CN112111606B - 检测重组慢病毒滴度的核酸组合物、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测重组慢病毒滴度的核酸组合物、试剂盒和方法，该核酸组合物包括引物对和探针，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示，探针上连接有荧光基团。该核酸组合物用于检测含有CD247基因的重组慢病毒滴度时的特异性好，准确性高。

Description

检测重组慢病毒滴度的核酸组合物、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测重组慢病毒滴度的核酸组合物、试剂盒和方法。

背景技术

肿瘤和自身免疫性疾病的发生与感染、基因突变和环境刺激等多种因素有关。研究发现，CD247基因在慢性炎症、自身免疫性疾病和肿瘤发展过程中发挥重要作用。CD247(又称CD3Z或TCRZ)基因位于人染色体1q24.2，属于CD3Z/FCERIG家族。CD247基因编码产物为CD3分子的两条ζ链，与T细胞抗原受体αβ(也称TCRαβ)或γδ(也称TCRγδ)和CD3γ、ε、δ链以非共价键共同组成TCR/CD3复合物。TCR主要功能是识别与结合MHC抗原肽复合物，CD3则进一步将TCR识别的信号转入T淋巴细胞，诱导T淋巴细胞活化，TCR/CD3膜表达水平决定了T淋巴细胞活化的启动。CD3分子亚单位的胞内段含有一个共同的序列，即免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)。该序列与抗原识别后淋巴细胞的活化及信号转导关系密切，其中CD3γ、ε、δ链各含1个ITAM，而ζ链含3个ITAM。CD3-ζ链是1种高度保守的结构，由164个氨基酸组成，其主要功能是参与TCR/CD3复合物的装配、表达以及信号转导。

目前，利用CD247阳性的CAR-T治疗肿瘤的动物实验正在进行中，CD16+CD247+T细胞和Mogamulizumab(CCR4抗体)耦合的CAR-T治疗急性淋巴细胞性白血病的基础研究发现其可增加机体的免疫活性，为肿瘤的治疗提供新策略。

目前主要通过将CD247基因整合到慢病毒载体中形成重组慢病毒，然后将该重组慢病毒并转染到宿主细胞实现CD247基因的体外表达。在重组慢病毒制备的过程中，重组慢病毒的滴度是衡量重组慢病毒的制备是否成功以及重组慢病毒的质量的重要指标。目前常用的测定含有CD247基因的重组慢病毒滴度的方法有酶联免疫(ELISA)法、流式细胞术法(FACS)和定量PCR法。

ELISA法是通过检测含有CD247基因的重组慢病毒中P24蛋白的含量，通过比活的关系推算重组慢病毒滴度。由于该方法仅仅测定了含有CD247基因的重组慢病毒的颗粒数，并没有测定含有CD247基因的重组慢病毒对靶细胞的实际感染能力，因此ELISA法测定的是含有CD247基因的重组慢病毒的物理滴度而非实际生物滴度。此外，由于含有CD247基因的重组慢病毒的悬液中往往含有一定的游离的P24蛋白，因此ELISA法通常过高地估计病毒滴度。

FACS法虽然较准确的测定含有CD247基因的重组慢病毒滴度，但该方法不能测定无标记基因的含有CD247基因的重组慢病毒，需要重组慢病毒表达标记基因或者需要筛选或制备与慢病毒载体能够相连的带有荧光基团结合位点的抗体，此研发工作量大，研究困难。

定量PCR法主要通过针对慢病毒空载体上的元件设计引物而测定含有CD247基因的重组慢病毒感染的靶细胞中平均每个细胞基因组中病毒基因组的拷贝数，可在一定程度上反应含有CD247基因的重组慢病毒的滴度，也可以测定无标记基因的含有CD247基因的重组慢病毒滴度。然而，在实际应用中发现，定量PCR法的测定含有CD247基因的重组慢病毒时的特异性差，准确性较低。

