CN114231649A

CN114231649A - 检测torch五种病原体的引物探针组合、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN114231649A
Application number: CN202111596279.0A
Authority: CN
Inventors: 杜锦然; 黄仕艺; 白立宽; 李彦鹏; 乔晓颖; 胖铁良
Original assignee: Langfang Norway Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Langfang Norway Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2022-03-25

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种检测TORCH五种病原体的引物探针组合、试剂盒及其应用，所述引物探针组合包括5对引物及其对应的探针；所述试剂盒中包含上述引物探针组合，用于检测在检测/辅助检测TORCH五种病原体。本发明的引物探针组合对相应的TORCH五种病原体的灵敏度高于现有的引物探针组合；本发明的试剂盒能够分为2组，同时检测出五种病原体，且检测方法操作简便、灵敏高、特异性好、用时短，具有很好的临床应用价值。

Description

检测TORCH五种病原体的引物探针组合、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种引物探针组合及其应用，尤其涉及一种检测TORCH五种病原体的引物探针组合、试剂盒及其应用。

背景技术

TORCH是一组可导致先天性宫内感染及围产期感染的病原体，包括弓形虫(TOX)、风疹病毒(RV)、人巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒I型(HSV1)和单纯疱疹病毒II型(HSV2)。

育龄妇女感染TORCH中的一种或多种病原体后，病原体会通过胎盘垂直传播给胎儿，进而导致流产、早产、死胎及畸形儿。弓形虫感染还会引起的胎儿畸形包括脑积水、小脑畸形、脉络膜视网膜炎及脑钙化，风疹病毒感染会引起胎儿先天性白内障、先天性心脏病和神经性耳聋，巨细胞病毒感染会引起胎儿生长迟缓、小头形、脑炎、视网膜脉膜炎、黄疸、肝脾肿大、溶血性贫血等，单纯疱疹病毒I/II型感染会引起流产或新生儿发病。因此，对于这五种TORCH病原体的检测尤为重要。

目前，临床上检测TORCH病原体主要是采用免疫学方法，如ELISA或胶体金法，通过检测人体感染病原体后产生的IgG或IgM，IgM为近期感染或潜伏的病毒被激活产生复发感染，IgG则为既往感染，已有一定的免疫水平。但用免疫学方法检测上述5种病原体不仅灵敏度低、特异性差，而且感染后到产生IgG或IgM存在一定的窗口期，从而导致检测结果呈假阴性，并且由于目前的检测手段使用的试剂复杂、操作时间长，不利于患者及时得知检测结果。

PCR与ELISA方法相比有以下优点：标本需要量少，取材容易；抽提的DNA可长期保存使用，实验方法更加可靠；判断实验结果比较简单、客观；实验快捷简便、特异性强、灵敏度高、稳定性好，但设备及实验条件要求严格。因此，亟待设计一种灵敏度高、特异性好、实验操作简单、耗时短，并且能够同时检测TORCH五种病原体的多重PCR检测方法。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种检测TORCH五种病原体的引物探针组合、试剂盒及其应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种检测TORCH五种病原体的引物探针组合，

检测弓形虫(TOX)的正向引物如SEQ ID NO：1所示，反向引物如SEQ ID NO：2所示，探针如SEQ ID NO：3所示；

检测风疹病毒(RV)的正向引物如SEQ ID NO：4所示，反向引物如SEQ ID NO：5所示，探针如SEQ ID NO：6所示；

检测人巨细胞病毒(CMV)的正向引物如SEQ ID NO：7所示，反向引物如SEQ ID NO：8所示，探针如SEQ ID NO：9所示；

检测单纯疱疹病毒I型(HSV1)的正向引物如SEQ ID NO：10所示，反向引物如SEQID NO：11所示，探针如SEQ ID NO：12所示；

检测单纯疱疹病毒II型(HSV2)的正向引物如SEQ ID NO：13所示，反向引物如SEQID NO：14所示，探针如SEQ ID NO：15所示。

一种包含上述检测TORCH五种病原体的引物探针组合的试剂盒。

进一步的，所述试剂盒的检测分为2组，每组4个通道，分别为：第一组检测弓形虫(TOX)、风疹病毒(RV)和人巨细胞病毒(CMV)；第二组检测单纯疱疹病毒I型(HSV1)和单纯疱疹病毒II型(HSV2)。

