CN111304363A - 一种eb病毒核酸定量检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种EB病毒核酸定量检测试剂盒。本发明设计了一组EB病毒核酸定量检测引物与探针组合，序列如SEQ ID NO：1‑6所示；并进一步构建了检测试剂盒，包括磁珠法核酸提取试剂盒和EBV核酸扩增试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高、重复性好、引物和探针保守性高、特异性强、覆盖EB病毒不同的亚型或变种、有利于提高EBV检测的准确性和特异性、引入高效的内标系统、解决靶基因和内标同时扩増而导致的相互抑制和干扰等问题、能够高效的监控整个PCR扩増整个过程、避免出现假阴性结果等优点，核酸DMA提取方法简单，核酸纯度高，成本较低，而且操作简便快速、成本低廉，特别适用于EB病毒(EBV)精确的定量检测，可广泛的应用于生物医学临床诊断领域中。

Description

一种EB病毒核酸定量检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学及临床诊断技术领域。更具体地，涉及一种EB病毒(EBV)核酸定量检测试剂盒。
背景技术
EB病毒(EBV)为疱疹病毒科，疱疹病毒Ⅳ型，是一种嗜人类淋巴细胞的疱疹病毒。EBV在人群中感染非常普遍，约90％以上的成人血清EBV抗体阳性。除原发性EBV感染可致传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis，IM)外，EBV还引起慢性活动性EBV感染(chronic active EBV infection，CAEBV)和EBV相关噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(EBV-associated Haemophagocytic lymphohistiocytosis，EBV-HLH)等非肿瘤性重症EBV相关疾病。EBV还是一种致肿瘤病毒，与许多肿瘤的发生相关，如霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，鼻咽癌(NPC)，胃癌和移植后淋巴细胞增殖症(PTLD)等。
EBV原发感染后建立终身潜伏感染。EBV潜伏感染可分为四种类型：EBV潜伏感染0型，在健康的EBV既往感染个体，EBV在记忆性B细胞潜伏，只表达EBERs，这些个体称为健康携带者；潜伏感染Ⅰ型除EBERs外，EBV只表达EBNA1和BamHI A右侧片段(BARTs)，导致Burkitt’s淋巴瘤；潜伏感染Ⅱ型，EBV表达EBNA1、LMP1、LMP2、BART'S和EBERs，导致鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤；潜伏感染Ⅲ型，EBV表达所有的潜伏感染基因，导致免疫抑制病人的淋巴组织增生性疾病。
针对不同的EBV感染相关疾病，选择适当的临床标本和实验室检测方法，对于EBV感染相关疾病的诊断和治疗十分重要。血清或血浆中EBV-DNA阳性提示患者体内存在活动性EBV感染或疾病与EBV密切相关(如原发EBV感染早期、EBV-HLH、大多数CAEBV、EBV相关肿瘤等)，需结合临床表现及其他检查结果综合分析判断；血清或血浆EBV-DNA阴性提示为血清阳性转化的EBV健康携带者、未感染过EBV的患者、非EBV相关疾病患者、以及部分EBV相关疾病患者，如部分IM患者及IM后期，极少数CAEBV患者(结合血清学判定)。外周血PBMC中EBV-DNA载量高于102.5拷贝/μgDNA是CAEBV的诊断标准之一。全血样本EBV-DNA载量主要用于免疫缺陷患者EBV感染的诊断，以提高诊断EBV感染的敏感性，不推荐用于有免疫力的患者。因血清EBV阳性转化的健康携带者每106个PBMC(外周血单核细胞)中大约有1～50个EBV感染的细胞，约7个拷贝(1～30个拷贝)EBV-DNA/106 PBMC。因此，血清阳性转化的EBV健康携带者的全血或PBMC标本中可能检出低水平的EBV-DNA载量。因此，高灵敏性的EB病毒核酸特异定量检测技术非常重要。
发明内容
本发明旨在从根本上解决现有EB病毒(EBV)核酸定量PCR技术存在的灵敏度低、准确性差等问题，提供一种对EB病毒(EBV)检测灵敏度高、特异性强、稳定性重复性好的简便快速检测方法，适用于EB病毒(EBV)精确的定量检测。
本发明的目的是提供一种EB病毒核酸定量检测引物与探针组合。
