CN116516069B - 一种快速检测细胞中Epstein-Barr病毒的RPA试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测细胞中Epstein‑Barr(EB)病毒的RPA试剂盒，属于生物技术领域。检测EB病毒的RPA引物和探针的序列分别如SEQ ID NO.1‑3所示，本发明的RPA试剂盒包含：所述RPA引物和探针、RPA反应液、含有RPA冻干颗粒的反应管、Nfo酶及其Buffer、试纸条、稀释液。本发明的RPA试剂盒，可以短时间内实现对EB病毒保守序列的迅速扩增，结合侧向流动试纸条，30min得到可视化结果。本发明操作便捷，对设备和实验人员要求低，具有良好的检测准确性和灵敏度，可以应用于大量筛查细胞中EB病毒污染。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及Epstein-Barr(EB)病毒的检测，具体涉及一种快速检测细胞中EB病毒的RPA试剂盒。
背景技术
细胞是生命科学研究的基本工具，在生物医学和生物技术领域扮演着非常重要的角色。众多实验室使用的细胞都是从几十年前的血液和组织中制备的，人体细胞可以携带多种不同的病原体，细胞系通常根据患者材料建立，可能类似感染了这些病毒，或者可能感染了与特定肿瘤有关的病毒。例如乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)。在常规检测病毒污染之前，甚至在发现这些病毒之前，就已经建立了相当大比例的细胞系。
已知的细胞系中，HeLa是众所周知的含有人乳头瘤病毒HPV18的细胞，HPV18的基因组全部整合到了宿主的基因组中，病毒的感染可以追溯到宿主。但是也有一些病毒的存在属于病毒污染，跟细胞来源没有关系，是细胞操作过程中被实验人员带入，或者同时操作带病毒的细胞导致交叉污染。这些被病毒污染的细胞培养存在潜在风险，有些病毒感染细胞后，细胞凋亡；有些病毒可以与细胞共存，随着细胞传代一起增殖，甚至表现出隐形感染周期，期间没有活性病毒产生，例如Epstein-Barr(EB)病毒。
EB病毒是人类疱疹病毒家族的成员，属于γ疱疹病毒科，淋巴隐病毒属。该病毒为双链DNA病毒，基因组长172kb。EB病毒感染非常普遍，四季均可发病，经口密切接触传播，在咽部淋巴细胞增殖，进入血液并传播至全身淋巴系统，同时干扰免疫功能，诱导细胞增生和转化，并具有一定致癌性。EB病毒核酸物质的存在可以通过多种方法来确定，例如通过直接测序、荧光原位杂交和针对EBV衍生的DNA或RNA的血液样品的聚合酶链式反应分析。在过去的20年中，主要使用核酸扩增测试来测量EBV载量。然而，传统的聚合酶链式反应仍有其弊端，即需要复杂的热循环器来提供循环加热和冷却过程、需要一定反应时间，且反应结果仍需后续实验才能显现，难以在大量细胞检测筛查中推广。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)作为一种近年来不断快速诊断病原体的方法，已经在病毒、细菌等诊断中广泛应用。RPA反应主要包含三种关键蛋白，分别是重组酶、重组酶加载因子和单链结合蛋白，它们随后与其余辅助成分执行RPA反应机制。其中重组酶在装载因子的辅助下分别与前后引物结合形成核蛋白丝，该物质会在DNA双链结构中寻找到同源序列后入侵双链，形成D环，引物与模板杂交引发链交换反应，另一侧单链由单链结合蛋白SSB稳定，DNA聚合酶(Bsu或者Sau)从引物末端的游离3′-OH开始合成，正反引物合成产物最终整合为双链DNA。重组酶从核蛋白丝上分离，与新引物结合启动另一个置换反应。RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，反应时间20min左右，无需变性。同时，其检测灵敏度很高，能够将极少量的核酸模板扩增到可以检出的水平。