CN115948470B - 重组慢病毒载体和293t-cd3细胞系及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种重组慢病毒载体和293T‑CD3细胞系及其构建方法与应用。该重组慢病毒载体包含CD3D、CD3G、CD3E和CD247表达盒；其中，CD3D、CD3G、CD3E和CD247各分子间以2A肽编码核酸分子相连，并在3′端连接真核抗性基因；且CD3D、CD3G、CD3E、CD247和真核抗性基因位于同一表达盒内。本发明还提供一种基因改造的293T‑CD3细胞株，该细胞株可稳定表达CD3。该基因改造的293T‑CD3细胞株用于测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，TCR和CD3同时表达于细胞表面，为流式检测TCR的表达进而快速简便地判断TCR‑慢病毒的滴度奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种重组慢病毒载体和293T-CD3细胞系及其构建方法与应用。
背景技术
293T细胞是由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。许多真核表达载体如pcDNA3.1中含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平。同时，293T细胞容易被VSV-G包膜的慢病毒转导，因此293T细胞广泛应用于慢病毒的包装。
慢病毒是细胞工程领域的主要传递载体，但目前还没有统一的慢病毒滴定的标准。目前最常规的慢病毒滴度的方法是使用qPCR来估计前病毒拷贝的数量，该前病毒已经整合到了滴定细胞的基因组中。
当293T细胞用于检测表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，如果按照传统的qPCR法通过估计前病毒拷贝的数量来测定病毒滴度的话，由于存在TCR基因可能无法表达的情况或者是TCR能够表达但无法呈递到细胞表面的情况，会导致检测到病毒滴度与实际的病毒存在较大差异，从而限制了293T细胞在该领域中的应用。
因此，有必要对滴定表达TCR的慢病毒的方法进行进一步研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的重组慢病毒载体和293T-CD3细胞系及其构建方法与应用。
为了实现本发明目的，本发明提供一种基因改造的293T-CD3细胞株，该细胞株可稳定表达CD3。该基因改造的293T-CD3细胞株用于测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，TCR和CD3同时表达于细胞表面，为流式检测TCR的表达进而快速简便地判断TCR-慢病毒的滴度奠定了基础。
第一方面，本发明提供一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包含CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子；其中，各编码核酸分子间以2A肽编码核酸分子相连；且CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子位于同一表达盒内。
本发明中，CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子在所述表达盒中的连接顺序没有特别的限制，只要表达后能够组装成完整的CD3分子即可。根据本发明一种优选的实施方式，在所述表达盒中，CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子从5’端到3’端按顺序依次连接。
本发明中，CD3D、CD3G、CD3E和CD247的核苷酸序列可以为CD3D、CD3G、CD3E和CD247的公知序列，优选分别如SEQ ID No.1-4所示。
本发明中，所述2A肽编码核酸分子可以选自F2A的编码核酸分子、T2A的编码核酸分子、E2A的编码核酸分子和P2A的编码核酸分子等中的至少一种。其中，所述F2A的编码核酸分子的核苷酸序列可以为本领域所公知的，优选如SEQ ID NO.6所示。所述T2A的编码核酸分子的核苷酸序列可以为本领域所公知的，优选如SEQ ID NO.7所示。所述E2A的编码核酸分子的核苷酸序列可以为本领域所公知的，优选如SEQ ID NO.8所示。所述P2A的编码核酸分子的核苷酸序列可以为本领域所公知的，优选如SEQ ID NO.9所示。
本发明中，尽管只要将各编码核酸分子以2A肽编码核酸分子相间隔即可实现本发明的目的，但本发明的发明人在研究中发现，当各编码核酸分子间以如下方式相连时能够进一步提高以本发明方法测定的滴度的准确性。因此，根据本发明一种优选的实施方式，所述表达盒包含编码CD3D-F2A-CD3G-T2A-CD3E-E2A-CD247的核酸分子，更优选地，所述表达盒包含如SEQ ID NO.5所示的核酸分子。
进一步地，所述表达盒还包含抗性基因。
优选地，所述抗性基因位于所述表达盒的3’端。
优选地，所述抗性基因为真核抗性基因。更优选地，所述真核抗性基因为潮霉素抗性基因(HygR)、杀稻瘟菌素S抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或腐草霉素D1抗性基因等。
本发明中，所述表达盒优选由真核启动子驱动；所述真核启动子优选为EF-1α、CMV、SV40或PGK1等。
本发明中，所述表达盒的终止子优选为TGA、TAG或TAA。
