CN112877474A - 一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的引物组、试剂盒以及方法，属于细胞工程领域，所述引物组包括RCL‑1引物组或RCL‑2引物组；所述RCL‑1引物组包括引物FP‑1、引物RP‑1和荧光探针P1；所述RCL‑2引物组包括引物FP‑2、引物RP‑2和荧光探针P2。利用本发明提供的引物组、试剂盒以及方法来检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒，扩增效率高、标准曲线的相关系数高；检测方法具有快速、简单、易操作的特点。

Description

一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的引物 组、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于细胞工程领域，尤其涉及一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的引物组、试剂盒以及方法。
背景技术
随着分子生物学的不断发展，人为构建的基因修饰的细胞越来越多的应用到疾病治疗相关领域。生物病毒作为一种基因转移载体已被广泛地利用和研究；到目前为止，反转录病毒、慢病毒、腺/疱疹病毒和腺相关病毒已作为载体参与基因转移。
慢病毒属于逆转录病毒，最为人熟知的慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)，目前来源于慢病毒的复制缺陷病毒载体已成功用于介导目的基因在靶向细胞的转移和表达。现有的基因治疗产品所用慢病毒载体均是非复制型的，但在病毒包装过程中，可能会由于同源或非同源重组等机制产生复制型慢病毒(RCL)。出于安全、有效、质量可控的考虑，研究人员应当对该类病毒进行有效检测，以避免在细胞移植治疗后，其中的复制型病毒在人体内无法控制的自我复制，对人体造成伤害，防止临床安全性隐患事件。
目前对于复制型病毒的检测多采用共培养法，该方法操作复杂，培养周期长。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞(如DC细胞、CAR-T、NK和PBMCs等)中复制型病毒的引物组、试剂盒以及方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的引物组，包括RCL-1引物组或RCL-2引物组；所述RCL-1引物组包括引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1；所述RCL-2引物组包括引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2；所述引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示，所述引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4～SEQ ID No.6所示。
本发明提供了一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞(如DC细胞、CAR-T、NK和PBMCs等)中复制型病毒的试剂盒，包括所述的引物组和检测试剂。
优选的，所述引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1的使用浓度独立为8～12μmol/L；所述引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2的使用浓度独立为8～12μmol/L。
优选的，所述检测试剂包括qPCR扩增MIX、阳性标准品和阴性质控品。
优选的，所述阳性标准品为复制型的vsvg质粒。
本发明提供了一种检测慢病毒介导基因修饰的细胞中复制型病毒的方法，包括以下步骤：
1)提取待检测细胞的总RNA后反转录获得反转录产物；
2)以步骤1)中获得的反转录产物为模板，以所述的RCL-1引物组或RCL-2引物组为引物进行qPCR扩增获得待检测细胞qPCR扩增的Ct值；
3)当Ct值≥33.92时，所述待检测细胞中不存在复制型病毒，当Ct值＜33.92时，所述待检测细胞中存在复制型病毒。
优选的，步骤2)中所述qPCR扩增的扩增体系，以20μL计，包括RNA模板4μL、引物FP-10.4μL、引物RP-10.4μL、荧光探针P10.4μL、qPCR扩增MIX 10μL和ddH2O 4.8μL；
或者包括RNA模板4μL、引物FP-20.4μL、引物RP-20.4μL、荧光探针P20.4μL、qPCR扩增MIX 10μL和ddH2O 4.8μL。
优选的，步骤2)中所述qPCR扩增的扩增程序包括以下步骤：95℃10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。
优选的，步骤1)中所述待检测细胞设置2～4个重复。
优选的，当采用RCL-2引物组为引物进行qPCR扩增时，将所述反转录产物线性化后作为模板。
