高新生儿免疫缺陷筛查的成本效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及新生儿免疫缺陷筛查技术领域，特别是涉及一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒及方法。
背景技术
原发性免疫缺陷(Primary Immunodeficiency，PID)是一类罕见的免疫系统遗传病。单个基因的变异能够影响一个或者多个免疫成分，导致个体受感染的风险异常升高，通常伴随有免疫调节缺陷。重症联合免疫缺陷(Severe Combined Immunodeficiency，SCID)是PID中最严重的一类。据报道，SCID的发病率为1/50000-1/30000。如果不进行干细胞移植，SCID是致命的，患儿通常在出生后几年死亡。对新生儿早期开展SCID筛查与诊断，从而及时实施必要的临床干预措施，能够挽救患儿的生命。因此，开发灵敏而且高特异度的SCID筛查技术和试剂盒，能够为更多的PID患儿争取最佳治疗机会，具有重要的临床意义和社会价值。
T细胞受体删除环(T-cell Receptor Excision Circle，TREC)是T细胞受体形成过程中产生的无功能的环状脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)分子。这些DNA分子稳定地存在于T细胞内，对TREC进行定量检测，可以获得关于胸腺输出的初始T淋巴细胞数量信息，从而可对部分类型的SCID进行筛查，其特异度大于95％。由于TREC不随T细胞的分裂而复制，所以样本中TREC的拷贝数随着年龄的增长而逐步降低，因此，在新生儿早期开展TREC筛查的效果更好。
与TREC类似，在B细胞的早期成熟发育过程中可产生kappa切除重组删除环(kappa-deleting recombination excision circle，KREC)。KREC可以作为周围淋巴器官B细胞增殖的生物标志物。定量检测样本中KREC的含量，可以用于筛查一部分与B细胞发育相关的免疫缺陷。
另外，实时荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术基于荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)原理，实现了在PCR扩增过程中，报告基团荧光信号强度与扩增子拷贝数成比例地同步增长，从而能够对基因拷贝数进行精确定量。实时荧光定量PCR技术不仅灵敏度和特异性都相当高，而且全程闭管操作，无需开盖对PCR扩增产物进行额外的检验，从而避免了对于PCR检验实验室的潜在污染，特别适合临床检验实验室使用，是开展新生儿SCID筛查的理想技术。
因此，目前急需一种基于实时荧光定量PCR技术并用于同时检测TREC和KREC含量的试剂盒及方法，以扩大新生儿疾病筛查谱和提高新生儿免疫缺陷筛查的效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒及方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，包括PCR预混液、去离子水、TREC上游引物、TREC下游引物、KREC上游引物、KREC下游引物、TREC探针和KREC探针；所述TREC上游引物和TREC下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示；所述KREC上游引物和KREC下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示；所述TREC探针和KREC探针的寡核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No:3和SEQ ID No:6所示。
本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的试剂盒还包括用于扩增RNase P的RNase P上游引物、RNase P下游引物和RNase P探针。
本发明实施例提供的另一种优选方案，所述RNase P上游引物和RNase P下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示。
本发明实施例提供的另一种优选方案，所述RNase P探针的寡核苷酸序列如序列表SEQ ID No:9所示。
本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的PCR预混液包括DNA聚合酶、dNTP、缓冲液和ROX参比荧光。
本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的试剂盒还包括标准品，所述的标准品为含有TREC、KREC和RNase P基因片段的重组质粒。