进一步的，所述试剂盒中的试剂包括：2组引物探针组合液、2×PCR buffer、DNA聚合酶和逆转录酶。

进一步的，2组中的任一单组所述引物探针组合液中含有的任一引物的浓度均为5μmol/L、任一探针的浓度均为2.5μmol/L。

一种上述试剂盒在检测/辅助检测五种TORCH病原体中的应用。

进一步的，所述应用的具体步骤是取待测样本分别与试剂盒中的试剂混合制成2组反应体系，再分别加入核酸扩增反应液中稀释，进行PCR扩增反应，获得2组扩增曲线图和CT值，再根据所得2组扩增曲线图和CT值判断待测样本呈阳性/阴性。

进一步的，单组所述反应体系为待测样本2μL、2×PCR buffer 10μL、DNA聚合酶0.5μL、逆转录酶0.5μL和单组引物探针组合液2μL，补DEPC水至20μL。

进一步的，所述应用过程中，还需对阳性质控品和阴性质控品进行检测。

进一步的，PCR扩增反应的条件为50℃预变性10min，95℃变性5min，1个循环，95℃变性15s、60℃退火延伸并收集荧光55s，40个循环。

本发明的检测TORCH五种病原体的引物探针组合、试剂盒及其应用的有益效果为：

本发明的引物探针组合对相应的病原体检测的灵敏度高于现有的引物探针组合；

本发明的试剂盒能够分2组通道，同时检测出五种TORCH病原体，且检测方法操作简便、灵敏高、特异性好、用时短，具有很好的临床应用价值。

本发明的试剂盒能够实现样本的多重检测，可对样本进行批量检测。

附图说明

图1是本发明实施例1中TOX引物探针组合单重PCR筛选实验结果图；

图2是本发明实施例1中RV引物探针组合单重PCR筛选实验结果图；

图3是本发明实施例1中CMV引物探针组合单重PCR筛选实验结果图；

图4是本发明实施例1中HSV1引物探针组合单重PCR筛选实验结果图；

图5是本发明实施例1中HSV2引物探针组合单重PCR筛选实验结果图；

图6是本发明实施例1中第一组引物探针组合混筛实验结果图；

图7是本发明实施例1中第二组引物探针组合混筛实验结果图；

图8是本发明实施例3中试剂盒对TOX病原体的灵敏度测试结果图；

图9是本发明实施例3中试剂盒对RV病原体的灵敏度测试结果图；

图10是本发明实施例3中试剂盒对CMV病原体的灵敏度测试结果图；

图11是本发明实施例3中试剂盒对HSV1病原体的灵敏度测试结果图；

图12是本发明实施例3中试剂盒对HSV2病原体的灵敏度测试结果图；

图13是本发明实施例4中试剂盒对TOX病原体的检出限稳定性测试结果图；

图14是本发明实施例4中试剂盒对RV病原体的检出限稳定性测试结果图；

图15是本发明实施例4中试剂盒对CMV病原体的检出限稳定性测试结果图；

图16是本发明实施例4中试剂盒对HSV1病原体的检出限稳定性测试结果图；

图17是本发明实施例4中试剂盒对HSV2病原体的检出限稳定性测试结果图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

实施例1引物探针组合的设计和筛选

一)引物探针组合的设计

1)引物探针组合设计

通过从中英文文献中查找TORCH五种病原体的特异性基因，通过NCBI查询下载五种靶标病原体的完整基因/部分片段。下载完成后，用DNAMAN软件进行多条序列的比对，确定特异性片段和最保守的区域片段(多条序列重合的区域)

