CN112646928A - Vsvg基因残留量的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种VSVG基因残留量的检测试剂盒及其检测方法。首先公开了一种用于检测VSVG基因的成套试剂，所述成套试剂包括引物F、引物R和探针P。还公开了一种定量检测CAR‑T产物中VSVG基因残留量的方法，包括以下步骤：S1：根据上述的成套试剂制作标准曲线；S2：对CAR‑T产物进行荧光定量检测，将测得的Ct值与标准曲线对照，得到VSVG基因拷贝数。本发明公开的方法方便快捷，能在较短的时间内检测出VSVG基因的残留，且不需要昂贵的仪器设备；灵敏度高，最低可检测出10个拷贝/ul；特异性好。本发明对于CAR‑T中RCL的检测具有较高的参考价值，适于推广应用。

Description

VSVG基因残留量的检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种VSVG基因残留量的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
CAR-T技术，全称为嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen ReceptorTcell Immunotherapy)。30年前，有“CAR-T之父”的德国洪堡大学的以色列教授ZeligEshhar创造性提出，将针对肿瘤抗原单克隆抗体的可变区和T细胞受体的亚基构建融合蛋白，重新定向T细胞的免疫反应。2017年，诺华公司的CAR-T细胞治疗白血病药物Kymriah和Kite公司CAR-T细胞治疗白血病药物Yescarta先后获批上市，推动了细胞免疫治疗的进一步发展。
CAR(嵌合抗原受体)的结构包括胞外单链抗体区、铰链区、跨膜区和胞内信号肽区。单链抗体(scFv)是由特异性识别抗原的单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)可变区片段连接而组成的；铰链区一般为免疫球蛋白序列，如CD8α或TCRβ链，其具有变形和伸缩的活性，给单链抗体提供更多变形和接近抗原的空间；跨膜区一般有同源或异源二聚体膜蛋白如CD4、CD8或CD28组成，是CAR的二聚化、内源性T细胞受体交叉激活的关键区域；胞内信号肽区通常由共刺激分子和免疫受体酪氨酸活化基序组成，用于传递细胞激活信号。
使用病毒载体将CAR基因导入T细胞的转导方法已被广泛应用，病毒载体的种类很多，比如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体和慢病毒载体，而慢病毒载体用于CAR基因的导入有明显的优势而被广泛应用。
慢病毒载体是由HIV病毒为基础进行构建的，为降低同源重组产生有复制能力病毒的可能性，从最初的二质粒系统发展为三质粒、四质粒表达系统，三质粒系统包装成分分别构建在两个质粒上，一个表达gag和pol，另一个表达env。三质粒表达系统包括包装质粒、异源包膜蛋白质粒和转移质粒。异源包膜蛋白质粒是用编码水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)基因代替env基因，扩大了靶细胞的范围。为了CAR-T细胞产品使用的安全，防止可复制病毒的产生，在CAR-T细胞生产中需要进行可复制病毒(RCL)的检测。根据中国药审中心《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》对RCL的检测有针对特定基因(如VSVG)的PCR法或qPCR法和敏感细胞感染试验法，敏感细胞感染法是将待测样本接种于敏感细胞上，进行多次传代，如样本中有复制型病毒，在培养末期的时候通过观察病变、p24抗原表达等可以反映出病毒复制的情况，但是敏感细胞感染法需要使用HIV弱毒株为阳性对照，其培养需要在P3级生物安全实验室条件下进行。这种方法对于RCL的常规检测不具有可操作性。所以使用灵敏的PCR法或qPCR法进行VSVG基因的检测是CAR-T细胞产品的临床前可行的方法。
然而目前使用qPCR的方法进行VSVG基因序列的检测方法，在160个拷贝时就不能检测出VSVG序列的存在，其灵敏度无法达到药审中心的要求。
发明内容
本发明公开了一种能够快速灵敏的检测VSVG基因残留量的试剂盒及其检测方法，在10个拷贝的低浓度下，能够检测出VSVG基因序列的存在，具体的技术方案如下：
本发明一方面公开了一种用于检测VSVG基因的成套试剂，所述成套试剂包括引物F、引物R和探针P；
所述引物F为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链核苷酸分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链核苷酸分子；
所述引物R为如下a3)或a4)：
a3)序列表中序列2所示的单链核苷酸分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链核苷酸分子；
所述探针P为如下a5)或a6)：
a5)序列表中序列3所示的单链核苷酸分子；
a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链核苷酸分子。
本发明中“引物”是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，该大分子与反应物以共价键形式连接。
优选的，所述探针P的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。在本发明的一具体实施例中，所述荧光基团为FAM荧光基团，所述淬灭基团为BHQ1淬灭基团。应当理解，本发明并不限于FAM荧光基团和BHQ1淬灭基团，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适的荧光基团和淬灭基团来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。