本发明另一目的是提供一种EB病毒核酸定量检测试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种EB病毒核酸定量检测引物与探针组合，包括如下组分，其序列如下：
用于检测靶基因的探针为：5’-AGCCACACGGGCCTCT-’3，其5’端标记为FAM荧光发生基团，3’端标记为MGB；
用于内标检测的探针为：5’-ATGCCTGCTGACTTGCCTT-’3，其5’端标记为ROX荧光发生基团，3’端标记为MGB；
用于扩增靶基因的上游引物为：5’-TGGCAAAGATCTGCGTGGACA-’3；
用于扩增靶基因的下游引物为：5’-GCCAGCCTCAACTACGACT-’3；
用于扩增内标的上游引物为：5-CCCACTGCATTGCCGAA-’3；
用于扩增内标的下游引物为：5’-GCCCAGGAAGACATCCTT-’3。
上述引物与探针组合在制备EB病毒检测产品方面的应用，以及含有所述引物与探针组合的EB病毒核酸定量检测试剂盒，应在本发明的包含范围之内。
即本发明提供一种含有所述引物与探针组合的EB病毒核酸定量检测试剂盒。
优选地：用于检测靶基因的探针使用浓度为5-20pmol；所述用于检测内标的探针使用浓度为5-20pmol；所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为10-30pmol；所述用于检测内标的引物使用浓度为5-20pmol。
更优选地：用于检测靶基因的探针使用浓度为10pmol；所述用于检测内标的探针使用浓度为10pmol；所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为20pmol；所述用于检测内标的引物使用浓度为20pmol。
另外，优选地所述试剂盒还包括EBV-PCR反应液、酶混合液、EBV定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品；
所述EBV-PCR反应液包括上述引物与探针组合和PCR缓冲液；
所述PCR缓冲液组成为30mol/L pH8.3 Tris-HCl，10mmol/L(NH4)2SO4，30mmol/LKC1，4.5mmol/L MgCl2,0.15mol/L dNTPs；
所述酶混合液包括热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG)；其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份；
所述阴性质控品为灭活阴性人源血浆，EBV定量参考品1-4，临界阳性质控品和强阳性质控品均由EBV病毒血清样本稀释而成，浓度分别为5.0×105，5.0×104，5.0×103，5.0×102，1.0×102，1.0×105IU/ml，EBV病毒血清为灭活病毒血清样本。
更优选地，所述试剂盒还包含内标，为人血DNA。内部为人基因组清蛋白基因的区域(Homo sapiens albumin(ALB),RefSeqGene on chromosome 4，NG_009291.1)。
另外，本发明的EB病毒核酸定量检测试剂盒除了包括上述EBV核酸扩増试剂盒外，还包括磁珠法核酸提取试剂盒；
所述磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液、洗脱液、磁珠液；
所述裂解结合液组成为含有十二烷基硫酸钠0.5-2.5％，Triton X-100 0.5-2.0ml/100ml，异硫氰酸胍2-6.0mol/L，1-10mmol/L EDTA，所述EDTA的pH值为7.5；
所述漂洗液组成为含有Triton X-100 0.5-2.0ml/l00ml，氯化钠0.1-0.3mol/L，60-80％乙醇；
所述洗脱液组成为含有10mmol/L Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH值为8.3，0.01-0.05％Prolin300；
所述磁珠液组成为直径为1μm的氧化硅超顺纳米磁珠，浓度为10-40mg/ml；
另外，优选地，本发明的EB病毒(EBV)核酸定量检测试剂盒使用时的扩增程序为：50℃2min，1个循环；95℃9min，1个循环；95℃10s，58℃50s，45个循环，采集荧光信号；38℃5s，1个循环；38℃5sec，1个循环，冷却。
本发明EB病毒(EBV)核酸定量检测试剂盒的适用检测样本类型为血清和血浆。