其中特异性片段分别为：

弓形虫(TOX)：

CCACAGGCGAGCTCGCCTGTGCTTGGAGCCACAGAAGGGACAAAAGTCGAGGGGGACTACAGACGCGATGCCGCTCCTCCCACCGTCTTGGAGGAGAGATTCAGGACTGTAGATGAAGGCGAGGGTGAGGATGAGGGGGTGGCGTGGTTGGGAAGCGACGAGAGTCGGAGAGGAAGAAGATGTTTCCGGTCTGGCTGCTTTTCCTGGAGGGTGAAAAAGAGACACCGGAATGCGATCTAGACGAGACGACGCTTTCCTCGTGGTGATGGCGGAGAGAATTGAAGAGTGGAGAAGAGGGCGAGGGAGACAGAGTCGGAGGTCTGGACGAAGGGAGGAGGA GGCGTAAGAA AGGAATCCAAATGCACTG；

风疹病毒(RV)：

GCCTACTCGTCCGGCGGGTACGCGCAGCTGGCGTCCTATTTTAACCCTGGCGGCAGCTACTACAAGCAATACCACCCCACCGCGTGCGACGTTGAACCTGCCTTTGGACACAGCGACGCGGCCTGCTGGGGCTTCCCCACCGACACCGTGATGAGTGTGTTTGCCCTCGCCAGCTACGTCCAGCACCCTGACAAGACCGTCAGGGTCAAGTTCCACACGGAAACCAGAACCGTCTGGCAGCTCTCCGTGGCCGGCGTGTCGTGCAACGTCACGACCGAACATCCGTTCTGCAACACGCCGCACGGACAACTCGAGGTCCAGGTCCCGCCCGACCCCGGCGACCTGGTTGAGTACATCATG；

人巨细胞病毒(CMV)：

AAAAAATATACCCAGACGGAAGAGAAATTCACTGGCGCCTTTAATATGATGGGAGGATGTTTGCAGAATGCCTTAGATATCTTAGATAAGGTTCATGAGCCTTTCGAGGAGATGAAGTGTATTGGGCTAACTATGCAGAGCATGTATGAGAACTACATTGTACCTGAGGATAAGCGGGAGATGTGGATGGCTTGTATTAAGGAGCTGCATGATGTGAGCAAGGGCGCCGCTAACAAGTTGGGGGGTGCACTGCAGGCTAAGGCCCGTGCTAAAAAGGATGAACTTAGGAGAAAGATGATGTATATGTGCTACAGGAATATAGAGTTCTTTACCAAGAACTCAGCCTTCCCTAAGACCACC；

单纯疱疹病毒I型(HSV1)：

TGCCGCTGTTTCAACAGAAATGACCGCCCCCGGGGGGCGGTGCTGTTTGCGGGTTGGCACAAAAAGACCCCGACCCGCGTCTGTGGTGTTTTTGGCATCATGTCGCCGGGCGCCATGCGTGCCGTTGTTCCCATTATCCCATTCCTTTTGGTTCTTGTCGGTGTATCGGGGGTTCCCACCAACGTCTCCTCCACCACCCAACCCCAACTCCAGACCACCGGTCGTCCCTCGCATGAAGCCCCCAACATGACCCAGACCGGCACCACCGACTCTCCCACCGCCATCAGCCTTACCACGCCCGACCACACACCCCCCATGTCAAGTATCGGACTGGAGGAGGAGGAAAAGGAGGAGGGGGCC；

单纯疱疹病毒II型(HSV2)：

ATCGGTGTCT TTTTATTTAT ACACAAGCCC AGCTCCCCTC CCCTCCCCTCCCTTAGAGCTCGTCTTCGTC TCCGGCCTCG TCCTCGTTGT GGAGCGGAGA GTACCTGGCTTTGTTGCGCTTGCGCAGAAC CATGTTGGTG ACCTTGGAGC TAAGCAGGGC GCTCGTGCCCTTCTTTCTGGCCTTGTGTTC CGTGCGCTCC ATGGCCGACA CCAAAGCCAT ATATCGGATCATTTCTCGGGCCTCGGCCAA CTTGGCCTCG TCAAACCCGC CCCCCTCCGC GCCTTCCTCG CCCTCCCCGC；

