CN113667773A - 检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物、探针及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN113667773A
CN113667773A CN202110953269.1A CN202110953269A CN113667773A CN 113667773 A CN113667773 A CN 113667773A CN 202110953269 A CN202110953269 A CN 202110953269A CN 113667773 A CN113667773 A CN 113667773A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
rcl
primer
kit
vsv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110953269.1A
Other languages
English (en)
Inventor
林筱剑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanchang Adicon Medical Inspection Laboratory Co ltd
Original Assignee
Nanchang Adicon Medical Inspection Laboratory Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanchang Adicon Medical Inspection Laboratory Co ltd filed Critical Nanchang Adicon Medical Inspection Laboratory Co ltd
Priority to CN202110953269.1A priority Critical patent/CN113667773A/zh
Publication of CN113667773A publication Critical patent/CN113667773A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种用于检测CarT细胞中复制型慢病毒(RCL)的试剂盒，其包括扩增VSV‑G包膜基因片段的引物和探针。本发明可快速检测CarT细胞制品是否存在RCL污染。利用本发明完成的检测结果准确，灵敏度高，可快速检测Car‑T细胞制品是否为RCL阳性。由于检测方法方便快速地检测Car‑T细胞制品中的是否存在RCL污染，本发明检测的引物、探针和方法将可用于Car‑T细胞制品生产中的各个环节质控。