本发明上述EB病毒(EBV)核酸定量检测试剂盒的基本原理是：首先釆用纳米磁珠法提取血清、血浆样品中EBV DNA作为扩增模板，然后应用TaqMan荧光探针技术完成对该模板实时荧光定量PCR检测过程。同时扩增体系中引入了高效的内标系统，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。而设计的探针和引物是高保守性、特异性和高效性的TaqMan荧光探针和引物以及内标的探针和引物。所述靶基因和内标探针分别标记FAM和ROX荧光报告基团；所述实时荧光定量PCR产物在100-150个碱基对范围。本发明试剂盒采用吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取血清、血浆样品中EB病毒核酸作为模板，应用TaqMan荧光探针技术完成对该模板荧光定量PCR检测过程。同时在反应体系中添加了高效的内标，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性的存在。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种EB病毒核酸定量检测引物与探针组合，并进一步构建了EB病毒(EBV)核酸定量检测试剂盒，包括磁珠法核酸提取试剂盒和EBV核酸扩增试剂盒。其优势在于：
1、设计的引物和探针保守性高、特异性强、可以覆盖EB病毒不同的亚型或变种，有利于提高EBV检测的准确性和特异性。
2、检测灵敏度高，重复性好。本发明使用自主开发的磁珠法核酸提取技术，能够从样品中获得高纯度EB病毒核酸，消除提取物对PCR反应的干扰，加大了检测样本量，提高了检测灵敏度和稳定性。检测灵敏度为20IU/ml，检测线性范围为20-20×108IU/ml。
3、引入了高效的内标系统，解决了靶基因和内标同时扩增而导致的相互抑制和干扰等问题，能够高效的监控整个PCR扩增整个过程，避免出现假阴性结果。
4、本发明操作简便、快速、成本低廉，并且易于开发为自动化检测系统，以便对大量样品的进行高通量筛检。所检测的样品为人源或动物源的血液、血浆、血清。适合常规血液样品的检测，也适合自动化和高通量检测。
附图说明
图1是本发明检测中检所EBV国际标准品的检测浓度和其理论浓度的拟合曲线图。
图2是本发明对四种浓度EBV阳性血清样本的重复性测试检测结果图。
图3是本发明对20IU/ml灵敏度血清样本的重复测试检测结果图。
图4是本发明检测中检所EBV国家标准品的检测结果图。
图5是本发明检测内标检测结果图。
图6是本发明引物和探针配制检测MIX的结果图。
图7是对照组1引物和探针配制检测MIX的结果图。
图8是对照组2引物和探针配制检测MIX的结果图。
图9是对照组3引物和探针配制检测MIX的结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 EB病毒核酸定量检测试剂盒的构建和使用方法
本发明EB病毒核酸定量检测试剂盒包括EBV核酸扩増试剂盒和模板DNA提取试剂盒。
一、EBV核酸扩増试剂盒
EBV核酸扩増试剂盒包括EBV-PCR反应液、酶混合液、EBV定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。具体如下：
1、引物和探针设计
用于检测靶基因的探针序列为：5’-AGCCACACGGGCCTCT-’3(SEQ ID NO：1)，5’端标记为FAM荧光发生基团，3’端标记为MGB；
用于内标检测的探针序列为：5’-ATGCCTGCTGACTTGCCTT-’3(SEQ ID NO：2)，5’端标记为ROX荧光发生基团，3’端标记为MGB；
用于扩增靶基因的上游引物序列为：5’-TGGCAAAGATCTGCGTGGACA-’3(SEQ ID NO：3)；
用于扩增靶基因的下游引物序列为：5’-GCCAGCCTCAACTACGACT-’3(SEQ ID N0：4)；
用于扩增内标的上游引物序列为：5-CCCACTGCATTGCCGAA-’3(SEQ ID NO：5)；
用于扩增内标的下游引物序列为：5’-GCCCAGGAAGACATCCTT-’3(SEQ ID NO：6)。
2、反应体系试剂准备
(1)用于检测靶基因的探针使用浓度为5-20pmol；所述用于检测内标的探针使用浓度为5-20pmol；所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为10-30pmol；所述用于检测内标的引物使用浓度为5-20pmol。
优选地，EBV靶基因的上下游引物浓度为20pmol，探针浓度为10pmol；内标的上下游引物浓度为20pmol，探针浓度为10pmol。