再将获得的五种靶标病原体的相应DNA序列导入Beacon Designer、oligo、PrimerPrimer 5等生物软件，结合引物探针设计原则和个人探针设计经验，设计引物探针组合，再将设计出的引物探针组合的序列输入至NCBI上进行特异性比对，筛选出能够扩增出相应病原体且不与其它病原体发生特异性扩增的单一引物探针组合，具体见表1。

表1五种TORCH病原体扩增引物和探针

上述探针的5’端标记有荧光报告基团FAM、JOE、ROX或CY5中的其中一种、3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1、BHQ2、BHQ3。

分别对设计的引物探针组合，委托通用生物公司进行合成。

2)引物探针组合筛选

21)单重PCR体系的构建

针对表1中的单一引物探针组合分别单独进行PCR扩增实验，具体过程如下：

分别取表1中的单一引物探针组合，采用DEPC水稀释至10μmol/L，得相应病原体的单一引物探针组合液(单一引物探针组合液中正向引物、反向引物和探针的浓度分别为10μmol/L)；

取10μL的2×PCR buffer、0.5μL的DNA聚合酶、0.5μL逆转录酶和5μ的LDEPC水共同加至PCR8联排管中，再加入2μL单一引物探针组合液，然后加入2μL相应的单病原体的核酸样本混合后(如TOX的引物探针组合液中加入TOX病原体的核酸样本)，得相应的单一反应体系。其中，各基因的探针与扩增的质粒是需要对应的，如TOX对应的探针需用TOX的质粒进行扩增检测。

分别取20μL上述单一反应体系，此时所得相应的单一体系中的引物终浓度为500nM、探针终浓度为250nM。

分别取单一体系，放入荧光定量PCR仪中，进行PCR扩增反应，反应条件为50℃预变性10min，95℃变性5min，1个循环，95℃变性15s、60℃退火延伸并收集荧光55s，40个循环，获得检测结果见图1～5和表2(每种单一引物探针组合液做两组实验)。

同时，以水代替相应的单一核酸，制备相应的单一对照反应体系，按照上述方法进行检测，以判断是否存在因环境污染造成的假阴性的问题。

表2单重PCR筛选实验结果一览表

根据CT值和荧光强度进行探针优劣的筛选，CT值越小说明探针的灵敏度越好，荧光信号值越强(即Rn值越高)，说明引物探针与模板的结合能力更强。由图1～5和表2可以看出，图1中两组单一引物探针组合相差不到1个CT值，但1a对应的单一引物探针组合的扩增曲线均一且稳定，故优选1a；图2中两组单一引物探针组合的CT值相差不大，但2b对应的单一引物探针组合的扩增曲线较好，且荧光值高且稳定，故优选2b；图3中两组单一引物探针组合相差不大，但3b对应的单一引物探针组合的扩增荧光值较高，故优选3b；图4中两组单一引物探针组合的CT值相差不大，4a对应的单一引物探针组合的荧光值较高且稳定性最好，故优选4a；图5中两组单一引物探针组合的CT值相差不大，但5a对应的单一引物探针组合的荧光值较高，故优选5a。

22)多重PRC体系的建立

利用单重PCR体系的构建中筛选(简称单筛)的五种病原体(分别对应的1a、2b、3b、4a、5a)对应的单一引物探针组合利用多重PRC体系进行筛选(简称混筛)。

表3检测探针通道及分组

考虑荧光定量PCR仪只有4种荧光，单组检测一次性最多只能区分4种病原体，且将不同的单一引物探针组合混合进行不同病原体区分检测的困难性，依据同属病原体分为一组，其余属病原体分为一组的原则，进行分组检测(这里需要说明的是，在分组检测过程中，如果引物探针组合间相互干扰或灵敏度检出限不在同一水平，需要重新设计引物探针组合进行筛选，这里仅对最终结果进行介绍)，具体如下：