优选地，所述表达盒包含真核抗性基因，在这种情况下，CD3D、CD3G、CD3E、CD247和真核抗性基因的顺序可以互换，各2A肽编码核酸分子也可以互换。但本发明的发明人在研究中发现，如果真核抗性基因位于CD3相关元件之间，会降低CD3各分子表达时的剪切效率(降低率在2-5％之间)，从而影响CD3分子的完整表达率，因此，优选地，CD3D、CD3G、CD3E、CD247的插入位点介于启动子(如EF-1α)之后和真核抗性基因(例如HygR)之前，以保证CD3分子在真核细胞中的完整表达。根据本发明一种优选的实施方式，所述抗性基因为潮霉素抗性基因(HygR)，所述表达盒包含编码CD3D-F2A-CD3G-T2A-CD3E-E2A-CD247-P2A-HygR的核酸分子。
本发明的重组慢病毒载体中，酶切位点不是必需的，即，可以不含有酶切位点。
第二方面，本发明提供一种293T-CD3细胞系，其含有上述的重组慢病毒载体，且所述293T-CD3细胞系能够表达CD3蛋白。
本发明还提供一种293T-CD3细胞系(生物材料名称293T-CD3-3#)，其保藏编号为CGMCC NO.45185。该细胞系在表达TCR的慢病毒的滴度测定方面具有显著优势，其具有更高的准确率。
第三方面，本发明提供293T-CD3细胞系的构建方法，其包括：将上述的重组慢病毒载体和慢病毒包装载体转染293T细胞，获得包装的慢病毒颗粒，然后用所述慢病毒颗粒转染293T细胞。
第四方面，本发明提供上述293T-CD3细胞系或按照上述构建方法获得的293T-CD3细胞系在测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度中的应用。
其中，所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用，例如在科研阶段用于初步测定TCR的表达，在产品生产中对制备的TCR病毒的滴度进行检测/质控等。
第五方面，本发明提供一种测定表达TCR的慢病毒的滴度的方法，其包括以下步骤：
(1)使表达TCR的慢病毒感染上述293T-CD3细胞系或按照上述构建方法获得的293T-CD3细胞系；
(2)用抗CD3的抗体对感染的293T-CD3细胞进行染色，并检测细胞阳性率；
(3)通过细胞阳性率计算所述表达TCR的慢病毒的滴度。
本发明中，所述细胞阳性率可以通过流式进行检测。
本发明中，可以通过波松分布累积阳性率(如表1所示)来反推MOI(感染复数，感染时病毒与细胞数量的比值)精确值，然后根据病毒数目计算病毒滴度。
第六方面，本发明提供一种用于测定表达TCR的慢病毒的滴度的试剂盒，所述试剂盒包含上述293T-CD3细胞系或按照上述构建方法获得的293T-CD3细胞系。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供的基因改造的293T-CD3细胞株用于测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，TCR和CD3同时表达于细胞表面，可直接通过测定CD3来间接反应TCR的表达量，为流式检测TCR的表达，进而更快更简便地判断TCR-慢病毒的滴度奠定了基础。
(二)相较于使用TCR的抗体，由于其制备困难，且不同TCR的抗体不同，使用CD3抗体对CD3进行检测来间接反应TCR的表达，一方面，可以有效控制成本，另一方面，大大简化了操作程序。
(三)由于TCR通常以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物，因此，通过测定CD3来反应TCR的表达具有理论上的可操作性，且测定的滴度更接近于真实的活性病毒数，对后续使用的指导意义更强。
(四)当293T细胞用于检测表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，如果按照传统的qPCR法通过估计前病毒拷贝的数量来测定病毒滴度的话，由于存在TCR基因可能无法表达的情况或者是TCR能够表达但无法呈递到细胞表面的情况，会导致检测到病毒滴度与实际的病毒存在较大的差异，而用本发明提供的293T-CD3细胞株测定病毒滴度，测定结果与实际结果一致性更高。
(五)本发明提供的293T-CD3细胞系CGMCC NO.45185在表达TCR的慢病毒的滴度测定方面具有显著优势，其具有更高的准确率。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中构建的重组慢病毒载体lenti-CD3-HYG质粒图谱。
图2为本发明较佳实施例中抗CD3-FITC染色流式检测结果。其中，纵坐标SSC-A即侧向角散射，它的值代表细胞的颗粒度或复杂程度。横坐标Comp-GFP-A表示CD3-FITC抗体染色后的荧光强度，越靠右代表细胞表面结合的荧光抗体越多。
图3为lenti-T1367载体的图谱。
图4为lenti-T1405载体的图谱。
具体实施方式
本发明提供一种基因改造的293T-CD3细胞株，该细胞株可稳定表达CD3。该基因改造的293T-CD3细胞株用于测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，TCR和CD3同时表达于细胞表面，为流式检测TCR的表达进而快速简便地判断TCR-慢病毒的滴度提供有效技术手段。
本发明还提供一种重组慢病毒载体，其是携带全部4种类型CD3亚基表达基因的慢病毒载体。该慢病毒载体可用于包装病毒，然后使用包装获得的病毒转导293T细胞，通过抗性筛选即可获得293T-CD3细胞株。
本发明还提供一种293T-CD3细胞株的制备方法，该方法包括：
(1)使用上述重组慢病毒载体和慢病毒包装载体转染293T细胞，以进行慢病毒的包装，获得包装的慢病毒颗粒；
(2)使用步骤(1)的慢病毒颗粒转导293T细胞，并通过筛选获得293T-CD3细胞株。
本发明还提供按照上述方法获得的293T-CD3细胞株。
本发明还提供所述293T-CD3细胞株在测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度中的应用。