本发明的有益效果：利用本发明提供的引物组、试剂盒以及方法来检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒，扩增效率高、标准曲线的相关系数高；检测方法具有快速、简单、易操作的特点。
附图说明
图1为线性质粒和环状质粒凝胶电泳示意图；
图2为用RCL-1引物组对VSVG环状质粒进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线；
图3为用RCL-2引物组对VSVG环状质粒进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线；
图4为用RCL-1引物组对VSVG线性质粒进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线；
图5为用RCL-2引物组对VSVG线性质粒进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞(如DC细胞、CAR-T、NK和PBMCs等)中复制型病毒的引物组，包括RCL-1引物组或RCL-2引物组；所述RCL-1引物组包括引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1；所述RCL-2引物组包括引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2；所述引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示，所述引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4～SEQ IDNo.6所示；在本发明中，所述荧光探针P1和荧光探针P2优选的分别在5’端修饰荧光基团6-FAM，3’端修饰荧光基团BHQ1；本发明涉及的引物和荧光探针的具体序列如表1所示。本发明对所述引物的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的人工合成方法即可。
表1引物、荧光探针序列
Figure BDA0002944329940000031
Figure BDA0002944329940000041
本发明还提供了一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞(如DC细胞、CAR-T、NK和PBMCs等)中复制型病毒的试剂盒，包括所述的引物组和检测试剂。在本发明中，所述引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1的使用浓度优选的独立为8～12μmol/L，更优选为10μmol/L；所述引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2的使用浓度优选的独立为8～12μmol/L，更优选为10μmol/L。在本发明中，所述检测试剂优选的包括qPCR扩增MIX、阳性标准品和阴性质控品。在本发明中，所述qPCR扩增MIX优选为
Figure BDA0002944329940000042
Genotyping MasterMix；所述阳性标准品优选为复制型的vsvg质粒，所述复制型的vsvg质粒的大小优选为6507bp；在本发明中，所述复制型的vsvg质粒(pCMV-VSV-G，addgene，#8454)，所述复制型的vsvg质粒的使用浓度优选为106copies/μL。在本发明中，所述阴性质控品优选为ddH2O。
本发明还提供了一种检测慢病毒介导基因修饰的细胞中复制型病毒的方法，包括以下步骤：1)提取待检测细胞的总RNA后反转录获得反转录产物；2)以步骤1)中获得的反转录产物为模板，以所述的RCL-1引物组或RCL-2引物组为引物进行qPCR扩增获得待检测细胞qPCR扩增的Ct值；3)当Ct值≥33.92时，所述待检测细胞中不存在复制型病毒，当Ct值＜33.92时，所述待检测细胞中存在复制型病毒。
在本发明中，提取待检测细胞的总RNA后反转录获得反转录产物。在本发明中，所述待检测细胞为慢病毒介导的基因修饰细胞；本发明对所述待检测细胞的种类(如DC细胞、CAR-T、NK和PBMCs等)没有特殊限定，任何经过慢病毒介导的基因修饰细胞均可。在本发明中，所述提取待检测细胞的总RNA优选的采用RNA提取试剂盒进行，在本发明具体实施过程中，优选的采用动物组织/细胞总RNA提取试剂盒#ZP404进行，具体操作参见试剂盒说明书记载。
本发明在提取获得所述待检测细胞的总RNA后进行反转录获得反转录产物；在本发明中，所述反转录优选的采用5XAll-In-One RT Master Mix(with AccuRT Genomic DNARemoval Kit)(abm，#G492)进行，具体操作参见试剂盒说明书记载。