根据分组原则确定分组，进行多重PCR扩增实验，具体多重PCR扩张实验步骤如下：

分别按分组取相应的单一引物探针组合，采用DEPC水稀释至单组中任一引物的浓度均为5μmol/L、任一探针的浓度均为2.5μmol/L，得相应分组的单组引物探针组合液(单组引物探针组合液共制备2组)；

分别取五种病原体的核酸模板，按分组将对应组的病原体的核酸模板混合，得相应的单组病原体的核酸模板；

取10μL的2×PCR buffer、0.5μL的DNA聚合酶、0.5μL逆转录酶和5μ的LDEPC水共同加至PCR8联排管中，再加入2μL单组引物探针组合液，然后加入2μL核酸样本，得相应的单组反应体系。

分别取20μL单组引物探针反应体系，此时所得单组体系中的任一引物终浓度均为500nM、任一探针终浓度均为250nM；两组中任一单组引物探针反应体系均按照上述方法进行稀释，共得两组单组体系。

分别取两组单组体系，放入荧光定量PCR仪中，进行PCR扩增反应，反应条件为50℃预变性10min，95℃变性5min，1个循环，95℃变性15s、60℃退火延伸并收集荧光55s，40个循环，获得CT值见表3，多重PCR扩增曲线图见图6～7。

同时，以水代替相应的单组病原体的核酸样本，制备相应的单组对照反应体系，按照上述方法进行检测，以判断是否存在因环境污染造成的假阴性的问题。

表4单组引物探针组合对应的分组及通道

反应完成后，根据扩增曲线图和CT值对检测结果进行分析：

在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤37，判断为阳性；无典型“S”型扩增或37＜CT≤40，复检一次，若仍为37-40，判断为阴性。

在CY5通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤37，判断为阳性；无典型“S”型扩增或37＜CT≤40，复检一次，若仍为37-40，判断为阴性。

在JOE通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤37，判断为阳性；无典型“S”型扩增或37＜CT≤40，复检一次，若仍为37-40，判断为阴性。

在ROX通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤37，判断为阳性；无典型“S”型扩增或37＜CT≤40，复检一次，若仍为37-40，判断为阴性。

由表4和图6～7可以看出，第一组和第二组的CT值和扩增曲线都较好，且各单一引物探针组合间相互感染较小，各自起线好，能较好的检出相应的病原体，确定最终选用上述五种引物探针组合，且分为两组进行检测。

经单筛和混筛，最终确定较好的引物探针组合为：

检测弓形虫(TOX)的正向引物如SEQ ID NO：1所示，反向引物如SEQ ID NO：2所示，探针如SEQ ID NO：3所示；检测风疹病毒(RV)的正向引物如SEQ ID NO：4所示，反向引物如SEQ ID NO：5所示，探针如SEQ ID NO：6所示；检测人巨细胞病毒(CMV)的正向引物如SEQ IDNO：7所示，反向引物如SEQ ID NO：8所示，探针如SEQ ID NO：9所示；检测单纯疱疹病毒I型(HSV1)的正向引物如SEQ ID NO：10所示，反向引物如SEQ ID NO：11所示，探针如SEQ IDNO：12所示；检测单纯疱疹病毒II型(HSV2)的正向引物如SEQ ID NO：13所示，反向引物如SEQ ID NO：14所示，探针如SEQ ID NO：15所示。