(2)PCR缓冲液组成为：30mol/L Tris-HCl(pH8.3)，10mmol/L(NH4)2SO4，30mmol/LKC1，4.5mmol/L MgCl2，0.15mol/L dNTPs。
(3)按比例(裂解结合液200μl/人份+内标1ul/人份)取相应量的裂解结合液及内标，充分混匀成裂解结合液，瞬时离心后备用。
(4)试剂盒中阴性质控品为灭活阴性人源血浆，EBV定量参考品1-4，临界阳性质控品和强阳性质控品均由EBV病毒血清样本稀释而成，浓度分别为5.0×105，5.0×104，5.0×103，5.0×102，1.0×102，1.0×105IU/ml，EBV病毒血清为灭活病毒血清样本。
根据待测样本、阴性对照、阳性对照、临界阳性和工作标准品1-4的量，按比例(PCR反应液34.5μ1/人份+酶混合液0.5μl/人份)，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。
(5)试剂盒中酶混合液组成包括热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶；其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份。
优选地，热启动Taq酶5U、尿嘧啶糖基化酶(UNG)0.2U。
(6)试剂盒中内标是人血DNA。
4、扩增程序如表1
表1 PCR扩增程序
Figure BDA0002351689180000071
5、加样和检测
向含有PCR反应液的反应管中，分别加入提取的样本、阴性对照、阳性对照、临界阳性对照、及工作标准品各5μ1，盖紧管盖，置于PCR仪上进行检测。扩增程序如表1，检测通道选择：荧光信号收集设定为FAM和ROX通道，然后设置四个工作标准品的浓度。
6、结果判定
(1)反应结束后保存检测数据文件；
(2)分析条件设置：点击Analysis按钮进入分析界面，手动调整Baseline；
(3)检测样本中20IU/ml≤EBV DNA≤2×108IU/ml，结果有效，可直接报告阳性及相应拷贝量；
(4)检测样本中EBV DNA>2×108U/ml，即可直接报告为>2×108IU/ml，也可用正常人EBV DNA阴性血清按10倍梯度对原血清样本做相应稀释，使其拷贝量在1×105-1×107IU/ml范围内再重新测定，测定结果应按稀释倍数进行校正；
(5)检测样本中EBV DNA的拷贝量为10-20IU/ml时，同时，内标检测为阳性且Ct≤38，则报告为EBV DNA阳性，EBV DNA浓度定量值仅供参考；
(6)检测样本中EBV DNA的拷贝量<10IU/ml，同时，内标检测为阳性且Ct≤38，则报告为灰区，EBV DNA浓度低于试剂盒检测下限。
(7)若定量检测结果不显示，同时，内标检测为阳性且Ct≤38，则报告为EBV DNA阴性。
7、质量控制
标准曲线的相关系数R2≥0.980。阳性对照的EBV DNA拷贝量应为5×104-5×105IU/ml，临界阳性对照拷贝量应为50-500IU/ml，阴性对照的Ct值应不显示，同时内标的Ct≤38，试验视为有效。
二、模板DNA提取试剂盒(磁珠法核酸提取)
磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液、洗脱液、磁珠液。
所述裂解结合液组成为：含有十二烷基硫酸钠0.5-2.5％，Triton X-100 0.5-2.0ml/100ml，异硫氰酸胍2-6.0mol/L，1-10mmol/L EDTA，所述EDTA的pH值为7.5；
所述漂洗液组成为：Triton X-100 0.5-2.0ml/l00ml，氯化钠0.1-0.3mol/L，60-80％乙醇；
所述洗脱液组成为：含有10mmol/L Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH值为8.3，0.01-0.05％Prolin300；
所述磁珠液组成为：直径为1μm的氧化硅超顺纳米磁珠，浓度为10-40mg/ml。
具体提取方法如下：
(1)取适量1.5ml离心管，分别标记阴性对照、阳性对照、临界阳性对照、工作标准品1-4及待测样本，每管中加入200μ1裂解结合液，裂解结合液组成为含有十二烷基硫酸钠0.5-2.5％，Triton x-1000.5-2.0ml/100ml，异硫氰酸胍2mol/L-6.0mol/L，1-10mmol/LEDTA pH7.5)。
(2)每管加入200μ1待测样本或阴性对照、阳性对照、临界阳性对照、工作标准品1-4；每管加入10μl磁珠悬液，震荡混匀后，室温静置13分钟，瞬时离心；