Description

检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种临床检验用途的检测CarT细胞中复制型慢病毒(RCL)的试剂盒，采用探针Taqman实时荧光定量PCR技术，针对VSV-G包膜基因片段特异性扩增，非常适合在Car-T细胞临床试验的早期来检测RCL/RCR，更好地控制RCR/RCL风险。
背景技术
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体t细胞疗法(CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。CAR-T细胞疗法通过外源基因转染技术，把识别肿瘤相关抗原的单链抗体(scfv)和T细胞活化序列的融合蛋白表达到T细胞表面，使可以特异识别肿瘤相关抗原的scfv通过跨膜区与T细胞胞内的活化增殖信号域偶联。同时，经过CAR改造后的T细胞能够以HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，不受MHC限制，具有活化和增殖的能力，因此具有高效的杀伤肿瘤细胞的能力。表达CAR的T细胞以抗原依赖、但非mhc限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。
Car-T细胞疗法在血液肿瘤中的治疗效果得到了越来越多的认可，因此成为肿瘤免疫治疗领域中的热点。在Car-T细胞的生产中，主要是依靠逆转录病毒载体或慢病毒载体将Car基因导入到T细胞中，在此过程中也可能使得Car-T产品受到复制型逆转录病毒(RCR)或复制型慢病毒(RCL)的污染。有RCR/RCL污染的产品如果被回输到患者体内可能有造成二次肿瘤的风险，所以在Car-T细胞产品的生产各个环节中都会涉及到RCR/RCL的检测，以确保无RCR/RCL污染，目前建立的RCL检测方法并不多，虽然RCR/RCL细胞感染试验有较高的灵敏度，但是该方法耗时长，本发明所建立的检测方法以针对VSV-G包膜基因片段的荧光定量PCR为基础，在确保高灵敏度的同时，可以快速检测，且假阳性低。可以有效地作为Car-T细胞生产环节中的质控手段。
发明内容
本发明设计了针对VSV-G包膜基因片段的引物和探针序列，用于检测CarT细胞中的复制型慢病毒污染，采用荧光定量PCR技术，利用标准曲线的方法，构建了VSV-G的定量标准曲线，可以实现对VSV-G片段的定量检测，从而间接定量RCL。
一种检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针针对VSV-G包膜基因进行定量检测，所述引物和探针的碱基序列如下：
VG-F:AGGGAACTGTGGGATGACTG
VG-R:GAACACCTGAGCCTTTGAGC
VG-probe:FAM-TATGAAGACGTGGAAATTGGACCCA–MGB。
本发明还提供了一种检测CarT细胞中是否存在RCL污染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：DNA提取试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其中检测体系PCR反应液包括扩增VSV-G包膜基因片段的引物和探针，所述引物和探针的碱基序列如下：
VG-F:AGGGAACTGTGGGATGACTG
VG-R:GAACACCTGAGCCTTTGAGC
VG-probe:FAM-TATGAAGACGTGGAAATTGGACCCA–MGB。
本发明试剂盒使扩增效率和速率均达到最佳，最低检测限可以下探到10拷贝。
进一步地，所述阳性对照品为含有VSV-G片段的质粒DNA稀释液；所述阴性对照品为未经过转染的人正常细胞提取DNA。
本发明的有益效果：本发明将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，利用标准曲线的方法，构建了VSV-G的定量标准曲线，检测Car-T细胞产品中是否存在RCL污染，可用于Car-T细胞产品生产各个环节的质量控制。经过优化后的引物、探针和合理的体系、检测条件可以使整个试剂盒对VSV-G片段的检测下限下探到10拷贝数(检出率100％)。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便，所建立的检测方法以针对VSV-G包膜基因片段的荧光定量PCR为基础，在确保高灵敏度的同时，可以快速检测，且假阳性低，可以有效地作为Car-T细胞生产环节中的质控手段。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
定量检测检测CarT细胞中复制型慢病毒(RCL)的检验试剂盒包括：
血液/组织DNA抽提试剂(天根生物)；
检测体系PCR反应液：THNDERBIRD Probe qPCR Mix(2×)、VG上、下游引物各0.8uM、VG探针0.4uM；
其中：
VG-F:AGGGAACTGTGGGATGACTG
VG-R:GAACACCTGAGCCTTTGAGC
VG-probe:FAM-TATGAAGACGTGGAAATTGGACCCA–MGB。
阳性对照品为CarT细胞产品中提取的DNA；所述阴性对照品为未经过转染的人正常细胞提取DNA。
实施例2
本方法的操作流程：
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的组织DNA：
1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装：
X＝23ul反应液×(6份目的基因(标准曲线)+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；
(4)加样：加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA；阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。
(5)检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。
(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。
1)内参阳性时，检测结果才认为有效；
2)阳性判断标准：，Ct＜36，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性。
实施例3
采用本发明核酸检测试剂盒检测阳性样本1，按实施例2所述方法提取基因组DNA、配制试剂并检测。
每份标本加入检测体系PCR反应液中2ul。检测时间仅为100分钟。
阴、阳性样品的检测结果图如图1所示。
实施例4线性区间检测
取阳性参考品梯度稀释，按实施例2所述方法配制试剂并检测。
每份样品加入检测体系PCR反应液中2ul。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。6个浓度梯度样本中所有样本均起线且重复性良好，进一步的，对实验数据进行线性分析，发现线性关系很好，R2大于0.99。实验结果如下表1所示，线性分析结果如图2所示：
表1 6个浓度梯度样本VSV-G检测结果
Figure BDA0003219344560000051
本发明将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，利用标准曲线的方法，构建了VSV-G的定量标准曲线，检测Car-T细胞产品中是否存在RCL污染，可用于Car-T细胞产品生产各个环节的质量控制。经过优化后的引物、探针和合理的体系、检测条件可以使整个试剂盒对VSV-G片段的检测下限下探到10拷贝数(检出率100％)。
序列表
<110> 南昌艾迪康医学检验实验室有限公司
<120> 检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物、探针及试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agggaactgt gggatgactg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaacacctga gcctttgagc 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tatgaagacg tggaaattgg accca 25

Claims (3)

1.一种检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针针对VSV-G包膜基因进行定量检测，所述引物和探针的碱基序列如下：
VG-F:AGGGAACTGTGGGATGACTG
VG-R:GAACACCTGAGCCTTTGAGC
VG-probe:FAM-TATGAAGACGTGGAAATTGGACCCA–MGB。
2.一种检测CarT细胞中是否存在RCL污染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：DNA提取试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其中检测体系PCR反应液包括扩增VSV-G包膜基因片段的引物和探针，所述引物和探针的碱基序列如下：
VG-F:AGGGAACTGTGGGATGACTG
VG-R:GAACACCTGAGCCTTTGAGC
VG-probe:FAM-TATGAAGACGTGGAAATTGGACCCA–MGB。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，阳性对照品为含VSV-G片段的质粒DNA稀释液；阴性对照品为未经过转染的人正常细胞提取DNA。
CN202110953269.1A 2021-08-19 2021-08-19 检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物、探针及试剂盒 Pending CN113667773A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110953269.1A CN113667773A (zh) 2021-08-19 2021-08-19 检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物、探针及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110953269.1A CN113667773A (zh) 2021-08-19 2021-08-19 检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物、探针及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113667773A true CN113667773A (zh) 2021-11-19