本发明实施例提供的另一种优选方案，所述重组质粒的载体为pUC57质粒载体。
本发明实施例还提供了一种采用上述试剂盒进行检测新生儿TREC和KREC的方法，其包括以下步骤：
(1)取标准品进行稀释，得到若干组不同浓度梯度的标准品贮存液，备用；
(2)采集样本，并从样本中提取DNA，得到样本基因组，备用；
(3)将PCR预混液、TREC上游引物、TREC下游引物、KREC上游引物、KREC下游引物、RNase P上游引物、RNase P下游引物、TREC探针、KREC探针、RNase P探针和去离子水进行混合，得到PCR反应母液，备用；
(4)取上述标准品贮存液和PCR反应母液混合，用荧光定量PCR仪采集荧光信号，得到标准品的PCR扩增标准曲线；
(5)取上述样本基因组贮存液和PCR反应母液混合，用荧光定量PCR仪采集荧光信号，得到样本PCR扩增曲线；
(6)通过荧光定量PCR仪自带的软件，计算得到样本基因组中TREC和KREC的CT值；根据CT值的大小，判断样本基因组中TREC和KREC的阴阳性。
(7)与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：
(1)本发明实施例通过提供一种含有PCR预混液、标准品、TREC上游引物、TREC下游引物、KREC上游引物、KREC下游引物、RNase P上游引物、RNase P下游引物、TREC探针、KREC探针和RNase P探针等的试剂盒，可以对新生儿DNA基因组中的TREC、KREC和RNase P同时进行检测，且具有性能优异、操作简单、灵敏度高、特异性强等特点，从而可以为TREC和KREC相关的免疫缺陷疾病的诊断提供参考依据，以及可以扩大新生儿疾病筛查谱和提高新生儿免疫缺陷筛查的效益。
(2)另外，对于实时荧光定量PCR技术而言，由于其高度的灵敏性，样本用量的微小差异都会明显地体现在检验结果上。为了校正由于取样量差异所造成的影响，同时为判断实时荧光定量PCR检验是否成功提供一个客观的判断依据，本发明实施例在检测TREC和KREC含量的同时，还对核糖核酸酶P(Ribonuclease P，RNase P)一起进行定量检测，以作为检测TREC和KREC含量的内对照，从而可以保证检测结果更加准确和可靠。
附图说明
图1为实施例2得到的不同浓度梯度的标准品的PCR扩增标准曲线图(共8个标准品梯度，从左至右，浓度分别是6.7×107copies/μL、6.7×106copies/μL、6.7×105copies/μL、6.7×104copies/μL、6.7×103copies/μL、6.7×102copies/μL、6.7×101copies/μL、6.7copies/μL)
图2为实施例2得到的FAM通道的样本PCR扩增曲线和NTC PCR曲线图。
图3为实施例2得到的JOE通道的样本PCR扩增曲线和NTC PCR曲线图。
图4为实施例2得到的CY3通道的样本PCR扩增曲线和NTC PCR曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
该实施例提供了一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，其包括PCR预混液、去离子水、标准品、TREC上游引物、TREC下游引物、KREC上游引物、KREC下游引物、RNaseP上游引物、RNase P下游引物、TREC探针、KREC探针和RNase P探针等试剂。其中，除PCR预混液、去离子水和标准品外，其余试剂的摩尔浓度均为10μM。另外，根据实际检测情况，上述的TREC探针、KREC探针和RNase P探针的荧光报告基团可以选用FAM、TET、HEX、VIC、JOE、NED、ABY、CY3、JUN、Texas Red、LIZ和CY5中的一种，荧光淬灭基团可以选用BHQ系列、Dabcyl和Eclipse中的一种。
具体的，所述TREC上游引物的核苷酸序列为：5’-TTTCAACCATGCTGACACCT-3’(如序列表SEQ ID No:1所示)；所述TREC下游引物的核苷酸序列为：5’-CATCACCGTGCACAGGAG-3’(如序列表SEQ ID No:2所示)；所述的TREC探针包含一条寡核苷酸序列，其荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是BHQ系列，序列为：5’-FAM-TGGTTTTTGTAAAGGTGCCCA-BHQ1-3’(如序列表SEQ ID No:3所示)。
所述KREC上游引物的核苷酸序列为：5’-GGCATTATTTGTATCACTGTGCA-3’(如序列表SEQ ID No:4所示)；所述KREC下游引物的核苷酸序列为：5’-GAGCCAGCTCTTACCCTAGA-3’(如序列表SEQ ID No:5所示)；所述的KREC探针包含一条寡核苷酸序列，其荧光报告基团是JOE，荧光淬灭基团是BHQ系列，序列为：5’-JOE-CAGTGTGCGCTGCCAA-BHQ1-3’(如序列表SEQID No:6所示)。