本发明第二个方面公开了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的成套试剂。
优选的，所述试剂盒还包括纸质说明书。
本发明第三个方面公开了上述的成套试剂或上述的试剂盒在如下c1)-c3)中任意一项所述的应用：
c1)制备用于检测VSVG基因的产品；
c2)检测VSVG基因；
c3)检测待检测产品中是否污染有VSVG基因。
本发明第四个方面公开了一种定量检测CAR-T产物中VSVG基因残留量的方法，包括以下步骤：
S1：根据上述的成套试剂制作标准曲线；
S2：对CAR-T产物进行荧光定量检测，将测得的Ct值与标准曲线对照，得到7拷贝数。
应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S1之前、步骤S1和S2之间、步骤S2之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。
优选的，所述S1包括：
S11：提取T细胞基因组DNA和CAR-T细胞DNA；
S12、模板DNA的制备：使用含有VSVG基因的pMD2.G质粒作为标准品母液，用T细胞基因组DNA稀释pMD2.G质粒至每ul含有不同梯度的拷贝数；
S13：进行实时荧光定量PCR反应，得到Ct值，其中，T细胞基因组DNA作为阴性对照；
S14：根据Ct值和LogSQ绘制标准曲线。
应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S11之前、步骤S11和S12之间、步骤S12和S13之间、步骤S13和S14之间、步骤S14之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。
本发明中“实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)”是指一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。该方法分为相对定量法和绝对定量法，其中，相对定量法采用内参基因标准化目的基因，从而检测出目的基因的变化；决定定量法通过直接构建标准品曲线来检测目的基因的变化。
本发明中“Ct值”是指qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数(Cycle Threshold)。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时，所对应的循环数。Ct值与起始模板量的关系：模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。通常Ct值的范围为15-35。Ct值小于15，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。通过标准曲线，扩增效率为100％时，计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右，若大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，可认为无意义。
优选的，S11中，所述T细胞基因组DNA和CAR-T细胞DNA使用基因组DNA提取试剂盒进行提取。
优选的，S12中，用T细胞基因组DNA做溶液，以1/10的比例稀释pMD2.G质粒(含有VSVG基因)到每ul含有1.000E+06，1.000E+05，1.000E+04，1.000E+03，1.000E+02，1.000E+01的拷贝数。
优选的，荧光定量检测中的PCR反应体系包括模板1μL、正向引物0.1μL、反向引物0.1μL、探针0.2μL、qPCR mix 10μL和水8.6μL。
优选的，荧光定量检测中的PCR反应程序分为第一阶段和第二阶段，所述第一阶段为94℃，300s，1个循环；第二阶段：依次为94℃，20s；53℃，20s；72℃，40s，一共40个循环。
本发明第五个方面公开了上述方法在细胞免疫治疗领域中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
本发明公开的方法方便快捷，能在较短的时间内检测出VSVG基因的残留，且不需要昂贵的仪器设备；灵敏度高，最低可检测出10个拷贝/ul；特异性好，本发明根据VSVG基因序列设计1对引物和一个探针，与目的基因的区域结合，具有较高的特异性。本发明对于CAR-T中RCL的检测具有较高的参考价值，适于推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例中标准曲线的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
本实施例公开了一种用于检测VSVG基因的成套试剂，所述成套试剂包括引物F、引物R和探针P；
所述引物F为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链核苷酸分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链核苷酸分子；
所述引物R为如下a3)或a4)：
a3)序列表中序列2所示的单链核苷酸分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链核苷酸分子；
所述探针P为如下a5)或a6)：
a5)序列表中序列3所示的单链核苷酸分子；