发明内容

基于此，有必要提供一种检测重组慢病毒滴度的核酸组合物，该核酸组合物可应用于无标记基因的含有CD247基因的重组慢病毒滴度的检测，且特异性好。

一种检测重组慢病毒滴度的核酸组合物，包括引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示，所述探针上连接有荧光基团。

上述检测重组慢病毒滴度的核酸组合物，可应用于无标记基因的含有CD247基因的重组慢病毒滴度的检测，且特异性好。

在其中一个实施例中，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。

在其中一个实施例中，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5及ROX中的一种。

一种检测重组慢病毒滴度的试剂盒，包括上述的检测重组慢病毒滴度用的核酸组合物。

在其中一个实施例中，还包括PCR反应缓冲液和DNA提取试剂中的至少一种。

一种检测重组慢病毒滴度的方法，包括以下步骤：

用含有重组慢病毒的待测样品感染靶细胞，并提取感染后所述靶细胞中的基因组DNA，所述重组慢病毒上整合有CD247基因；

将所述基因组DNA与上述的检测重组慢病毒滴度的核酸组合物混合后进行实时荧光定量PCR扩增反应，得到CD247基因的Ct值；

根据所述CD247基因的Ct值以及由含有CD247基因的质粒标准品建立的标准曲线，得到提取的所述基因组DNA中的CD247基因的浓度；及

根据提取的所述基因组DNA中的CD247基因的浓度、感染前靶细胞的总数和感染后靶细胞的总数，计算所述待测样品中重组慢病毒的滴度。

在其中一个实施例中，在所述实时荧光定量PCR扩增反应中，退火的温度为56℃～62℃，退火的时间为2s～10s，延伸的温度为56℃～62℃，延伸时间为2s～10s。

在其中一个实施例中，所述靶细胞为293T细胞。

在其中一个实施例中，所述由CD247基因的标准品建立的标准曲线通过如下操作得到：

将CD247基因标准品进行梯度稀释，获得梯度浓度的所述CD247基因标准品；

将每一个浓度的所述CD247基因标准品分别与所述检测重组慢病毒滴度用的核酸组合物混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，获取扩增每一个浓度的所述CD247基因标准品的Ct值；及

根据所述CD247基因标准品的Ct值与浓度的对应关系建立所述CD247基因标准品的标准曲线。

在其中一个实施例中，所述根据提取的所述基因组DNA中的CD247基因的浓度、感染前靶细胞的总数和感染后靶细胞的总数，计算所述待测样品中重组慢病毒的滴度的步骤包括：

根据提取的所述基因组DNA中的CD247基因的浓度和提取的感染后靶细胞中基因组DNA的体积，计算感染后靶细胞中CD247基因的总拷贝数；及

根据公式：

计算所述待测样品中重组慢病毒的滴度。

附图说明

图1为实施例1中的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为实施例2中退火的和延伸的时间为56℃、退火和延伸的时间均为10s时的标准曲线；

图3为实施例2中退火的和延伸的时间为56℃、退火和延伸的时间均为8s时的标准曲线；

图4为实施例2中退火的和延伸的时间为56℃、退火和延伸的时间均为6s时的标准曲线；

图5为实施例2中退火的和延伸的时间为60℃、退火和延伸的时间均为1min时的标准曲线；

图6为实施例2中退火和延伸的温度均为60℃、退火和延伸的时间均为2s时的标准曲线；

图7为实施例2中退火和延伸的温度均为62℃、退火和延伸的时间均为2s时的标准曲线。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明一实施方式提供了一种检测重组慢病毒滴度的核酸组合物，包括引物对和探针，其中，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示，探针上连接有荧光基团。具体地，引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。更具体地，如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为：5’-AGATGGCGGAGGCCTACAGT-3’；如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为：5’-CTGCATGTGAAGGGCGTCGT-3’；如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示引物对用于扩增重组慢病毒上人的CD247基因。经验证，通过CD247基因的拷贝数测定含有CD247基因的重组慢病毒的滴度时，特异性好，准确率高。