本发明在获得所述反转录产物后，以获得的反转录产物为模板，以所述的RCL-1引物组或RCL-2引物组为引物进行qPCR扩增获得待检测细胞qPCR扩增的Ct值。在本发明中，所述qPCR扩增的扩增体系，以20μL计，优选的包括RNA模板4μL、引物FP-10.4μL、引物RP-10.4μL、荧光探针P10.4μL、qPCR扩增MIX 10μL和ddH2O 4.8μL；或者优选的包括RNA模板4μL、引物FP-20.4μL、引物RP-20.4μL、荧光探针P20.4μL、qPCR扩增MIX 10μL和ddH2O 4.8μL。在本发明中，所述qPCR扩增的扩增程序优选的包括以下步骤：95℃10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。在本发明中，所述RCL-1引物组或RCL-2引物组均能够实现对环状质粒和线性质粒的扩增，当采用RCL-2引物组为引物进行qPCR扩增时，更适合线性质粒的扩增，因此优选的将所述反转录产物线性化后作为模板。在本发明中，所述待检测细胞优选的设置2～4个重复，更优选为3个重复。
在本发明中，以不同浓度所述的阳性标准品复制型的vsvg质粒为模板进行qPCR扩增制备标准曲线。在本发明中，将所述阳性标准品复制型的vsvg质粒以10倍梯度稀释至106～101copies/μL，稀释用的稀释液优选为TB溶液。在本发明中，所述标准曲线是以质粒浓度取Log为横坐标，CT为纵坐标，经过线性拟合获得；本发明根据制备获得标准曲线能够计算待检测细胞中质粒的拷贝数，具体计算方式如下：质粒拷贝(copies/μL)＝6.02×1023(copies/mol)×质粒浓度(g/μL)/质粒长度(bp)×660(dalton/bp)。
本发明根据qPCR扩增获得的Ct值确定所述待检测细胞中是否存在复制性病毒，当Ct值≥33.92时，所述待检测细胞中不存在复制型病毒，当Ct值＜33.92时，所述待检测细胞中存在复制型病毒。当所述待检测细胞中存在复制性病毒时，根据标准曲线计算获得qPCR扩增体系中的复制型病毒的拷贝数，用所得复制型病毒的拷贝数(copies/μL)/逆转录初始体积(μL)×RNA原液浓度(ng/μL)，得到待检测细胞原液中复制性病毒的拷贝数(copies/ng)。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
反应体系确定
1.1引物设计，序列如表1所示，引物/探针合成：委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.2模板量的确认：模板体积为2～5μL，在无干扰物情况下不超过总体系的20％为宜，检测限不会改变，考虑加样误差所以加样体积为4μL。
1.3引物探针比的确定：
采用英潍捷基(A30866)mix对不同引物探针比进行试验：等浓度下，分别采用引物探针体积比为1:1和1:2和2:1，以环状VSVG质粒为模板，模板浓度为106～101copies/μL，利用扩增效率和R2进行筛选确定。
反应体系优选的如表2所示。
表2不同探针引物比qPCR的扩增体系
Figure BDA0002944329940000061
表3不同探针引物比qPCR的扩增程序
Figure BDA0002944329940000071
qPCR扩增的实验结果如表4所示。
表4以RCL-1和RCL-2为引物组不同引物探针比的qPCR扩增结果
Figure BDA0002944329940000072
由此可见，当引物和探针体积比为1:1时，扩增效率最高，R2更接近1，因此采用引物和探针体积比为1:1进行后续扩增，具体的扩增体系见表5。
表5优化后的qPCR扩增体系
Figure BDA0002944329940000073
实施例2
标准曲线的制作
环状质粒
提前将DNA纯化磁珠，放置室温(18～28℃)平衡30min。准备一个新1.5mL离心管并标记样品名称。
取2μg VSVG质粒(pCMV-VSV-G，addgene，#8454)补水至100μL于标记好编号的1.5mL离心管中，再加入180μL(1.8×样品体积)磁珠，上下吹吐10次混匀，室温(18℃～28℃)孵育5min。
室温孵育结束，把反应管放到磁力架上，2min后或直到观察溶液澄清后，将上清液吸掉。
加200μL新鲜配制的70％乙醇至1.5mL离心管中，在磁力架上向一个方向(顺时针或逆时针，不要把离心管从磁力架上拿出来)转动离心管清洗珠子，然后弃掉上清。
重复上步操作一次(共用70％乙醇清洗两次)。
70％乙醇清洗结束，短暂离心后放回磁力架上并用10μL枪吸掉残余的液体，室温(18～28℃)干燥5min。
注意：室温干燥时观察磁珠干湿程度，避免磁珠过度干燥，磁珠干燥后表面无水渍即可，如磁珠有裂纹出现需立即进行下步实验操作。
干燥结束加100μL TB(RK153-02)，上下吹打10次混匀，重新放回磁力架上2min，等溶液澄清后，转移上清到一个新1.5mL离心管备用。
Qubit定量检测浓度为500ng/μL。
倍比稀释106、105、104、103、102、101copies/μL。
用RCL-1引物组对VSVG环状质粒进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线图2所示。