本发明还提供一种测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度的方法，该方法包括：
(1)使表达TCR的慢病毒感染所述的293T-CD3细胞株；
(2)使用抗CD3的抗体对感染的293T-CD3细胞株进行染色，并检测细胞阳性率；
(3)通过细胞阳性率计算表达TCR的慢病毒的滴度。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括所述的293T-CD3细胞株。
需要说明的是，本发明所提及的TCR可以为现有的以及未来可能开发的任意TCR，只要需要测定表达该TCR的慢病毒的病毒滴度，无论该TCR有没有生物学功能，皆可通过本发明的技术方案实现。例如，本发明中所述的TCR可以为HPV相关的TCR，可以为KRAS相关的TCR，可以为MAGE-A1相关的TCR，可以为gp100相关的TCR，等等。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的设备和试剂均常规市售可得。
实施例1重组慢病毒载体的构建
本实施例在慢病毒载体lentiCas9-Blast(购自addgene，货号52962)中插入CD3-HYG表达盒，得到构建的重组慢病毒载体(lenti-CD3-HYG，如图1所示)，其中，CD3D、CD3G、CD3E、CD247(CD3H,CD3Q,CD3Z)，各分子间以F2A、T2A、E2A相连，序列为如SEQ ID NO.5所示的核酸序列，并后接P2A肽(序列SEQ ID NO.9所示核苷酸编码的肽)和HygR(本领域公知序列)表达框。
其中，启动子EF-1α可以替换为常规的真核启动子，包括但不限于CMV、SV40、PGK1。
抗性基因HygR也可以替换为其他的常规抗生素抗性基因，如杀稻瘟菌素S抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或腐草霉素D1抗性基因等。
插入基因的终止子为TGA、TAG或TAA。
此外，本发明的载体构建中酶切位点不是必需的，即，可以不含有上述酶切位点。
实施例2 293T-CD3细胞系的构建
用上述构建的lenti-CD3-HYG载体和慢病毒包装载体pCMV-VSV-G(购自addgene，货号8454)、psPAX2(购自addgene，货号12260)共同转导293T细胞，细胞内包装慢病毒，然后浓缩纯化慢病毒，最后以包装获得的慢病毒转导293T细胞，利用慢病毒载体所含抗性对应的抗生素HygR持续作用转导后的细胞，得到293T-CD3细胞。
本实施例进一步对以上述方法得到的293T-CD3细胞株进行遗传稳定性测试，以及按照实施例3的方法进行准确率测试，最终筛选出一株准确率高且遗传性能稳定的293T-CD3细胞株(生物材料名称293T-CD3-3#)，其于2022年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名：293T细胞(人肾上皮细胞)，保藏编号为CGMCCNO.45185。
实施例3TCR病毒滴度测定
本实施例提供一种TCR病毒滴度测定方法，具体包括：
1、1:50稀释的饱和I型鼠尾胶原蛋白处理12孔板，500μl/孔，包被1分钟，吸净胶原液体。
2、将293T-CD3细胞接种至12孔板，每个孔接种2×105个细胞。
3、在慢病毒载体lentiCas9-Blast(购自addgene，货号52962)中插入T1367(一个针对MAGE A1，HLA-A*0201限制性的TCR，序列如SEQ ID No.10所示)表达盒，得到重组慢病毒载体lenti-T1367，载体图谱如图3所示。用构建的lenti-T1367载体和慢病毒包装载体pCMV-VSV-G(购自addgene，货号8454)、psPAX2(购自addgene，货号12260)共同转染293T细胞，包装好的慢病毒(T1367 TCR)分泌到上清中，然后浓缩纯化慢病毒。按比例稀释浓缩的T1367 TCR慢病毒。具体为取9μl病毒，倍比稀释。取8μl稀释过的病毒液，对应含4、2、1、0.5、0.25μl病毒原液，加入到293T-CD3细胞孔中，混匀。
4、培养感染过夜，24hr后加入新的含有10％(体积)胎牛血清的DMEM培养基。
5、感染48小时后，胰蛋白酶充分消化细胞以使得细胞分散为单个细胞，抗CD3-FITC染色，流式检测细胞阳性率。取阳性率在10％～60％各孔计算得到病毒滴度的平均值。根据波松分布累积阳性率(表1)，反推MOI(感染复数，感染时病毒与细胞数量的比值)精确值，然后根据病毒数目计算病毒滴度。
例如，感染时细胞数目为2×105，1μl病毒原液孔流式阳性率45.12％，则MOI对应0.6，感染时病毒的数量为0.6×2×105＝1.2×105个TU，则病毒滴度为1.2×105TU/μl＝1.2×108TU/ml。
具体抗CD3-FITC染色流式检测结果及计算获得的病毒滴度如图2所示。
细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越大。因此根据细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，可对细胞进行分群和分类。
图2中，A：转导阳性率49.9％，经计算其病毒滴度为1.38×108TU/ml；B：转导阳性率13.6％，经计算其病毒滴度为2.9×107TU/ml；C：转导阳性率33.9％，经计算其病毒滴度为8.2×107TU/ml。
6、取步骤5充分消化的细胞，进行TCR染色，染色抗体分别是PE anti-human CD3(购自Biolegend，货号300308)、APC-anti-mouse TCRβchain(购自Biolegend，货号109212)，流式检测TCR阳性细胞的阳性率，并按照如下方法计算本发明方法的准确性。