(3)将离心管置于磁力架上吸附约2分钟，弃掉上清液，瞬时离心，吸干残液；
(4)加入600μl漂洗液，所述漂洗液组成为含有Triton x-1000.5-2.0ml/100ml氯化钠0.1-0.3mol几，60-80％乙醇。用移液器反复吸打后，瞬时离心。在磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液；
(5)加入100μ1洗脱液，所述洗脱液为含有10mol/L Tris.HCl(PH8.3)，
0.01-0.05％Prolin300；56℃静置2分钟；将离心管放置在磁力架上吸附2分钟，吸出上清液。
实施例2 EBV DNA的荧光定量PCR检测实例
利用ABI7500定量PCR仪，按照实施例1试剂盒的检测方法进行检测。
1、国际标准品测试：
将国际参考品WHO International Standard 1st WHO International Standardfor Epstein-Barr Virus for Nucleic Acid Amplification Techniques(NIBSC code:09/260)稀释至106，105，104，103，102IU/ml分别采用本发明方法进行检测，最后分析中检所EB病毒核酸定量标准品的检测值和理论值之间的双对数线性关系。
检测结果见图1和表2，理论浓度和检测浓度的双对数曲线线性相关系数(R2)为0.9971，符合标准品的要求，即线性相关系数(R2)≥0.98。表明我们的试剂盒准确可靠可以溯源到国际参考品。
表2 国家标准品检验结果
Figure BDA0002351689180000091
2、样本的重复性测试
以稀释后的国际参考品L1-L5为待测样本，每个样本重复测试三次，结果如图2所示。CT值的变异系数分别为0.89％，0.74％，0.64％，0.12％，0.76％变异系数均控制在1％以内，表明运用本发明方法检测血清样本的重复性很好。
3、灵敏度样本测试
以国际参考品待测样本，用血清将其稀释到20IU/ml制备成为灵敏度血清样本，样本重复测试20次，阳性检出率为100％，结果如图3。
4、内标干扰测试
以稀释后的国际参考品L1-L5为待测样本，直接进行检测。测试结果表明，在L1-L5这5个浓度范围内，内标检测信号稳定，内标阳性检出率为100％。并且内标没有对低浓度的L5(浓度约为102IU/ml)样本检测带来负面影响。同时高浓度的L1(浓度约为106IU/ml)样本也没有对内标扩增产生影响，结果如图4。测试结果表明，运用本发明的内标能够对PCR扩增假阴性起到高效的监控作用。
综上结果，本发明与目前国内外常用的煮沸法和柱提法相比，无论是在灵敏度上，还是在操作的简便程度上都有很大的优势。本发明适用于临床血液、血清、血浆的检测和诊断，监测和评价药物的疗效，也可用于中心血站血液筛査以及流行病学调查。
实施例3本发明试剂盒中引物与探针的设计优化
本发明实施例1试剂盒中的引物和探针是经过了大量的探索研究才得到的。
具有如下表3：
表3 本发明所用引物探针组合及各对照组引物探针组合
Figure BDA0002351689180000101
Figure BDA0002351689180000111
参照实施例1和实施例2中记载的试剂盒及其使用方法，利用上述各组引物对同一个已知阳性样本进行2次检测。
结果如图6～图9和表4。
表4 各组MIX检测结果Ct值
引物与探针组合 内标Ct均值 靶序列Ct均值
本发明引物与探针组合 30.773 32.821
对照组1 30.391 35.541
对照组2 31.834 38.005
对照组3 27.312 39.085
结果显示，针对内标Ct均值，对照组3最优，本发明所用引物与探针组合及对照组1次之，对照组2较差；针对靶序列Ct均值，本发明所用引物与探针组合最优，对照组1次之，对照组2和对照组3较差。
针对扩增曲线线形，对照组1与对照组2的两次检测之间差异较大，重复性较差；对照组3中内标扩增效率过高，抑制了靶序列的扩增，导致靶序列Ct均值较大；本发明所用引物与探针组合的线形符合常规荧光PCR方法的扩增曲线，且Ct均值适中。
综上所述，本发明所用引物与探针组合为目前最优的组合。同时也表明对于EB病毒核酸检测的引物与探针设计是至关重要的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种EB病毒核酸定量检测引物与探针组合，其特征在于：包括如下组分：
用于检测靶基因的探针为：5’-AGCCACACGGGCCTCT-’3，其5’端标记为FAM荧光发生基团，3’端标记为MGB；