因此，运用RPA等温扩增的核酸片段经侧流层析试纸条LFA的完整测试过程在几十分钟内就可完成，结果直接用肉眼读取，大大优化了EB病毒检测。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术缺陷，提供一种快速检测细胞中Epstein-Barr病毒的RPA引物和探针组合、RPA试剂盒，以及提供一种快速检测细胞中EBV感染情况的方法，以解决上述背景技术提出的问题。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种快速检测细胞中Epstein-Barr病毒的RPA引物和探针组合，包含上游引物RPA-FP、下游引物RPA-RP和探针RPA-Probe，引物、探针序列信息如下表1所示。
表1.本发明的EB病毒RPA引物及探针序列
下游引物5’端被BIOTIN标记，探针序列中5’端被FITC标记、中间的一个T被[THF]残基取代、3’端由C3-Spacer修饰。
上述引物及探针针对于EB病毒基因(GenBank:V01555)设计，其在EB病毒中高度保守，对EB病毒进行检测结果可靠、特异性好。
所述的RPA引物和探针组合在制备检测细胞中Epstein-Barr病毒的RPA试剂盒中的应用。
一种快速检测细胞中Epstein-Barr病毒的RPA试剂盒，包含上述RPA引物和探针组合，RPA引物、探针在试剂盒中的工作浓度优选为10μM。
进一步地，所述的RPA试剂盒还包含试纸条，所述的试纸条为侧向流动试纸条，包括样品垫、结合垫、测试区、吸收垫和PVC底板。其中，结合垫上含有与胶体金粒子相结合的抗FITC抗体，该抗体为鼠源。测试区材质为硝酸纤维素膜，测试区包含检测线和质控线。检测线上被固定有链霉亲和素，可以与Biotin结合；质控线上被固定有抗小鼠抗体，可以与结合垫上的抗FITC抗体结合。所述的试纸条可装在试纸卡壳中。
进一步地，所述的RPA试剂盒还包含：含有RPA冻干颗粒的反应管、RPA反应液、Nfo酶及其Buffer和稀释液中的至少一种；所述的RPA反应液包含缓冲液、醋酸镁。所述的稀释液包含如下含量的组分：10mM-20mM PBS、0.05％-0.1％(v/v)Triton X100、0.05％-0.1％(v/v)Tween 20、0.1％-0.2％(w/v)鱼明胶。
所述的RPA引物和探针组合或RPA试剂盒在检测细胞中EBV感染情况中的应用。
一种快速检测细胞中EBV感染情况的方法，包括如下步骤：
(1)重组酶聚合酶扩增：往含有RPA冻干颗粒的反应管中加入待检测细胞DNA、相应体积的缓冲液、醋酸镁溶液、上下游引物、ddH2O进行扩增。
(2)酶切扩增：向步骤(1)的反应产物中加入对应体积的探针、Nfo酶和Buffer进行酶切扩增。
(3)显色：将步骤(2)的产物稀释后滴加于试纸条，观察检测结果。
作为一种优选技术方案，步骤(1)的反应体系(50μL)如下：缓冲液29.5μL、280mmol/L醋酸镁溶液2.5μL、10μM上下游引物各2μL、ddH2O 13μL、待检测细胞DNA 1μL。
作为一种优选技术方案，步骤(2)的反应体系如下：50μL步骤(1)的反应产物、10μM探针0.6μL、Nfo酶1.5μL、Nfo酶Buffer 5μL。
作为一种优选技术方案，步骤(1)、(2)的重组酶聚合酶扩增、酶切扩增的反应温度均为39℃，反应时间均为15min。
作为一种优选技术方案，步骤(3)中，产物经稀释液稀释比例为1:100(V/V)，滴加50μL于试纸条点样区，等待5min后观察检测结果。
本发明的有益效果是：
1.节约时间、便于观察：本发明只需要30min即可获得可视化结果，时间远远短于普通聚合酶链式反应与琼脂糖凝胶电泳结合的2h。
2.降低反应温度：等温即可扩增，不需要复杂的反应设备。
3.特异性强：在本试剂盒中添加了探针，可以增强反应的特异性。
4.灵敏度高：试纸条的检测灵敏度达103拷贝数/μL。
附图说明