具体地，探针的核苷酸片段可以扩增的CD247基因片段进行设计。在其中一个可选地具体示例中，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。具体地，如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为5’-ATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG-3’。当然，在其他实施例中，探针的不限于上述。

在其中一个实施例中，探针上连接的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5及ROX中的一种。当然，在其他实施例中，探针上连接的荧光基团不限于上述，还可以是其他常用作荧光基团的物质。

本发明一实施方式还提供了一种检测重组慢病毒滴度的试剂盒，该试剂盒用于检测含有CD247基因的重组慢病毒滴度。具体地，该检测重组慢病毒滴度的试剂盒包括上述检测重组慢病毒滴度用的核酸组合物。

在其中一个实施例中，该检测重组慢病毒滴度的试剂盒还包括PCR反应缓冲液和DNA提取的试剂中的至少一种。

在其中一个实施例中，PCR反应缓冲液包括缓冲液、DNA聚合酶及dNTPs。在一个可选地具体示例中，PCR反应缓冲液为FastFire qPCR PreMix。

在其中一个实施例中，DNA提取试剂包括细胞裂解液。当然，在其他一些实施例中，DNA提取试剂还可以包括其他用于DNA提取的试剂。

本发明一实施方式还提供了一种检测重组慢病毒滴度的方法，该检测重组慢病毒滴度的方法包括步骤a～步骤d，具体地：

步骤a：用含有重组慢病毒的待测样品感染靶细胞，并提取感染后靶细胞中的基因组DNA，重组慢病毒上整合有CD247基因。

具体地，用含有重组慢病毒的待测样品感染靶细胞，并提取感染后靶细胞中的基因组DNA的步骤包括：提前1天～3天准备靶细胞，然后取一定数量细胞于24孔培养板中，培养1天后，向24孔板中加入待测样品感染靶细胞，并继续培养靶细胞1天后更换新鲜培养基，继续培养2天～5天，然后收集感染后培养的靶细胞，并提取感染后的靶细胞中的基因组DNA。更具体地，采用市售试剂盒提取感染后的靶细胞中的基因组DNA。当然，在其他一些实施例中，提取感染后的靶细胞中的基因组DNA的方法不限于上述，还可以是本领域常用的其他方法。

在本实施方式中，靶细胞为293T细胞。用重组慢病毒感染293T细胞时，感染效率高，因此293T细胞非常适合作为重组慢病毒感染的靶细胞。

在一个可选地具体示例中，重组慢病毒慢包含中国专利CN109134665A中的慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-BCMA。

步骤b：将提取的感染后的靶细胞中基因组DNA与上述检测重组慢病毒滴度的核酸组合物混合后进行实时荧光定量PCR扩增反应，得到CD247基因的Ct值。

具体地，将提取的感染后的靶细胞中基因组DNA与上述检测重组慢病毒滴度的核酸组合物混合后进行实时荧光定量PCR扩增反应，得到扩增曲线；然后根据扩增曲线获得CD247基因的Ct值。其中，Ct值表示荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

在其中一个实施例中，实时荧光定量PCR扩增反应中，退火的温度为56℃～62℃，退火的时间为2s～10s，延伸的温度为56℃～62℃，延伸的时间为2s～10s。

在其中一个实施例中，实时荧光定量PCR扩增反应中的退火的温度为60℃，退火的时间为2s，延伸的温度为60℃，延伸的时间为2s。

在其中一个实施例中，实时荧光定量PCR扩增反应体系中，上游引物和下游引物的浓度为0.2μM/μL～0.4μM/μL，基因组DNA的浓度为50ng/μL～500ng/μL。进一步地，实时荧光定量PCR扩增反应体系中，上游引物和下游引物的浓度为0.3μM/μL，基因组DNA的浓度为90ng/μL～110ng/μL。在一个可选地具体示例中，基因组DNA的浓度为100ng/μL。