用RCL-2引物组对VSVG环状质粒进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线如图3所示。
线性质粒
质粒酶切线性化
采用(Thermo Scientific FastDigest EcoRI；#FD0274)和(FastAPTMThermosensitive Alkaline Phosphatase；#EF0651)进行单酶切及去磷酸化，准备2个1.5mL EP管，分别加2.5μg VSVG质粒，按下面体系配置(酶提前放置冰上)。
表6单酶切和去磷酸化体系
Figure BDA0002944329940000081
Figure BDA0002944329940000091
37℃水浴15min，80℃水浴5min灭活，4℃保存。
电泳跑胶
配置0.7％琼脂糖(Invitrogen Agarase-Molecular Biology Grade；#75510-019)，按体积配比加入染料(GelRed Nucleic Acid Stain；#41003)，15K Marker(Trans15KDNA Marker；#N10415)点样50μL，150v电泳30min后查看电泳图像。结果如图1所示，环状质粒的泳道出现一条条带，线性质粒的泳道出现两条条带，切胶回收1663bp条带。
胶回收(Genejet Gel ExtractionKit；K0691)
加入100μL Binding Buffer，60℃水浴10min，将液体转移到GeneJET纯化柱内，12000rpm离心1min，加入700μL洗液，12000rpm离心1min，换新管14000rpm离心1min后转移至新1.5mL EP管，加100μL TB洗脱液，12000rpm离心1min取出液体备用。
浓度测定(QubitTM1X dsDNA HS Assay Kits；#Q33230)
将
Figure BDA0002944329940000092
Fluorometer仪器放置在平整的台面上；连接电源，打开仪器，取两个0.5mL EP管，分别加入190μL QubitTM1×dsDNA HS Working Solution，分别两个管中加入10μL QubitTM1×dsDNA HS Standard#1和10μL QubitTM1X dsDNA HS Standard#2，震荡混匀离心(避免有气泡)，避光室温静置2min，随后在仪器Home界面选择1×dsDNA HS，选择“Read standards”，将加有校正液1的EP管放入待测区域，盖上仪器盖子，点击Readstandard，再将加有校正液2的EP管放入待测区进行校正，点击Read standard，校正完毕，点击Read sample，读取数据。
倍比稀释
将测定的浓度按下面公式换算成拷贝数，原液以10倍梯度稀释至106～101copies/μL，稀释液为TB，每个浓度重复三次复孔，进行标准曲线的制备。质粒拷贝(copies/μL)＝6.02×1023(copies/mol)×质粒浓度(g/μL)/质粒长度(bp)×660(dalton/bp)。
用RCL-1引物组对VSVG线性质粒片段进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线如图4所示。
用RCL-2引物组对VSVG线性质粒片段进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线如图5所示。
按照实施例1中的引物组、扩增体系和扩增程序进行扩增，实验结果如表7所示：环状质粒在引物RCL-1下得到的扩增效率及R2系数达到初筛标准；线性质粒在引物RCL-2下得到的扩增效率及R2系数达到初筛标准；以线性质粒做模板RCL-2的扩增效率和R2最佳。
表7 RCL-1和RCL-2两种引物组对环状和线性质粒的扩增效率和R2的差异
Figure BDA0002944329940000101
除了将退火温度分别设定为57℃，60℃和63℃，其余条件按照实施例1中的引物组、扩增体系和扩增程序进行扩增，扩增效率和R2如表8所示。
表8不同退火温度下RCL-1和RCL-2两种引物组对环状和线性质粒的扩增效率和R2的差异
Figure BDA0002944329940000102
可见，以环状质粒和线性质粒为模板时，在60℃时扩增效率及R2为最佳，由此将60℃预设为最适Tm，利用RCL-1和RCL-2引物组在60℃下，每个梯度各重复三个复孔进行标准曲线的制备，结果如表9所示。
表9标准曲线制备数据
Figure BDA0002944329940000103
Figure BDA0002944329940000111
实施例3
检测方法的建立
RNA提取(动物组织/细胞总RNA提取试剂盒#ZP404)
1.1匀浆处理
通过离心来沉淀经过修饰培养的DC细胞(见专利ZL201911397010.2)。在细胞裂解液R试剂中用移液枪反复吹打来裂解细胞。每5～10×106的动物细胞加入1mL细胞裂解液R。在加入细胞裂解液R前应避免洗涤细胞，否则会增加mRNA降解的可能性。
1.2将匀浆样品剧烈震荡混匀(涡旋亦可)，在15～30℃条件下孵育5min以使核蛋白体完全分解。
