CN111270008A - 一种细小病毒b19核酸定量检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细小病毒B19核酸定量检测试剂盒。本发明设计了一组细小病毒B19核酸定量检测引物与探针组合,序列如SEQ ID NO:1‑6所示;并进一步构建了细小病毒B19核酸定量检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高、重复性好、引物和探针保守性高、特异性强、覆盖细小病毒B19不同的亚型或变种、有利于提高B19V检测的准确性和特异性、引入高效的内标系统、解决靶基因和内标同时扩増而导致的相互抑制和干扰等问题、能够高效的监控整个PCR扩増整个过程、避免出现假阴性结果等优点,核酸DMA提取方法简单,核酸纯度高,成本较低,而且操作简便快速、成本低廉,特别适用于B19V精确的定量检测,可广泛的应用于生物医学临床诊断领域中。
Description
技术领域
本发明属于生物医学及临床诊断技术领域。更具体地,涉及一种细小病毒B19(B19V)核酸定量检测试剂盒。
背景技术
人细小病毒B19(human parvo virus B19,简称B19V)是一种单链、线性DNA病毒,1977年才首次被发现。在人群中存在普遍的易感性,人群感染率达60%~70%以上,以冬春季常见。主要通过呼吸道、飞沫传播,也可通过血液和胎盘传播。在不同年龄和免疫状态的人群中临床表现不同,能引起感染性红斑胎儿水肿甚至死亡、急性关节炎、慢性贫血症、再生障碍性危象等多种病症。
近年来较多的研究表明骨髓中红细胞、白细胞、血小板3系前体细胞均可成为B19V感染的靶细胞,受到病毒攻击导致全血细胞减少。然而,由于机体免疫功能低下,不能中和及消除感染的病毒,而造成病毒持续感染的时间久,影响血液病的治疗效果。镰状细胞贫血症等血液系统疾病患者感染会发生再生障碍性危象而导致急性贫血。因此,对于血液肿瘤及免疫性血液疾病,当出现治疗效果不显著时,建议检测B19V,对有B19V感染患者,加用免疫球蛋白治疗或者抗病毒药物治疗,以提高疗效。
B19V是学龄儿童最常见的出疹性疾病-传染性红斑(又称第五病)的病原体。研究发现,我国川崎病患儿有较高的B19V感染率,可能是导致川崎病的主要病原体之一。婴幼儿免疫机制不完善,传统的免疫方法可能存在检测失效情况,核酸检测更为准确;若为阳性,指导临床合理用药,有利于患儿早日出院。或者用于与其他儿童出疹性疾病鉴别。
妊娠期急性B19V感染的发生率约为1%~2%,在感染爆发流行时妊娠期妇女的感染率可上升至10%。由于B19V可以通过胎盘,孕妇感染B19V后可通过母胎垂直传播途径引起胎儿宫内感染。尽管大多数情况下胎儿宫内感染可自发缓解,不影响胎儿结局,但部分患者B19V宫内感染可导致胎儿水肿、死胎和自然流产等严重不良妊娠结局。美国妇产科医师协会不推荐常规对孕妇进行B19V血清学筛查(同HCMV);确诊孕妇急性B19V感染后,应连续行超声检查动态监测胎儿有无水肿或贫血,胎儿出现严重贫血时应考虑宫内输血;PCR检测羊水B19VDNA可用于诊断胎儿是否存在B19V感染。
因此,高灵敏性的B19V病毒核酸特异定量检测技术非常重要。
发明内容
本发明旨在从根本上解决现有细小病毒B19(B19V)核酸定量PCR技术存在的灵敏度低、准确性差等问题,提供一种对细小病毒B19(B19V)检测灵敏度高、特异性强、稳定性重复性好的简便快速检测方法,适用于细小病毒B19(B19V)精确的定量检测。
本发明的目的是提供一种细小病毒B19核酸定量检测引物与探针组合。
本发明另一目的是提供一种细小病毒B19核酸定量检测试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种细小病毒B19核酸定量检测引物与探针组合,包括如下组分,其序列如下:
用于检测靶基因的探针为:5’-ATTTGTCGGAAGCCCAGTT-’3,其5’端标记为FAM荧光发生基团,3’端标记为MGB;