步骤c：根据CD247基因的Ct值以及由含有CD247基因的质粒标准品建立的标准曲线，得到提取的基因组DNA中的CD247基因的浓度。

具体地，由含有CD247基因的质粒标准品建立的标准曲线通过如下操作得到：将含有CD247基因的质粒标准品进行梯度稀释，获得梯度浓度的CD247基因标准品；将每一个浓度的CD247基因标准品分别与检测重组慢病毒滴度用的核酸组合物混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，获取扩增每一个浓度的CD247基因标准品的Ct值；以及根据CD247基因标准品的Ct值与浓度的对应关系建立CD247基因标准品的标准曲线。

在一个可选地具体示例中，含有CD247基因的质粒标准品为中国专利CN109134665A中的慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-BCMA。

步骤d：根据提取的基因组DNA中的CD247基因的浓度、感染前靶细胞的总数和感染后的靶细胞的总数，计算待测样品中重组慢病毒的滴度。

具体地，根据提取的基因组DNA中的CD247基因的浓度、感染前靶细胞的总数和感染后靶细胞的总数，计算待测样品中重组慢病毒的滴度的步骤包括：

根据提取的基因组DNA中的CD247基因的浓度和提取的感染后靶细胞中基因组DNA的体积，计算感染后靶细胞中CD247基因的总拷贝数；及

根据公式：

计算待测样品中重组慢病毒的滴度。

在其中一个实施例中，以标准品浓度(拷贝/μL)的对数值(以10为底)对其Ct平均值做线性回归，拟合标准曲线。然后将待测样品Ct平均值代入拟合的标准曲线中，计算由提取感染后的靶细胞的基因组DNA而获得的DNA提取液中CD247基因浓度对数值(以10为底)，求其指数得出CD247基因浓度(拷贝/μL)。然后根据CD247基因浓度(拷贝/μL)，计算DNA提取液内CD247基因的总拷贝数。然后根据感染滴度(IU/mL)＝感染前靶细胞总数(个)×DNA提取液内CD247基因总数×1(IU/拷贝)/{收获的靶细胞的细胞总数(个)×慢病毒的接种体积(mL)}

上述检测重组慢病毒滴度的方法通过采用上述检测重组慢病毒滴度的核酸组合物作为扩增重组慢病毒中CD247基因的引物和探针，使得上述检测重组慢病毒滴度的方法特异性高、灵敏高，能够准确获得无标记基因的含有CD247基因的重组慢病毒的滴度。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

(1)委托基因合成公司合成WPRE引物对、H-CD247引物对、WPRE探针和H-CD247探针。其中，H-CD247引物对如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示，WPRE引物对如SEQ ID No.4～SEQ ID No.5所示，H-CD247探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。WPRE探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6，WPRE探针的5’端连接有FAM，3’段连接有BHQ1，H-CD247探针的5’端连接有FAM，3’段连接有BHQ1。如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为：5’-AGATGGCGGAGGCCTACAGT-3’；如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为：5’-CTGCATGTGAAGGGCGTCGT-3’；如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为5’-ATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG-3’。如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为：5’-CGCTTTCCCCCTCCCTATTG-3’；如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列为：5’-AGCCATGGAAAGGACGTCAG-3’；如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为5’-GGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAAT-3’。

(2)以293T细胞的基因组为阴性对照，以水为无模板对照，以中国专利CN109134665A中的慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-BCMA(下文简称“慢病毒穿梭质粒”))为模板，分别以WPRE引物对、H-CD247引物对作为引物，使用FastFire快速定量PCR试剂进行实时荧光定量PCR，其中，各组的实时荧光定量PCR扩增体系均如表1所示，各组的实时荧光定量PCR的反应程序均如表2所示。各组实时荧光定量PCR结果如表3所示。

表1

表2

表3

由表3可知，以1×10⁶copies/μL的ZL1801慢病毒穿梭质粒为模板，两种引物对的Ct值分别为25.51和25.26，差值为0.25，小于0.5，表明两种引物对的灵敏度差异较小。