用于内标检测的探针为：5’-ATGCCTGCTGACTTGCCTT-’3，其5’端标记为ROX荧光发生基团，3’端标记为MGB；
用于扩增靶基因的上游引物为：5’-TGGCAAAGATCTGCGTGGACA-’3；
用于扩增靶基因的下游引物为：5’-GCCAGCCTCAACTACGACT-’3；
用于扩增内标的上游引物为：5-CCCACTGCATTGCCGAA-’3；
用于扩增内标的下游引物为：5’-GCCCAGGAAGACATCCTT-’3。
2.权利要求1所述引物与探针组合在制备EB病毒检测产品方面的应用。
3.一种EB病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述引物与探针组合。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于：用于检测靶基因的探针使用浓度为5-20pmol；所述用于检测内标的探针使用浓度为5-20pmol；所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为10-30pmol；所述用于检测内标的引物使用浓度为5-20pmol。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于：用于检测靶基因的探针使用浓度为10pmol；所述用于检测内标的探针使用浓度为10pmol；所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为20pmol；所述用于检测内标的引物使用浓度为20pmol。
6.根据权利要求3-5任一所述试剂盒，其特征在于：还包括EBV-PCR反应液、酶混合液、EBV定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品；
所述EBV-PCR反应液包括权利要求1所述引物与探针组合和PCR缓冲液；
所述PCR缓冲液组成为30mol/L pH8.3 Tris-HCl，10mmol/L(NH4)2SO4，30mmol/L KC1，4.5mmol/L MgCl2,0.15mol/L dNTPs；
所述酶混合液包括热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG)；其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份；
所述阴性质控品为灭活阴性人源血浆，EBV定量参考品1-4，临界阳性质控品和强阳性质控品均由EBV病毒血清样本稀释而成，浓度分别为5.0×105，5.0×104，5.0×103，5.0×102，1.0×102，1.0×105IU/ml，EBV病毒血清为灭活病毒血清样本。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于：还包含内标，为人血DNA。
8.根据权利要求3-7任一所述试剂盒，其特征在于：试剂盒包括EBV核酸扩増试剂盒和磁珠法核酸提取试剂盒；
所述EBV核酸扩増试剂盒的组分如权利要求3-7所述；
所述磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液、洗脱液、磁珠液；
所述裂解结合液组成为含有十二烷基硫酸钠0.5-2.5％，Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，异硫氰酸胍2-6.0mol/L，1-10mmol/L EDTA，所述EDTA的pH值为7.5；
所述漂洗液组成为含有Triton X-100 0.5-2.0ml/l00ml，氯化钠0.1-0.3mol/L，60-80％乙醇；
所述洗脱液组成为含有10mmol/L Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH值为8.3，0.01-0.05％Prolin300；
所述磁珠液组成为直径为1μm的氧化硅超顺纳米磁珠，浓度为10-40mg/ml。
9.根据权利要求3-8任一所述试剂盒，其特征在于：试剂盒使用时的扩增程序为：50℃2min，1个循环；95℃9min，1个循环；95℃10s，58℃50s，45个循环，采集荧光信号；38℃5s，1个循环；38℃5sec，1个循环，冷却。
10.根据权利要求3-8任一所述试剂盒，其特征在于：检测样本类型为血清和血浆。
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