图1是未引入探针的RPA-LFA结果，图中从左至右依次为HeLa细胞、ddH2O、B95-8细胞。
图2是引入探针的RPA-LFA结果，图中从左至右依次为HeLa细胞、ddH2O、B95-8细胞。
图3是RPA-LFA检测B95-8细胞、HeLa细胞的结果，A：B95-8细胞；B：HeLa细胞。
图4是RPA-LFA检测方法的灵敏度结果，EB病毒的浓度分别为：A：106拷贝数/μL；B：105拷贝数/μL；C：104拷贝数/μL；D：103拷贝数/μL；E：102拷贝数/μL；F：101拷贝数/μL；G：100拷贝数/μL。
图5是RPA-LFA检测方法的特异性结果，A：HeLa细胞；B：SiHa细胞；C：Hep-G2/2.2.15细胞；D：RK13细胞。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1PRA引物、探针的设计与筛选
1、引物筛选
合适的引物是PCR扩增的关键，影响到检测灵敏性和特异性。通过在NCBI上比对分析，得到不受其他病毒干扰的EB保守序列，进而设计了多对引物(表2为所设计的部分引物序列)，经过大量筛选发现只有引物FP1、RP1能够实现对EB病毒的特异性扩增、且获得大小适中的条带，选择引物FP1、RP1进行后续实验。
表2引物序列
2、假阳性现象的消除
最初RPA反应体系(相关试剂来自TwistAmpTM basic kit)中选用增加荧光素FITC标记的前引物，增加生物素Biotin标记的后引物，在39℃反应15min，等温扩增生成的产物同时带有两种标记。取产物中的1μL加入99μL测流层析试纸条所配备的稀释液以1:100(V/V)的比例进行稀释，取50μL混合均匀溶液滴加于测流层析试纸条上，置于常温下5min等待结果。结果如图1所示，EBV阳性样品的试纸条显示阳性，ddH2O空白对照组与HeLa阴性对照组试纸条测试线均出现较浅阳性。将以上两组可疑阳性产物送测后测序结果均显示无EBV片段，排除污染问题，可能是反应体系中的引物二聚体在试纸条中产生了假阳性条带。
后续为避免假阳性结果，在RPA体系中使用未被标记的前引物、被生物素Biotin标记的后引物，以及荧光素FITC标记的探针，并将反应分为两步完成。第一步，先对模板进行常规RPA等温扩增(前引物为普通引物，后引物标记处理)，39℃反应15min。第二步，向其中加入探针、Nfo酶及其buffer，仍然在39℃反应15min，反应完成后用试纸条所配备的稀释液稀释，取50μL稀释后的反应液滴加于试纸条上观察结果。
结果如图2所示，阳性细胞扩增产物试纸条显示阳性，HeLa阴性组和ddH2O空白组均显示阴性。因此，该探针的引入很好的解决了引物二聚体所造成的假阳性现象。引物、探针信息见表1。
实施例2B95-8细胞的EB病毒检测
1、细胞基因组提取
所使用的B95-8细胞(含EB病毒)、HeLa细胞(不含EB病毒)均可从中国典型培养物保藏中心(CCTCC)获得，利用北京天根生化科技公司生产的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒对B95-8细胞、HeLa细胞进行DNA提取，并最终用50μL ddH2O洗脱，提取所得DNA放到-20℃备用。
2、目的基因扩增
使用TwistAmpTM basic kit配制50μL反应体系。向含有RPA冻干颗粒的反应管中依次加入缓冲液29.5μL、ddH2O 13μL、10μM RPA-FP(上游引物：CTTGGAGACAGGCTTAACCAGACTCA)2μL、10μM RPA-RP(下游引物：[BIOTIN]CCATGGCTGCACCGATGAAAG TTAT)2μL、细胞DNA 1μL、280mmol/L醋酸镁溶液2.5μL。将反应体系置于普通恒温仪中进行扩增，RPA扩增条件为：39℃扩增15min。向反应管中继续加入第二步反应体系：10μM RPA-Probe(探针：[FITC]TGCCGGCCCCTCGAGATTCTGACCGGGGACC[THF]CTGGT TGCTCTGTTG[C3-Spacer])0.6μL、Nfo酶1.5μL、Nfo酶Buffer 5μL，再放置于普通恒温仪中39℃扩增15min。