(3)使用2％的琼脂糖凝胶分析实时荧光定量PCR产物，比较两种引物对的灵敏度和特异性。其中，2％琼脂糖凝胶制备：称取琼脂糖适量，置250mL锥形瓶中，加入TAE电泳缓冲液(1×)使成1％琼脂糖的溶液，于微波炉高火加热溶解；待温度降至60℃以下，加入核酸染料(10μL/100mL)，摇匀；将凝胶液倒入胶模中，自然均匀铺满；待凝胶完全凝固(约30分钟)即可使用。上样：1kb DNA Marker溶液上样10μL；各产物溶液上样10μL。电泳：调节电泳仪电压120V，电泳45min。结果如图1所示。

在图1中，图1的上部分靠近上样口，编号1的泳道为H-CD247引物对与慢病毒穿梭质粒的扩增产物电泳结果，编号2的泳道为H-CD247引物对与293T细胞空白基因组的扩增产物的电泳结果，编号3的泳道为H-CD247引物对水的扩增产物的电泳结果，编号4的泳道为WPRE引物对与慢病毒穿梭质粒的扩增产物的电泳结果，编号5的泳道为WPRE引物对与293T细胞空白基因组的扩增产物的电泳结果，编号6和7的泳道均为WPRE引物对水的扩增产物的电泳结果。

由图1可知，H-CD247引物对与慢病毒穿梭质粒的扩增产物只有1条带，而WPRE引物对与慢病毒穿梭质粒的扩增产物有很多条带；H-CD247引物对与293T细胞空白基因组的扩增产物比WPRE引物对与293T细胞空白基因组的扩增产物条带少且较弱；无模板对照电泳均出现微弱的目标条带和引物二聚体条带。由此，可以H-CD247引物对的特异性强于WPRE引物对。

实施例2

(1)根据标定的标准品慢病毒穿梭质粒浓度(copies/μL)，用293T细胞空白基因组稀释，制成不同浓度梯度的模板。

(2)取2×Super TaqMan Mixture、H-CD247上游引物(SEQ ID No.1)和H-CD247下游引物(SEQ ID No.2)、H-CD247探针(SEQ ID No.3)和无酶水，在超净工作台内，按表4配制实时荧光定量PCR反应体系，表4中的模板为各浓度的标准品、待测样本或阴性对照(水)。

表4

(3)在实施例1表2的基础上，维持预变性和变性的参数不变，将退火的和延伸的时间均设为56℃，退火和延伸的时间设为10s、8s或6s，对步骤(2)的实时荧光定量PCR反应体系进行实时荧光定量PCR扩增反应，其中，图2～4分别为退火和延伸的时间为10s、8s或6s的标准曲线，扩增结果分别如表5～7所示。表5为退火和延伸的温度均为56℃、退火和延伸的时间均为10s的结果，表6为退火和延伸的温度均为56℃、退火和延伸的时间均为8s的结果，表7为退火和延伸的温度均为56℃、退火和延伸的时间均为6s的结果。表5中“copies/reaction”是指每个反应中慢病毒穿梭质粒的总拷贝数，下文其他表格同理。

表5

表6

表7

(4)在实施例1表2的基础上，维持预变性和变性的参数不变，将退火的和延伸的温度均设为60℃，退火和延伸的时间设为1min，对步骤(2)的实时荧光定量PCR反应体系进行实时荧光定量PCR扩增反应。其中，退火和延伸的温度均为60℃、退火和延伸的时间均为1min的标准曲线如图5所示，实时荧光定量PCR扩增反应结果如表8。

表8

由表5～8可知，退火和延伸温度均为56℃，退火和延伸时间均为10s、8s或6s，实时荧光定量PCR的检测灵敏度均可以达到100copies/reaction。退火和延伸温度均为60℃，退火和延伸时间均为1min的灵敏度1×10³copies/reaction。