a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链核苷酸分子。
所述探针P的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。所述荧光基团为FAM荧光基团，所述淬灭基团为BHQ1淬灭基团。
实施例2
本实施例公开了一种试剂盒，所述试剂盒包括实施例1所述的成套试剂。该试剂盒还包括纸质说明书，方便技术人员进行相应的试验操作。
实施例3
本实施例公开了一种定量检测CAR-T产物中VSVG基因残留量的方法，包括以下步骤：
S1：根据实施例1中所述的成套试剂制作标准曲线；
S2：对CAR-T产物进行荧光定量检测，将测得的Ct值与标准曲线对照，得到VSVG基因拷贝数。
具体的，本实施例的步骤如下：
1.实验仪器：Real-time PCR仪LightCycler 480Instrument II、超净工作台、离心机、漩涡振荡器。
2.实验材料：T细胞、CAR-T细胞、动物基因组提取试剂盒(北京擎科新业生物技术有限公司，型号TSP201)、qPCR mix(北京艾德莱)、qPCR引物、qPCR探针、pMD2.G质粒。
3.实验过程：
3.1制备成套试剂
其中，成套试剂中涉及的核苷酸序列如下：
引物F：GATGAATACACAGGAGAATGGGTTG(序列1)；
引物R：TAGAATCACATAGCCCTTTGACCTT(序列2)；
探针P：5’-CTGTCCATAACTCTACAACCTGGCATTCTGAC(序列3)，探针P的5’端FAM修饰，3’端BHQ1修饰。
3.2提取T细胞基因组DNA和CAR-T细胞的基因组DNA
(1)细胞样本的准备：计算细胞数目，吸取所需体积细胞培养液，300×g离心5min，小心将上清完全吸弃，切勿吸走细胞沉淀。
(2)将Spin Column(核酸纯化柱)置于Collection Tube(收集管)中，加入250μlBuffer BL，12,000×g离心1min，活化硅胶膜。
(3)细胞样本的消化：取20μl Proteinase(蛋白酶)K至1.5ml离心管底部，然后加入200μl高纯水悬浮的细胞沉淀，涡旋振荡10s；再加入200μl Buffer gA1，涡旋振荡10s，56℃孵育0.5～1h，期间震荡3～5次。
(4)孵育结束后加入200μl无水乙醇，涡旋振荡混匀。无水乙醇体积≈(细胞样本体积+Buffer gA1体积)/2。
(5)将步骤(4)所得溶液全部转入Spin Column中，12,000×g离心1min，弃废液。
(6)向Spin Column中加入500μl Buffer PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000×g离心30s，弃废液。
(7)重复步骤(6)一次。
(8)向Spin Column中加入500μl Wash Buffer(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000×g离心30s，弃废液。
(9)将Spin Column放回Collection Tube中，12,000×g离心2min，开盖晾干1min。
(10)取出Spin Column，放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜的中央处加50～100μl TE Buffer(65℃预热5min洗脱效果更佳)，20～25℃放置2min，12,000×g离心2min。如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入Spin Column中，离心2min。
3.3模板DNA的制备
用T细胞基因组DNA做溶液，以1/10的比例稀释pMD2.G质粒(含有VSVG基因)到每ul含有1.000E+06，1.000E+05，1.000E+04，1.000E+03，1.000E+02，1.000E+01的拷贝数。
3.4标准曲线的制作：
3.4.1PCR反应物制备：按照下表配置以上6组质粒和阴性对照(T细胞基因组DNA)的共20ul反应体系，每组三次重复。所述反应体系如表1所示。
表1 20ul反应体系
Figure BDA0002860638740000091
3.4.2使用LightCycler 480Instrument II按照如下设定进行qPCR反应在72℃C延伸反应时荧光定量检测，荧光定量检测中的PCR反应程序分为第一阶段和第二阶段，所述第一阶段为94℃，300s，1个循环；第二阶段：依次为94℃，20s；53℃，20s；72℃，40s，一共40个循环。
3.4.3根据每组重复实验2次计算出的平均Ct值，计算是否符合线性关系。得到的实验数据如表2所示。
表2不同组的实验结果
Figure BDA0002860638740000101
3.4.4根据Ct值和LogSQ绘制标准曲线，如图1所示。
3.5样品DNA中VSVG基因残留量的检测：
3.5.1如表1所示，配置检测组(CAR-T细胞基因组DNA)和对照组(T细胞基因组DNA)的共20ul反应体系，每组重复三次。
3.5.2使用LightCycler 480Instrument II Real-Time PCR仪按照如下设定进行qPCR反应在72℃延伸反应时荧光定量检测，荧光定量检测中的PCR反应程序分为第一阶段和第二阶段，所述第一阶段为94℃，300s，1个循环；第二阶段：依次为94℃，20s；53℃，20s；72℃，40s，一共40个循环。
3.5.3根据检测组(CAR-T细胞基因组DNA)和对照组(T细胞基因组DNA)的Ct值对比标准曲线，确定CAR-T细胞是否含有VSVG基因残留，以VSVG基因残留量。