准确率(％)＝CD3-FITC染色阳性率/TCR染色阳性率×100％；
结果显示，准确率在95-99％之间。
本实施例进一步通过对表达T1405 TCR(一个针对MAGE A1，HLA-A*0201限制性的TCR，序列如SEQ ID No.11所示)的病毒按照如上的方法进行病毒滴度测试(在慢病毒载体lentiCas9-Blast中插入T1405表达盒，得到的重组慢病毒载体lenti-T1405的图谱如图4所示)，并进一步计算准确率，准确率均在准确率在95-99％之间。
表1
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (17)
1.重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体包含CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子；其中，各编码核酸分子间以2A肽编码核酸分子相连；且CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子位于同一表达盒内；CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子从5’端到3’端按顺序依次连接；CD3D、CD3G、CD3E和CD247的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-4所示。
2.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述表达盒还包含抗性基因。
3.根据权利要求2所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述抗性基因位于所述表达盒的3’端；和/或
所述抗性基因为真核抗性基因。
4.根据权利要求3所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述真核抗性基因为潮霉素抗性基因。
5.根据权利要求1-4任一项所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述2A肽编码核酸分子选自F2A的编码核酸分子、T2A的编码核酸分子、E2A的编码核酸分子和P2A的编码核酸分子中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述表达盒包含编码CD3D-F2A-CD3G-T2A-CD3E-E2A-CD247的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述表达盒为SEQ ID NO.5所示的核酸分子；和/或
所述表达盒由编码CD3D-F2A-CD3G-T2A-CD3E-E2A-CD247-P2A-HygR的核酸分子组成。
8.根据权利要求1-4、6或7任一项所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述表达盒由真核启动子驱动；和/或
所述表达盒的终止子为TGA、TAG或TAA。
9.根据权利要求5所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述表达盒由真核启动子驱动；和/或
所述表达盒的终止子为TGA、TAG或TAA。
10.根据权利要求8所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述真核启动子为EF-1α、CMV、SV40或PGK1。
11.根据权利要求9所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述真核启动子为EF-1α、CMV、SV40或PGK1。
12.293T-CD3细胞系，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.45185。
13.293T-CD3细胞系，其特征在于，所述293T-CD3细胞系含有权利要求1-11任一项所述的重组慢病毒载体，且所述293T-CD3细胞系能够稳定表达CD3蛋白。
14.293T-CD3细胞系的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将权利要求1-11任一项所述的重组慢病毒载体和慢病毒包装载体转染293T细胞，获得包装的慢病毒颗粒，然后用所述慢病毒颗粒转染293T细胞，筛选能够稳定表达CD3蛋白的293T-CD3细胞系。
15.权利要求12或13所述的293T-CD3细胞系或按照权利要求14所述的构建方法获得的293T-CD3细胞系在测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度中的应用，所述应用为非疾病诊断或治疗目的的应用。
16.一种非疾病诊断或治疗目的的测定表达TCR的慢病毒的滴度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使表达TCR的慢病毒感染权利要求12或13所述的293T-CD3细胞系或权利要求14所述的构建方法获得的293T-CD3细胞系；
(2)用抗CD3的抗体对感染的293T-CD3细胞进行染色，并检测细胞阳性率；
(3)通过细胞阳性率计算所述表达TCR的慢病毒的滴度。
17.用于测定表达TCR的慢病毒的滴度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求12或13所述293T-CD3细胞系或权利要求14所述的构建方法获得的293T-CD3细胞系。
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