(5)在实施例1表2的基础上，维持预变性和变性的参数不变，将退火的和延伸的温度均设为60℃或62℃，退火和延伸的时间设为2s，对步骤(2)的实时荧光定量PCR反应体系进行实时荧光定量PCR扩增反应。其中，退火和延伸的温度均为60℃、退火和延伸的时间均为2s时的标准曲线如图6所示，实时荧光定量PCR扩增反应结果如表9；退火和延伸的时间均为62℃、退火和延伸的时间均为2s的标准曲线如图7所示，实时荧光定量PCR扩增反应结果如表10。

表9

表10

由表9和表10可知，退火和延伸时间为2s，退火和延伸温度为62℃时，检测灵敏度只能达到100copies/reaction。退火和延伸时间为2s，退火和延伸温度为60℃时，检测灵敏度能达到50copies/reaction。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳普瑞金生物药业有限公司

<120> 检测重组慢病毒滴度的核酸组合物、试剂盒和方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agatggcgga ggcctacagt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgcatgtga agggcgtcgt 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attgggatga aaggcgagcg ccg 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgctttcccc ctccctattg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agccatggaa aggacgtcag 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggctcggctg ttgggcactg acaat 25

Claims (10)

1.一种检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

用含有重组慢病毒的待测样品感染靶细胞，并提取感染后所述靶细胞中的基因组DNA，所述重组慢病毒上整合有CD247基因；

将所述基因组DNA与检测重组慢病毒滴度的核酸组合物混合后进行实时荧光定量PCR扩增反应，得到CD247基因的Ct值；所述核酸组合物包括引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示，所述探针上连接有荧光基团；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

根据所述CD247基因的Ct值以及由含有CD247基因的质粒标准品建立的标准曲线，得到提取的所述基因组DNA中的CD247基因的浓度；及

根据提取的所述基因组DNA中的CD247基因的浓度、感染前靶细胞的总数和感染后靶细胞的总数，计算所述待测样品中重组慢病毒的滴度。

2.根据权利要求1所述的检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5及ROX中的一种。

3.根据权利要求1所述的检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于，在所述实时荧光定量PCR扩增反应中，退火的温度为56℃～62℃，退火的时间为2s～10s，延伸的温度为56℃～62℃，延伸时间为2s～10s。

4.根据权利要求1所述的检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于，所述靶细胞为293T细胞。

5.根据权利要求1所述的检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于，在所述实时荧光定量PCR扩增反应体系中，上游引物和下游引物的浓度分别为0.2μM/μL～0.4μM/μL。

6.根据权利要求5所述的检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于，在所述实时荧光定量PCR扩增反应体系中，所述上游引物和所述下游引物的浓度分别为0.3μM/μL。

7.根据权利要求1所述的检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于，在所述实时荧光定量PCR扩增反应体系中，基因组DNA的浓度为50ng/μL～500ng/μL。

8.根据权利要求7所述的检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于，在所述实时荧光定量PCR扩增反应体系中，所述基因组DNA的浓度为90ng/μL～110ng/μL。

9.根据权利要求1所述的检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于，所述由含有CD247基因的标准品建立的标准曲线通过如下操作得到：

将CD247基因标准品进行梯度稀释，获得梯度浓度的所述CD247基因标准品；

将每一个浓度的所述CD247基因标准品分别与所述检测重组慢病毒滴度用的核酸组合物混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，获取扩增每一个浓度的所述CD247基因标准品的Ct值；及

根据所述CD247基因标准品的Ct值与浓度的对应关系建立所述CD247基因标准品的标准曲线。

10.根据权利要求2～9任一项所述的检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于，所述根据提取的所述基因组DNA中的CD247基因的浓度、感染前靶细胞的总数和感染后靶细胞的总数，计算所述待测样品中重组慢病毒的滴度的步骤包括：

根据提取的所述基因组DNA中的CD247基因的浓度和提取的感染后靶细胞中基因组DNA的体积，计算感染后靶细胞中CD247基因的总拷贝数；及

根据公式：

计算所述待测样品中重组慢病毒的滴度。