本实施例公开的方法方便快捷，能在较短的时间内检测出VSVG基因的残留，且不需要昂贵的仪器设备；灵敏度高，最低可检测出10个拷贝/ul；特异性好，根据VSVG基因序列设计1对引物和一个探针，与目的基因的区域结合，具有较高的特异性。对于CAR-T中RCL的检测具有较高的参考价值，适于推广应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于检测VSVG基因的成套试剂，其特征在于，所述成套试剂包括引物F、引物R和探针P；
所述引物F为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链核苷酸分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链核苷酸分子；
所述引物R为如下a3)或a4)：
a3)序列表中序列2所示的单链核苷酸分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链核苷酸分子；
所述探针P为如下a5)或a6)：
a5)序列表中序列3所示的单链核苷酸分子；
a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链核苷酸分子。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于，所述探针P的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
3.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-2中任意一项所述的成套试剂。
4.权利要求1-2所述的成套试剂或权利要求3所述的试剂盒在如下c1)-c3)中任意一项所述的应用：
c1)制备用于检测VSVG基因的产品；
c2)检测VSVG基因；
c3)检测待检测产品中是否污染有VSVG基因。
5.一种定量检测CAR-T产物中VSVG基因残留量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：根据权利要求1-2中所述的成套试剂制作标准曲线；
S2：对CAR-T产物进行荧光定量检测，将测得的Ct值与标准曲线对照，得到VSVG基因拷贝数。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述S1包括：
S11：提取T细胞基因组DNA和CAR-T细胞DNA；
S12、模板DNA的制备：使用含有VSVG基因的pMD2.G质粒作为标准品母液，用T细胞基因组DNA稀释pMD2.G质粒至每ul含有不同梯度的拷贝数；
S13：进行实时荧光定量PCR反应，得到Ct值，其中，T细胞基因组DNA作为阴性对照；
S14：根据Ct值和LogSQ绘制标准曲线。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S11中，所述T细胞基因组DNA和CAR-T细胞DNA使用基因组DNA提取试剂盒进行提取。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，荧光定量检测中的PCR反应体系包括模板1μL、正向引物0.1μL、反向引物0.1μL、探针0.2μL、qPCRmix 10μL和水8.6μL。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，荧光定量检测中的PCR反应程序分为第一阶段和第二阶段，所述第一阶段为94℃，300s，1个循环；第二阶段：依次为94℃，20s；53℃，20s；72℃，40s，一共40个循环。
10.根据权利要求5-9中任意一项所述的方法在细胞免疫治疗领域中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104892770A (zh) * 2015-05-27 2015-09-09 上海吉凯基因科技有限公司 一种对t细胞和造血干细胞具有高效感染和促增殖能力的慢病毒载体
CN109750124A (zh) * 2019-03-19 2019-05-14 上海邦耀生物科技有限公司 一种用于检测慢病毒的核酸组和检测方法
CN111910015A (zh) * 2019-05-08 2020-11-10 深圳宾德生物技术有限公司 一种检测复制型慢病毒的探针、引物对、荧光定量pcr试剂盒及方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104892770A (zh) * 2015-05-27 2015-09-09 上海吉凯基因科技有限公司 一种对t细胞和造血干细胞具有高效感染和促增殖能力的慢病毒载体
CN109750124A (zh) * 2019-03-19 2019-05-14 上海邦耀生物科技有限公司 一种用于检测慢病毒的核酸组和检测方法
CN111910015A (zh) * 2019-05-08 2020-11-10 深圳宾德生物技术有限公司 一种检测复制型慢病毒的探针、引物对、荧光定量pcr试剂盒及方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴雪伶等: "CAR-T细胞治疗产品中复制型病毒的风险分析及控制", 《中国药事》 *
崔靖等: "复制能力慢病毒检测方法的研究进展", 《中国新药杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113667773A (zh) * 2021-08-19 2021-11-19 南昌艾迪康医学检验实验室有限公司 检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物、探针及试剂盒

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