将五种引物探针组合分为以下2组：

第一组检测弓形虫(TOX)、风疹病毒(RV)和人巨细胞病毒(CMV)；

第二组检测单纯疱疹病毒I型(HSV1)和单纯疱疹病毒II型(HSV2)。

3)试剂盒的制备和应用

利用上述多重PRC体系的建立中确定的引物探针组合及分组制备试剂盒，所制的试剂盒中包括2组引物探针组合液(其中，任一单组引物探针组合液中含有的任一引物的浓度均为5μmol/L、任一探针的浓度均为2.5μmol/L，即第一组引物探针组合液中含有的检测弓形虫、风疹病毒和人巨细胞病毒的引物浓度均为5μmol/L、检测弓形虫、风疹病毒和人巨细胞病毒的探针的浓度均为2.5μmol/L)、2×PCR buffer、DNA聚合酶和逆转录酶。

检测时，取10μL的2×PCR buffer、0.5μL的DNA聚合酶、0.5μL逆转录酶和5μ的LDEPC水共同加至PCR8联排管中，再加入2μL单组引物探针组合液，然后加入2μL待测样本，得单组反应体系(需要注意的是，一次样本检测需要总共制备2组含有不同单组引物探针组合液的反应体系)，此时所得相应的单组体系中的任一引物终浓度均为500nM、任一探针终浓度均为250nM，放入荧光定量PCR仪中，进行PCR扩增反应，反应条件为50℃预变性10min，95℃变性5min，1个循环，95℃变性15s、60℃退火延伸并收集荧光55s，40个循环，获得2组扩增曲线图和CT值，根据2组扩增曲线图和CT值对检测结果分别进行分析，在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤37，判断为阳性；无典型“S”型扩增或37＜CT≤40，复检一次，若仍为37-40，判断为阴性。

当判断结果为阳性时，即为待测样本中含有该病原体。

同时，在检测过程中，还要同时以阳性质控品和阴性质控品分别代替待测样本，按照上述方法进行检测，以判断是否存在反应试剂不达标或环境污染等原因造成的假阳性或假阴性的问题。当存在假阳性或假阴性的问题时，重新进行对待测样本进行相应病原体检测。

实施例2试剂盒的准确性实验

随机选择五种TORCH病原体样本各10例，利用实施例1中的制备的试剂盒和检测方法进行检测，同时将扩增所得的样本进行测序，所得序列经Blast比对，所得测序结果见下表：

表5本发明的试剂盒检测的测序结果一览表

由表4可以看出，本发明的试剂盒对病毒的检测结果与测序结果符合率为100％。

实施例3引物探针组合的灵敏度实验

将五种病原体阳性质粒按实施例1中多重PRC体系的建立得出的病原体分组方式进行分组混合，再分别进行十倍稀释，每组均稀释至浓度为10²～10⁶copies/mL得到5种浓度的病原体阳性质粒溶液(浓度分别为10²copies/mL、10³copies/mL、10⁴copies/mL、10⁵copies/mL和10⁶copies/mL)，利用实施例1中的试剂盒的制备和应用分别对不同组的5种浓度的病原体阳性质粒溶液进行扩增，获得五种病原体对应的检测灵敏度，具体结果见图8～12，由图中可以得知，五种病原体检测的标准曲线和R²值见表5：

表6本发明的试剂盒检测的标准曲线和R²值

本发明的试剂盒的灵敏度可达10²copies/mL，优于专利申请201911150343.5中的试剂盒和市面上绝大多数产品。

实施例4引物探针组合的检出限稳定性实验

将五种病原体阳性质粒的定值标准物质按实施例1中的分组，梯度稀释至检出限浓度(见表7)，得稳定性实验样本；

利用实施例1中的试剂盒的制备和应用分别对同一批稳定性实验样本进行20次重复测定，结果判断标准为必须检出至少18次靶核(即对应病原体)且检出率≥90％，具体结果见表7和图13～17：

表7本发明的试剂盒的检出限稳定性实验结果

由表6～8可以看出，本发明的试剂盒的检出限低且稳定性好，优于专利申请201911150343.5中的试剂盒和市面上绝大多数产品。

实施例5引物探针组合的实际临床样本检测

本实施例所采用临床样本来自河北省廊坊市地区医院于采集的血液样本(采集者自愿的原则)，血液量大于1mL，共500例，对血液样本提取病原体核酸，利用本发明的试剂盒和检测方法进行检测，通过与内对照品和阳性对照品进行比较，检测的阳性率为3.8％，用时1.5h。