1.3每1mL细胞裂解液R加0.2mL氯仿，盖紧样品管盖，剧烈振荡(涡旋亦可)15s并将其在室温下孵育3min。
1.4于4℃12000rpm离心10min，样品会分成三层：下层有机相、中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加细胞裂解液R体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
建议：①分层后细胞裂解液对RNA的保护作用减弱，因此操作上快些低温更好。②由正中插入液面下缓慢吸取460μL上相，避免扰动带RNase的中间层。一般吸取大约400μL上相即可，不必要尽可能多的吸取含RNA的水相。
1.5加入0.5倍体积无水乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱中，吸附柱套在收集管内。
1.6 12000rpm离心45s，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
1.7加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇！)，12000rpm离心45s，弃掉废液。
1.8加入500μL漂洗液RW，12000rpm离心45s，弃掉废液。
1.9将吸附柱放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
1.10取出吸附柱，放入一个RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加60μL RNase-free water，室温放置2min，12000rpm离心1min。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要RNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积最好不少于30μL，体积过小降低RNA洗脱效率，减少RNA产量。
2 RNA定量(样本制备区)(QubitTMRNA XR Assay Kits#Q33224)
2.1开机
将
Figure BDA0002944329940000121
Fluorometer仪器放置在平整的台面上；连接电源，打开仪器。
2.2校正
取1μL QubitTMRNA XR Reagent按1:200比例加入199μL QubitTMRNA XR Buffer中配置成QubitTMworking solution。取两个0.5mL EP管，分别加入190μL QubitTMworkingsolution，分别两个管中各加入10μL QubitTMRNA XR Standard，震荡混匀离心(避免有气泡)，避光室温静置2min，随后在仪器Home界面选择RNA，选择“RNA Extended Range”，点击“Read standards”将加有校正液1的EP管放入待测区域，盖上仪器盖子，点击“Readstandard”，再将加有校正液2的EP管放入待测区进行校正，点击“Read standard”，校正完毕。
2.3样品定量
取一个0.5mL EP管，加入198μL QubitTMworking solution，再加2μL待测样品，震荡混匀离心(避免有气泡)，避光室温静置2min，随后点击“Run samples”，在sample volume界面选择上样2μL，然后把待测样本放入仪器内，点击“Read tube”进行测量并记录。
3反转录(5X All-In-One RT MasterMix(with AccuRT Genomic DNA RemovalKit)(abm，#G492)
取500ngRNA，加入2μL AccuRT Reaction Mix(4X)，加入适当Nuclease-free H2O至总体积为8μL，42℃孵育2min，加入AccuRT Reaction Stopper(5x)2μL，混匀。加入5XAll-In-One RT MasterMix 4μL，Nuclease-free H2O 6μL，总体积20μL。25℃孵育10min，42℃孵育50min，85℃5min。
4实时荧光定量检测
4.1实验前准备
4.1.1准备实验所用的耗材和试剂，用75％的乙醇擦拭工作台面。
4.1.2将所需组分按试验先后顺序冰上融化，涡旋混匀并短暂离心，放置于冰上。
4.1.3核对并记录相应的样本ID，核对无误后混匀短暂离心置于离心管架上备用。
4.1.4试验使用所有枪头为带滤芯枪头，防止污染。
4.1.5全程使用Rainin移液器，快吸慢打，加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。
4.2 Standard阳性标准品的配置(独立通风橱)
4.2.1Standard(RCL)配置
4.2.1.1质粒酶切线性化