用于内标检测的探针为:5’-ATGCCTGCTGACTTGCCTT-’3,其5’端标记为ROX荧光发生基团,3’端标记为MGB;
用于扩增靶基因的上游引物为:5’-TAGTGAAGACTTACACAAGCC-’3;
用于扩增靶基因的下游引物为:5’-ATACCTAAAGTCATGAATCCTT-’3;
用于扩增内标的上游引物为:5-CCCACTGCATTGCCGAA-’3;
用于扩增内标的下游引物为:5’-GCCCAGGAAGACATCCTT-’3。
上述引物与探针组合在制备细小病毒B19检测产品方面的应用,以及含有所述引物与探针组合的细小病毒B19核酸定量检测试剂盒,应在本发明的包含范围之内。
即本发明提供一种含有所述引物与探针组合的细小病毒B19核酸定量检测试剂盒。
优选地:用于检测靶基因的探针使用浓度为5-20pmol;所述用于检测内标的探针使用浓度为5-20pmol;所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为10-30pmol;所述用于检测内标的引物使用浓度为5-20pmol。
更优选地:用于检测靶基因的探针使用浓度为8pmol;所述用于检测内标的探针使用浓度为8pmol;所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为20pmol;所述用于检测内标的引物使用浓度为20pmol。
另外,优选地所述试剂盒还包括B19V-PCR反应液、酶混合液、B19V定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品;
所述B19V-PCR反应液包括上述引物与探针组合和PCR缓冲液;
所述PCR缓冲液组成为30mol/L pH8.3 Tris-HCl,10mmol/L(NH4)2SO4,30mmol/LKC1,4.5mmol/L MgCl2,0.15mol/L dNTPs;
所述酶混合液包括热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG);其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份,尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份;
所述阴性质控品为灭活阴性人源血浆,B19V定量参考品1-4,临界阳性质控品和强阳性质控品均由B19V病毒血清样本稀释而成,浓度分别为5.0×105,5.0×104,5.0×103,5.0×102,1.0×102,1.0×105IU/ml,B19V病毒血清为灭活病毒血清样本。
更优选地,所述试剂盒还包含内标,为人血DNA。
另外,本发明的细小病毒B19核酸定量检测试剂盒除了包括上述B19V核酸扩増试剂盒外,还包括磁珠法核酸提取试剂盒;
所述磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液、洗脱液、磁珠液;
所述裂解结合液组成为含有十二烷基硫酸钠0.5-2.5%,Triton X-1000.5-2.0ml/100ml,异硫氰酸胍2-6.0mol/L,1-10mmol/L EDTA,所述EDTA的pH值为7.5;
所述漂洗液组成为含有Triton X-100 0.5-2.0ml/l00ml,氯化钠0.1-0.3mol/L,60-80%乙醇;
所述洗脱液组成为含有10mmol/L Tris-HCl,所述Tris-HCl的pH值为8.3,0.01-0.05%Prolin300;
所述磁珠液组成为直径为1μm的氧化硅超顺纳米磁珠,浓度为10-40mg/ml;
另外,优选地,本发明的细小病毒B19(B19V)核酸定量检测试剂盒使用时的扩增程序为:50℃2min,1个循环;95℃9min,1个循环;95℃10s,58℃50s,45个循环,采集荧光信号;38℃5s,1个循环;38℃5sec,1个循环,冷却。
本发明细小病毒B19(B19V)核酸定量检测试剂盒的适用检测样本类型为血清和血浆。