所述RNase P上游引物的核苷酸序列为：5’-ATTGGGTTATGAGGTCCCCT-3’(如序列表SEQ ID No:7所示)；所述RNase P下游引物的核苷酸序列为：5’-GGAGCTTGGAACAGACTCAC-3’(如序列表SEQ ID No:8所示)；所述的RNase P探针包含一条寡核苷酸序列，其荧光报告基团是CY3，荧光淬灭基团是BHQ系列，序列为：5’-CY3-ACCTCAGCCATTGAACTCAC-BHQ2-3’(如序列表SEQ ID No:9所示)。
所述的标准品为含有TREC、KREC和RNase P基因片段的重组质粒。具体的，所述标准品的制备方法如下：先合成pUC57质粒载体，然后往pUC57质粒载体中分别插入1个拷贝数的有TREC、KREC和RNase P基因片段。
所述的PCR预混液为市售赛默飞世尔公司的TaqMan Universal Master MixⅡ，其包括DNA聚合酶、dNTP、缓冲液和ROX参比荧光。
实施例2
该实施例提供了一种采用上述试剂盒进行检测新生儿TREC和KREC的方法，具体的，包括以下步骤：
(1)先取实施例1中的标准品使用Qubit方法对标准品进行DNA浓度标定，其浓度为6.7×1010copies/μL；接着，将该标准品用TE缓冲液进行稀释100倍，得到浓度为6.7×108copies/μL的稀释液；然后，将稀释液继续用TE缓冲液依次进行10倍稀释，得到8组浓度分别为6.7×107copies/μL、6.7×106copies/μL、6.7×105copies/μL、6.7×104copies/μL、6.7×103copies/μL、6.7×102copies/μL、6.7×101copies/μL、6.7copies/μL的标准品贮存液，备用。
(2)采集5组新生儿干血片作为新生儿样本，采用市售凯杰痕量DNA提取试剂盒，按照以下步骤提取新生儿样本的DNA：
21、用单孔打孔机在新生儿干血片上打孔，取直径3mm的血片。将来自同一个样本的3张血片放入一个1.5mL离心管中；
22、在离心管中加入180μLATL缓冲液和20μL蛋白酶K，振荡混匀；将离心管置于金属浴，56℃保温1h，期间每隔10min振荡混匀10sec；
23、在离心管中加入200μL AL缓冲液，振荡混匀10sec；将离心管置于金属浴，70℃保温10min，期间每隔3min振荡混匀10sec；
24、把QIAamp吸附柱置于一个2mL收集管中，小心地将裂解液从离心管转移到QIAamp吸附柱中；盖上盖子，6000x g的离心力下离心1min；将QIAamp吸附柱转移到一个新的2mL收集管中，丢弃含有滤出液的原收集管；
25、小心打开QIAamp吸附柱，加入500μL AW1缓冲液，盖上盖子，6000x g的离心力下离心1min；将QIAamp吸附柱转移到一个新的2mL收集管中，丢弃含有滤出液的原收集管；
26、小心打开QIAamp吸附柱，加入500μL AW2缓冲液，盖上盖子，6000x g的离心力下离心1min，将QIAamp吸附柱转移到一个新的2mL收集管中，丢弃含有滤出液的原收集管；然后再20000x g的离心力下离心3min，去除残留的乙醇；
27、将QIAamp吸附柱转移到一个新的1.5mL离心管中，丢弃含有滤出液的收集管；小心地打开QIAamp吸附柱，加入60μL AE洗脱缓冲液；
28、室温放置1min，20000x g的离心力下离心1min，收集洗脱液，完成DNA的提取。
通过上述步骤可以得到5组样本基因组，用NanoDrop方法检测样本基因组的DNA浓度和纯度，经检测，5组样本基因组的DNA浓度均大于1ng/μL，OD260/280值均处于1.8-2.0之间，为合格样本，并分别记作#01、#02、#03、#04、#05，备用；其中，#01临床诊断为SCID患儿，其余4例均为正常；需要说明的是，新生儿样本也可以选用新生儿的外周血和新鲜冷冻组织；另外，若样本基因组的DNA浓度小于等于1ng/μL，或OD260/280值不在1.8-2.0之间，那么就需要重新取样，直至样本合格为止。
(3)按照下列的体积称取实施例1提供试剂盒中的试剂：PCR预混液25μL、TREC上游引物1μL、TREC下游引物1μL、KREC上游引物1μL、KREC下游引物1μL、RNase P上游引物1μL、RNase P下游引物1μL、TREC探针0.5μL、KREC探针0.5μL、RNase P探针0.5μL和去离子水12.5μL进行混合，得到PCR反应母液；按上述方法配制若干组PCR反应母液，备用。