pCMV-VSV-Gg质粒，大小6507bp(addgene，#8454)；采用(Thermo ScientificFastDigest EcoRI；#FD0274)和(FastAPTMThermosensitive Alkaline Phosphatase；#EF0651)对所述RCL-vsvg质粒进行单酶切及去磷酸化，准备1个1.5mL EP管，分别加模板2.5μg质粒，按下面体系配置(酶提前放置冰上)。单酶切和去磷酸化体系如表6所示，去磷酸化操作如下：37℃水浴15min，80℃水浴5min灭活，4℃保存。
4.2.1.2电泳跑胶
配置0.7％琼脂糖(Invitrogen Agarase-Molecular Biology Grade；#75510-019)，按体积配比加入染料(GelRed Nucleic Acid Stain；#41003)，从左到右顺序依次是Marker-酶切前质粒-酶切后，15K Marker(Trans15K DNA Marker；#N10415)点样40μL，酶切前质粒1μL+3μL 6X loading buffer(TransGen Biotech；#J10128)，酶切后直接将50μL样本点入胶内，150v电泳30min后查看电泳图像。
4.2.1.3胶回收(Genejet Gel Extraction Kit；K0691)
加入100μL Binding Buffer，60℃水浴10min，将液体转移到GeneJET纯化柱内，12000rpm离心1min，加入700μL洗液，12000rpm离心1min，换新管14000rpm离心1min后转移至新1.5mL EP管，加100μL TB洗脱液，12000rpm离心1min取出液体备用。
4.2.1.4定量Standard(RCL)，按公式计算出Standard(RCL)原液拷贝数，质粒拷贝(copies/μL)＝6.02×1023(copies/mol)×质粒浓度(g/μL)/质粒长度(bp)×660(dalton/bp)，再将原液稀释至106copies/μL即Standard(RCL)配置完成，配置Standard(RCL)需逐级按10倍梯度稀释，例107copies/μL＝45μL ddH2O+5μL 108copies/μL，一定充分吹打混匀作为下一梯度的模板，Standard需-80℃分装每管10μL保存，每次使用拿出1支，不得反复冻融使用。Standard(RCL)的制备安排在独立的通风橱内操作，与样本制备区隔离开，防止污染。
4.3试剂准备(试剂准备区)
4.3.1每次PCR实验根据待检测样本数、Standard(RCL)、阴性质控品(ddH2O)，共同计算并配制反应液，反应管N＝待测样本数×3个复孔+2Standard(RCL)、1个阴性质控品)。扩增反应体系如表5所示(20μL体系)。
4.3.2首先按上表配置Mix混合液(无核酸酶超纯水+PCR酶混合液+引物FP-1/FP-2+引物RP-1/RP-2+荧光探针P1/P2)，不同引物组分别配制。按10份检测，需配置10×3个复孔+1个阴性质控品，共31个反应孔按9％损耗率配置33个反应配置，无核酸酶超纯水(4.8×33)，PCR酶混合液(10×33)，引物FP-1/FP-2(0.4×33)，引物RP-1/RP-2(0.4×33)，荧光探针P1/P2(0.4×33)于1.5mL EP管中标记Mix充分混匀后短暂离心；再单独按表5配置2个Standard(RCL)反应体系，无核酸酶超纯水(4.8×3)，PCR酶混合液(10×3)，引物FP-1/FP-2(0.4×3)，引物RP-1/RP-2(0.4×3)，荧光探针P1/P2(0.4×3)于1.5mL EP管中标记Mix充分混匀后短暂离心备用。
4.3.3将上述配置好的混合液充分混匀后短暂离心后按每孔16μL分装到96孔上样板孔中，建议更换枪头，增加复孔准确性。
4.4加样(样本制备区)
向每个待检样本对应的2个复孔分别加入4μL模板，阴性质控直接加入到管底，勿吹吸。
4.5封膜
使用
Figure BDA0002944329940000152
480密封薄膜，将薄膜牢牢地压在板的表面，离心。
上机，程序结束后进行分析。
4.6数据分析
扩增效率
目的基因RCL：(N6:101copies/μL；N5:102copies/μL；N4:103copies/μL；N3:104copies/μL；N2:105copies/μL；N1:106copies/μL)
目的基因：RCL(线性)
扩增效率：99％
R2：0.99。
5判断标准
待检测细胞中是否存在复制型病毒的判断标准如表10所示。
表10待检测细胞中是否存在复制型病毒的判断标准
Figure BDA0002944329940000151
Figure BDA0002944329940000161
将三种类型样本：经过慢病毒修饰的DC-0330B、未经慢病毒修饰的PBMC和293T，分别取10个不同批次提取检测，结果如下表所示，CT为35或未检出。
表11阴性样本检测结果
Figure BDA0002944329940000162
分别取10copies/μl、8copies/μl、6copies/μl、5copies/μl、4copies/μl和3copies/μl浓度的质粒，各重复12次，然后统计cutoff值和LOD值，检测结果见表12，统计得出cutoff值为35，95％阳性检出，LOD为8copies/μl。