本发明上述细小病毒B19(B19V)核酸定量检测试剂盒的基本原理是:首先釆用纳米磁珠法提取血清、血浆样品中B19V DNA作为扩增模板,然后应用TaqMan荧光探针技术完成对该模板实时荧光定量PCR检测过程。同时扩增体系中引入了高效的内标系统,通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物,避免PCR假阴性。其中,通过应用专业生物信息学软件,分析比较了B19V基因序列,设计了高保守性、特异性和高效性的TaqMan荧光探针和引物以及内标的探针和引物。所述靶基因和内标探针分别标记FAM和ROX荧光报告基团;所述实时荧光定量PCR产物在100-130个碱基对范围。本发明试剂盒采用吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取血清、血浆样品中人细小病毒B19核酸作为模板,应用TaqMan荧光探针技术完成对该模板荧光定量PCR检测过程。同时在反应体系中添加了高效的内标,通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物,避免PCR假阴性的存在。
本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种细小病毒B19核酸定量检测引物与探针组合,并进一步构建了细小病毒B19(B19V)核酸定量检测试剂盒,包括磁珠法核酸提取试剂盒和B19V核酸扩增试剂盒。其优势在于:
1、设计的引物和探针保守性高、特异性强、可以覆盖人细小病毒B19不同的亚型或变种,有利于提高B19V检测的准确性和特异性。
2、检测灵敏度高,重复性好。本发明使用自主开发的磁珠法核酸提取技术,能够从样品中获得高纯度细小病毒B19核酸,消除提取物对PCR反应的干扰,加大了检测样本量,提高了检测灵敏度和稳定性。检测灵敏度为20IU/ml,检测线性范围为20-20×108IU/ml。
3、引入了高效的内标系统,解决了靶基因和内标同时扩增而导致的相互抑制和干扰等问题,能够高效的监控整个PCR扩增整个过程,避免出现假阴性结果。
4、本发明操作简便、快速、成本低廉,并且易于开发为自动化检测系统,以便对大量样品的进行高通量筛检。所检测的样品为人源或动物源的血液、血浆、血清。适合常规血液样品的检测,也适合自动化和高通量检测。
附图说明
图1是本发明检测中检所B19V国家标准品的检测浓度和其理论浓度的拟合曲线图。
图2是本发明对四种浓度B19V阳性血清样本的重复性测试检测结果图。
图3是本发明对20IU/ml灵敏度血清样本的重复测试检测结果图。
图4是本发明检测中检所B19V国家标准品的检测结果图。
图5是本发明检测内标检测结果图。
图6是本发明引物和探针配制检测MIX的结果图。
图7是对照组1引物和探针配制检测MIX的结果图。
图8是对照组2引物和探针配制检测MIX的结果图。
图9是对照组3引物和探针配制检测MIX的结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 B19V核酸荧光定量检测试剂盒的构建和使用方法
本发明细小病毒B19核酸定量检测试剂盒包括B19V核酸扩増试剂盒和模板DNA提取试剂盒。
一、B19V核酸扩増试剂盒
B19V核酸扩増试剂盒包括B19V-PCR反应液、酶混合液、B19V定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。具体如下:
1、引物和探针设计
用于检测靶基因的探针序列为:5’-ATTTGTCGGAAGCCCAGTT-’3(SEQ ID NO:1),5’端标记为FAM荧光发生基团,3’端标记为MGB;
用于内标检测的探针序列为:5’-ATGCCTGCTGACTTGCCTT-’3(SEQ ID NO:2),5’端标记为ROX荧光发生基团,3’端标记为MGB;
用于扩增靶基因的上游引物序列为:5’-TAGTGAAGACTTACACAAGCC-’3(SEQ ID NO:3);
用于扩增靶基因的下游引物序列为:5’-ATACCTAAAGTCATGAATCCTT-’3(SEQ IDN0:4);