3、试纸条可视化检测
将扩增得到产物以1:100比例经稀释液(15mM PBS、0.05％ Triton X100、0.05％Tween 20、0.15％鱼明胶)稀释，取50μL滴加于侧向流动试纸条测试区，等待5min即可观察检测结果。
判断标准：含有EB病毒的细胞DNA样品会在试纸条中显示两条带，即为阳性。不含EB病毒的细胞DNA样品会在试纸条中显示一条质控线。若未出现质控线，则说明试纸条失效。
如图3所示，B95-8细胞出现两条带，呈EB病毒阳性，HeLa细胞仅有一条质控线，呈EB病毒阴性。
实施例3灵敏度检测
所用到EB病毒液从中国典型培养物保藏中心(CCTCC)获得，将EB病毒液按照106拷贝数/μL-100拷贝数/μL进行梯度稀释，以此作为RPA反应模板。反应步骤均与实施例2相同，扩增与酶切反应都在普通恒温仪中进行，两步反应条件均为15min，39℃。以1:100比例对扩增产物进行稀释，滴加50μL于试纸条上，5min后观察检测结果。结果如图4所示，随着病毒拷贝数降低，阳性条带越来越浅，直至102拷贝数/μL检测线消失。该结果表明在106拷贝数/μL-103拷贝数/μL范围内的样品均能被检测出来。
实施例4特异性检测
分别选取已被证实含有其他病毒细胞的DNA作为模板进行扩增，细胞情况如下：HeLa(含有人乳头瘤病毒18型HPV18)、SiHa(含有人乳头瘤病毒16型HPV16)、Hep-G2/2.2.15(含有乙型肝炎病毒HBV)、RK13(含有牛病毒性腹泻病毒BVDV)。反应步骤均与实施例2相同，以1:100比例对扩增产物进行稀释，滴加50μL于试纸条上，5min后观察检测结果。结果如图5所示，均未出现阳性条带，证明该检测体系特异性良好。
Claims (3)
1.一种快速检测细胞中Epstein-Barr病毒感染情况的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）重组酶聚合酶扩增：往含有RPA冻干颗粒的反应管中加入待检测细胞DNA、缓冲液、醋酸镁、上游引物、下游引物、ddH2O进行扩增；所述扩增的反应温度为39℃，反应时间为15min；
（2）酶切扩增：向步骤（1）的反应产物中加入探针、Nfo酶和Nfo酶Buffer进行扩增；所述扩增的反应温度为39℃，反应时间为15min；
（3）显色：将步骤（2）的产物稀释后滴加于试纸条，观察检测结果；
所述上游引物的序列为：5’-CTTGGAGACAGGCTTAACCAGACTCA-3’，
所述下游引物的序列为：5’-[BIOTIN]CCATGGCTGCACCGATGAAAGTTAT-3’，
所述探针的序列为：5’-[FITC]TGCCGGCCCCTCGAGATTCTGACCGGGGACC[THF]CTGGTTGCTCTGTTG[C3-Spacer]-3’，
所述的方法为非疾病诊断的目的。
2.根据权利要求1所述的快速检测细胞中Epstein-Barr病毒感染情况的方法，其特征在于：
步骤（1）的反应体系如下：缓冲液29.5μL、280mmol/L醋酸镁溶液2.5μL、10μM上游引物2μL、10μM下游引物2μL、ddH2O 13μL、待检测细胞DNA 1μL；
步骤（2）的反应体系如下：50μL步骤（1）的反应产物、10μM探针0.6μL、Nfo酶1.5μL、Nfo酶Buffer 5μL。
3.根据权利要求1所述的快速检测细胞中Epstein-Barr病毒感染情况的方法，其特征在于：步骤（3）中，产物经稀释液稀释比例为1:100，滴加50μL于试纸条点样区，等待5min后观察检测结果。
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