Family

ID=78543922

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110953269.1A Pending CN113667773A (zh) 2021-08-19 2021-08-19 检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物、探针及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113667773A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115717155A (zh) * 2022-07-27 2023-02-28 华道(上海)生物医药有限公司 一种用于复制型病毒检测的重组表达载体及其应用
CN116970737A (zh) * 2023-04-27 2023-10-31 北京艺升医疗科技有限公司 一种复制型慢病毒检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112166186A (zh) * 2018-05-23 2021-01-01 新加坡国立大学 用于t细胞恶性肿瘤的免疫治疗的嵌合抗原受体和cd2的基因编辑
CN112646928A (zh) * 2020-12-25 2021-04-13 康美润源(北京)生物技术有限公司 Vsvg基因残留量的检测试剂盒及其检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112166186A (zh) * 2018-05-23 2021-01-01 新加坡国立大学 用于t细胞恶性肿瘤的免疫治疗的嵌合抗原受体和cd2的基因编辑
CN112646928A (zh) * 2020-12-25 2021-04-13 康美润源(北京)生物技术有限公司 Vsvg基因残留量的检测试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LINDSEY M SKRDLANT等: "Detection of Replication Competent Lentivirus Using a qPCR Assay for VSV-G", MOL THER METHODS CLIN DEV *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115717155A (zh) * 2022-07-27 2023-02-28 华道(上海)生物医药有限公司 一种用于复制型病毒检测的重组表达载体及其应用
CN115717155B (zh) * 2022-07-27 2023-11-14 华道(上海)生物医药有限公司 一种用于复制型病毒检测的重组表达载体及其应用
CN116970737A (zh) * 2023-04-27 2023-10-31 北京艺升医疗科技有限公司 一种复制型慢病毒检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108841926B (zh) 一种rt-rpa-侧流层析双重检测戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的引物、探针及试剂盒
CN113667773A (zh) 检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物、探针及试剂盒
US20200208203A1 (en) Kit for diagnosis of systemic lupus erythematosus and probe for the detection and quantification of the methylation level of an ifi44l fragment
WO2020211229A1 (zh) 一种免疫力水平评估的方法及装置
CN110229880A (zh) 检测遗传性耳聋基因突变位点的引物、试剂盒和方法
CN107574261B (zh) 用于检测汉坦病毒的检测引物、检测试剂盒及检测方法
CN110804659B (zh) 一种血清外泌体ssc-miR-92b-3p作为母猪早期妊娠诊断分子标志物的应用
CN110438260B (zh) 一种非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测试剂盒
CN111893173A (zh) 检测基因pear1 snp位点的引物、方法和试剂盒
CN101864492A (zh) 用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒
CN114908165A (zh) 急性髓性白血病诊断和治疗的生物标记物及其应用
CN112646928A (zh) Vsvg基因残留量的检测试剂盒及其检测方法
CN110607398B (zh) 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒
CN109628640B (zh) 一种快速检测鲤春病毒血症病毒的rpa-lfd引物、方法和试剂盒
CN114807404A (zh) 一种快速检测疟原虫的核酸检测试剂盒及其应用
CN109666763A (zh) 一种多重pcr检测eb病毒的试剂盒、用于检测评估eb病毒活性的试剂盒及其制备方法
CN114231649A (zh) 检测torch五种病原体的引物探针组合、试剂盒及其应用
CN108950064B (zh) 检测眼部微量生物样本中ebv感染的试剂盒和方法
CN113913554A (zh) 一种实时荧光定量pcr检测jc多瘤病毒的方法
CN110747268B (zh) 一种血清外泌体ssc-miR-17-5p作为母猪早期妊娠诊断分子标志物的应用
CN112760420A (zh) 一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的引物、探针和试剂盒
TWI437229B (zh) Detection of rice field blood type of the third type of method
CN111172319A (zh) 一种检测猪流行性腹泻病毒的引物对及其试剂盒和应用
CN108034721B (zh) 检测白血病nup98系列融合基因寡核苷酸、检测方法和试剂盒
CN112646007B (zh) 用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白及检测试剂

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20211119