(4)往荧光定量PCR仪的每个反应孔中添加45μL上述PCR反应母液中，然后分别在每个荧光定量PCR仪的反应孔内加入5μL上述8组不同浓度梯度的标准品贮存液，并分别在60℃下反应1min的阶段采集FAM、JOE和CY3通道的荧光信号，重复该步骤三次，得到不同浓度梯度的标准品的PCR扩增标准曲线，如附图1所示，共8个标准品梯度，从左至右，浓度分别是6.7×107copies/μL、6.7×106copies/μL、6.7×105copies/μL、6.7×104copies/μL、6.7×103copies/μL、6.7×102copies/μL、6.7×101copies/μL、6.7copies/μL。从中可见：浓度相同的标准品CT值相等，浓度相差10倍的标准品CT值相差3.3，FAM通道的扩增效率为94.4％，R2值为0.999；JOE通道的扩增效率为96.9％，R2值为0.999；CY3通道的扩增效率为97.3％，R2值为0.999，检测结果符合预期。需要说明的是，荧光定量PCR仪可选用市售的ABI7500型的实时荧光定量PCR仪，其反应程序如下：先50℃下反应2min，然后95℃下反应10min，再接着95℃下反应15sec，60℃下反应1min，按照这个条件进行40个循环。
(5)往荧光定量PCR仪的每个反应孔中添加45μL上述PCR反应母液中，然后分别在每个荧光定量PCR仪的反应孔内加入5μL上述5组样本基因组和1组5μL的去离子水，并分别在60℃下反应1min的阶段采集FAM、JOE和CY3通道的荧光信号，分别得到5组FAM、JOE和CY3通道的样本PCR扩增曲线和阴性对照(No Template Control，NTC)PCR曲线，具体可参照附图2-4。需要说明的是，该步骤中，荧光定量PCR仪的反应程序设定与步骤(4)的相同。
(6)通过荧光定量PCR仪自带的软件，计算得到样本基因组中TREC和KREC的CT值，具体的参考下表。其中，结果判读依据如下：RNase P的阳性判断值设置为32，TREC和KREC的阳性判断值设置为37。具体判断方法如下：如果CY3通道的CT-RNase P≤32，FAM通道的CT-TREC＞37，判定为TREC疑似阳性样本，如果CY3通道的CT-RNase P≤32，FAM通道的CT-TREC≤37，判定为TREC阴性(正常)样本；如果CY3通道的CT-RNase P≤32，JOE通道的CT-KREC＞37，判定为KREC疑似阳性样本，如果CY3通道的CT-RNase P≤32，JOE通道的CT-KREC≤37，判定为KREC阴性(正常)样本；如果CY3通道的CT-RNase P＞32，判断本次检验无效，，需要重新取样。如果NTC出现扩增曲线，判定本次实验存在污染，也需要重新检验。
表5组样本基因组中TREC、KREC和RNase P基因实时荧光定量PCR检测结果
| 样本编号 | C<sub>T-TREC</sub> | C<sub>T-KREC</sub> | C<sub>T-RNase</sub><sub>P</sub> | 结果判定 |
| #01 | Undermined | 31.48 | 24.21 | TREC阳性，KREC阴性 |
| #02 | 32.75 | 31.91 | 25.18 | TREC阴性，KREC阴性 |
| #03 | 32.08 | 31.45 | 24.27 | TREC阴性，KREC阴性 |
| #04 | 32.94 | 32.01 | 25.26 | TREC阴性，KREC阴性 |
| #05 | 31.92 | 31.45 | 24.54 | TREC阴性，KREC阴性 |
从上表可以知道，所有样本CY3通道的CT-RNase P≤32，样本合格。除#01的FAM通道未起峰(Undetermined)外，即大于37，其余样本及其余通道均测得不同大小的CT值；根据上述阳性判断值规则，#01判定为TREC阳性，其余的均为阴性样本，其检验结果与预期的一致。
综上所述，本发明实施例通过提供一种含有PCR预混液、标准品、TREC上游引物、TREC下游引物、KREC上游引物、KREC下游引物、RNase P上游引物、RNase P下游引物、TREC探针、KREC探针和RNase P探针等的试剂盒，可以对新生儿DNA基因组中的TREC、KREC和RNaseP同时进行检测，且具有性能优异、操作简单、灵敏度高、特异性强等特点，从而可以为TREC和KREC相关的免疫缺陷疾病的诊断提供参考依据，以及可以扩大新生儿疾病筛查谱和提高新生儿免疫缺陷筛查的效益。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
序列表
<110> 重庆医科大学附属儿童医院
阅尔基因技术（苏州）有限公司
<120> 一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒及方法
<150> 201910405084X
<151> 2019-05-16