表12不同拷贝数质粒对应Ct值统计
Figure BDA0002944329940000163
Figure BDA0002944329940000171
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司
焦顺昌
<120> 一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的引物组、试剂盒及方法
<141> 2021-02-18
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggacgttgag aggatcttgg at 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tggaagaccc gctctgattt 20
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
attccctctg ccaagaaacc tggagc 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gacgttgaga ggatcttgga tta 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ctgagatcca ctggagagat tg 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ttccctctgc caagaaacct ggag 24

Claims (10)

1.一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的引物组，其特征在于，包括RCL-1引物组或RCL-2引物组；所述RCL-1引物组包括引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1；所述RCL-2引物组包括引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2；所述引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示，所述引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4～SEQ ID No.6所示。
2.一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组和检测试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1的使用浓度独立为8～12μmol/L；所述引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2的使用浓度独立为8～12μmol/L。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括qPCR扩增MIX、阳性标准品和阴性质控品。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品为复制型vsvg质粒。
6.一种检测慢病毒介导基因修饰的细胞中复制型病毒的方法，包括以下步骤：
1)提取待检测细胞的总RNA后，反转录获得反转录产物；
2)以步骤1)中获得的反转录产物为模板，以权利要求1中所述的RCL-1引物组或RCL-2引物组为引物进行qPCR扩增获得待检测细胞qPCR扩增的Ct值；
3)当Ct值≥33.92时，所述待检测细胞中不存在复制型病毒，当Ct值＜33.92时，所述待检测细胞中存在复制型病毒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述qPCR扩增的扩增体系，以20μL计，包括RNA模板4μL、引物FP-1 0.4μL、引物RP-1 0.4μL、荧光探针P1 0.4μL、qPCR扩增MIX10μL和ddH2O 4.8μL；
或者包括RNA模板4μL、引物FP-2 0.4μL、引物RP-2 0.4μL、荧光探针P2 0.4μL、qPCR扩增MIX 10μL和ddH2O 4.8μL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述qPCR扩增的扩增程序包括以下步骤：95℃10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述待检测细胞设置2～4个重复。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当采用RCL-2引物组为引物进行qPCR扩增时，将所述反转录产物线性化后作为模板。
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