对血液样板提取的病原体核酸，采用传统的病原体培养法进行检测，检测的阳性率为3.8％，用时7d。

对血液样板提取的病原体核酸，采用专利申请201911150343.5中的试剂盒进行检测，检测的阳性率为3.8％，用时5.3h。

本发明的试剂盒实际临床样本检测结果与传统病原体培养法的检测结果和专利申请201911150343.5中试剂盒的检测结果一致，但用时明显短于传统病原体培养法的检测用时和专利申请201911150343.5中试剂盒的检测用时。

实际临床样本的具体检测结果见下表：

表12实际临床样本的检测结果一览表

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 廊坊诺道中科医学检验实验室有限公司

<120> 检测TORCH五种病原体的引物探针组合、试剂盒及其应用

<130> 2021-10

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

cgtcttggag gagagatt 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

gactctgtct ccctcgcc 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

atggcggaga gaattgaaga 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

ctgcctttgg acacagcga 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

cttgaccctg acggtcttgt c 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 6

accgtgatga gtgtgtttgc cct 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 7

cagagcatgt atgagaacta catt 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 8

ccgctaacaa gttggggggt gca 23

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 9

gcttgtatta aggagctgca tgatg 25

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 10

gttgttccca ttatcccatt c 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 11

gtggtgccgg tctgggtcat 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 12

ccaacgtctc ctccaccacc c 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 13

cgttgtggag cggagagtac ct 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 14

tcggccatgg agcgcacgga a 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 15

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Claims

1.一种检测TORCH五种病原体的引物探针组合，其特征在于，

检测弓形虫的正向引物如SEQ ID NO：1所示，反向引物如SEQ ID NO：2所示，探针如SEQID NO：3所示；

检测风疹病毒的正向引物如SEQ ID NO：4所示，反向引物如SEQ ID NO：5所示，探针如SEQ ID NO：6所示；

检测人巨细胞病毒的正向引物如SEQ ID NO：7所示，反向引物如SEQ ID NO：8所示，探针如SEQ ID NO：9所示；

检测单纯疱疹病毒I型的正向引物如SEQ ID NO：10所示，反向引物如SEQ ID NO：11所示，探针如SEQ ID NO：12所示；

检测单纯疱疹病毒II型的正向引物如SEQ ID NO：13所示，反向引物如SEQ ID NO：14所示，探针如SEQ ID NO：15所示。

2.包含权利要求1所述的检测TORCH五种病原体的引物探针组合的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测分为2组，分别为：第一组检测弓形虫、风疹病毒和人巨细胞病毒；第二组检测单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的试剂包括：2组引物探针组合液、2×PCR buffer、DNA聚合酶和逆转录酶。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，2组中的任一单组所述引物探针组合液中含有的任一引物的浓度均为5μmol/L、任一探针的浓度均为2.5μmol/L。

6.权利要求2-5中任一项所述的试剂盒在检测/辅助检测五种TORCH病原体中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的具体步骤是取待测样本分别与试剂盒中的试剂混合制成2组反应体系，再分别加入核酸扩增反应液中稀释，进行PCR扩增反应，获得2组扩增曲线图和CT值，再根据所得2组扩增曲线图和CT值判断待测样本呈阳性/阴性。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，单组所述反应体系为待测样本2μL、2×PCR buffer 10μL、DNA聚合酶0.5μL、逆转录酶0.5μL和单组引物探针组合液2μL，补DEPC水至20μL。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述应用过程中，还需对阳性质控品和阴性质控品进行检测。

10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，PCR扩增反应的条件为50℃预变性10min，95℃变性5min，1个循环，95℃变性15s、60℃退火延伸并收集荧光55s，40个循环。