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttcaaccat gctgacacct 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtttttgt aaaggtgccc a 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcattattt gtatcactgt gca 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagccagctc ttaccctaga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
attgggttat gaggtcccct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggagcttgga acagactcac 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catcaccgtg cacaggag 18
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagtgtgcgc tgccaa 16
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acctcagcca ttgaactcac 20
Claims (8)
1.一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，包括PCR预混液和去离子水，其特征在于，所述的试剂盒还包括TREC上游引物、TREC下游引物、KREC上游引物、KREC下游引物、TREC探针和KREC探针；所述TREC上游引物和TREC下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2所示；所述KREC上游引物和KREC下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQID No: 4和SEQ ID No: 5所示；所述TREC探针和KREC探针的寡核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 6所示。
2.根据权利要求1所述的一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括用于扩增RNase P的RNase P上游引物、RNase P下游引物和RNase P探针。
3.根据权利要求2所述的一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，其特征在于，所述RNase P上游引物和RNase P下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No: 7和SEQ IDNo: 8所示。
4.根据权利要求3所述的一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，其特征在于，所述RNase P探针的寡核苷酸序列如序列表SEQ ID No: 9所示。
5.根据权利要求1所述的一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，其特征在于，所述的PCR预混液包括DNA聚合酶、dNTP、缓冲液和ROX参比荧光。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括标准品，所述的标准品为含有TREC、KREC和RNase P基因片段的重组质粒。
7.根据权利要求6所述的一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pUC57质粒载体。
8.一种采用如权利要求1-7中任一项所述的试剂盒进行检测新生儿TREC和KREC的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取标准品进行稀释，得到若干组不同浓度梯度的标准品贮存液，备用；
（2）采集样本，并从样本中提取DNA，得到样本基因组，备用；
（3）将PCR预混液、TREC上游引物、TREC下游引物、KREC上游引物、KREC下游引物、RNaseP上游引物、RNase P下游引物、TREC探针、KREC探针、RNase P探针和去离子水进行混合，得到PCR反应母液，备用；
（4）取上述标准品贮存液和PCR反应母液混合，用荧光定量PCR仪采集荧光信号，得到标准品的PCR扩增标准曲线；
（5）取上述样本基因组贮存液和PCR反应母液混合，用荧光定量PCR仪采集荧光信号，得到样本PCR扩增曲线；
（6）通过荧光定量PCR仪自带的软件，计算得到样本基因组中TREC和KREC的CT值；根据CT值的大小，判断样本基因组中TREC和KREC的阴阳性。
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