用于扩增内标的上游引物序列为:5-CCCACTGCATTGCCGAA-’3(SEQ ID NO:5);
用于扩增内标的下游引物序列为:5’-GCCCAGGAAGACATCCTT-’3(SEQ ID NO:6)。
2、反应体系试剂准备
(1)用于检测靶基因的探针使用浓度为5-20pmol;所述用于检测内标的探针使用浓度为5-20pmol;所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为10-30pmol;所述用于检测内标的引物使用浓度为5-20pmol。
优选地,B19V靶基因的上下游引物浓度为20pmol,探针浓度为8pmol;内标的上下游引物浓度为20pmol,探针浓度为8pmol。
(2)PCR缓冲液组成为:30mol/L Tris-HCl(pH8.3),10mmol/L(NH4)2SO4,30mmol/LKC1,4.5mmol/L MgCl2,0.15mol/L dNTPs。
(3)按比例(裂解结合液200μl/人份+内标1ul/人份)取相应量的裂解结合液及内标,充分混匀成裂解结合液,瞬时离心后备用。
(4)试剂盒中阴性质控品为灭活阴性人源血浆,B19V定量参考品1-4,临界阳性质控品和强阳性质控品均由B19V病毒血清样本稀释而成,浓度分别为5.0×105,5.0×104,5.0×103,5.0×102,1.0×102,1.0×105IU/ml,B19V病毒血清为灭活病毒血清样本。
根据待测样本、阴性对照、阳性对照、临界阳性和工作标准品1-4的量,按比例(PCR反应液34.5μ1/人份+酶混合液0.5μl/人份),充分混匀成PCR-mix,瞬时离心后备用。
(5)试剂盒中酶混合液组成包括热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶;其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份,尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份。
优选地,热启动Taq酶5U、尿嘧啶糖基化酶(UNG)0.2U。
(6)试剂盒中内标是人血DNA。
4、扩增程序如表1
表1 PCR扩增程序
5、加样和检测
向含有PCR反应液的反应管中,分别加入提取的样本、阴性对照、阳性对照、临界阳性对照、及工作标准品各5μ1,盖紧管盖,置于PCR仪上进行检测。扩增程序如表1,检测通道选择:荧光信号收集设定为FAM和ROX通道,然后设置四个工作标准品的浓度。
6、结果判定
(1)反应结束后保存检测数据文件;
(2)分析条件设置:点击Analysis按钮进入分析界面,手动调整Baseline;
(3)检测样本中20IU/ml≤B19V DNA≤2×108IU/ml,结果有效,可直接报告阳性及相应拷贝量;
(4)检测样本中B19V DNA>2×108U/ml,即可直接报告为>2×108IU/ml,也可用正常人B19V DNA阴性血清按10倍梯度对原血清样本做相应稀释,使其拷贝量在1×105-1×107IU/ml范围内再重新测定,测定结果应按稀释倍数进行校正;
(5)检测样本中B19V DNA的拷贝量为10-20IU/ml时,同时,内标检测为阳性且Ct≤38,则报告为B19V DNA阳性,B19V DNA浓度定量值仅供参考;
(6)检测样本中B19V DNA的拷贝量<10IU/ml,同时,内标检测为阳性且Ct≤38,则报告为灰区,B19V DNA浓度低于试剂盒检测下限。
(7)若定量检测结果不显示,同时,内标检测为阳性且Ct≤38,则报告为B19V DNA阴性。
7、质量控制
标准曲线的相关系数R2≥0.980。阳性对照的B19V DNA拷贝量应为5×104-5×105IU/ml,临界阳性对照拷贝量应为50-500IU/ml,阴性对照的Ct值应不显示,同时内标的Ct≤38,试验视为有效。
二、模板DNA提取试剂盒(磁珠法核酸提取)
磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液、洗脱液、磁珠液。
所述裂解结合液组成为:含有十二烷基硫酸钠0.5-2.5%,Triton X-100 0.5-2.0ml/100ml,异硫氰酸胍2-6.0mol/L,1-10mmol/L EDTA,所述EDTA的pH值为7.5;
所述漂洗液组成为:Triton X-100 0.5-2.0ml/l00ml,氯化钠0.1-0.3mol/L,60-80%乙醇;
所述洗脱液组成为:含有10mmol/L Tris-HCl(pH8.3),0.01-0.05%Prolin300;
所述磁珠液组成为:直径为1μm的氧化硅超顺纳米磁珠,浓度为10-40mg/ml。
具体提取方法如下:
(1)取适量1.5ml离心管,分别标记阴性对照、阳性对照、临界阳性对照、工作标准品1-4及待测样本,每管中加入200μ1裂解结合液,裂解结合液组成为含有十二烷基硫酸钠0.5-2.5%,Triton x-100 0.5-2.0ml/100ml,异硫氰酸胍2mol/L-6.0mol/L,1-10mmol/LEDTApH7.5)。
(2)每管加入200μ1待测样本或阴性对照、阳性对照、临界阳性对照、工作标准品1-4;每管加入10μl磁珠悬液,震荡混匀后,室温静置13分钟,瞬时离心;
(3)将离心管置于磁力架上吸附约2分钟,弃掉上清液,瞬时离心,吸干残液;
(4)加入600μl漂洗液,所述漂洗液组成为含有Triton x-100 0.5-2.0ml/100ml氯化钠0.1-0.3mol/L,60-80%乙醇。用移液器反复吸打后,瞬时离心。在磁力架上吸附2分钟,弃掉上清液;
(5)加入100μ1洗脱液,所述洗脱液为含有10mol/L Tris.HCl(PH8.3),0.01-0.05%Prolin300;56℃静置2分钟;将离心管放置在磁力架上吸附2分钟,吸出上清液。
实施例2B19V DNA的荧光定量PCR检测实例
利用ABI7500定量PCR仪,按照实施例1试剂盒的检测方法进行检测。
1、国家标准品测试:
以中检所人细小病毒B19核酸检测试剂国家标准品血清(L1-L8)为待测样本,采用本发明方法进行检测,最后分析中检所人细小病毒B19核酸定量标准品的检测值和理论值之间的双对数线性关系。
检测结果见图1和表2,理论浓度和检测浓度的双对数曲线线性相关系数(R2)为0.9995,符合标准品的要求,即线性相关系数(R2)≥0.98.表明我们的试剂盒准确可靠可以溯源到中检所国家标准品。
表2国家标准品检验结果
2、样本的重复性测试
以中检所人细小病毒B19核酸检测试剂国家标准品血清(L1-L4)为待测样本,每个样本重复测试三次,结果如图.2所示。CT值的变异系数分别为0.87%,0.67%,0.66%,0.12%,变异系数均控制在1%以内,表明运用本发明方法检测血清样本的重复性很好。
3、灵敏度样本测试
以中检所人细小病毒B19核酸检测试剂国家标准品血清(L1-L8)为待测样本,用血清将其稀释到20IU/ml制备成为灵敏度血清样本,样本重复测试20次,阳性检出率为100%,结果如图3。
4、内标干扰测试
以中检所人细小病毒B19核酸检测试剂国家标准品血清(L1-L8)为待测样本,直接进行检测。测试结果表明,在L1-L8这8个浓度范围内,内标检测信号稳定,内标阳性检出率为100%。并且内标没有对低浓度的L8(浓度约为102IU/ml)样本检测带来负面影响。同时高浓度的L1(浓度约为109IU/ml)样本也没有对内标扩增产生影响,结果如图.4.测试结果表明,运用本发明的内标能够对PCR扩增假阴性起到高效的监控作用.
综上,本发明与目前国内外常用的煮沸法和柱提法相比,无论是在灵敏度上,还是在操作的简便程度上都有很大的优势。本发明适用于临床血液、血清、血浆的检测和诊断,监测和评价药物的疗效,也可用于中心血站血液筛査以及流行病学调查。
实施例3本发明试剂盒中引物与探针的设计优化
本发明实施例1试剂盒中的引物和探针是经过了大量的探索研究才得到的。
具有如下表3:
表3
参照实施例1和实施例2中记载的试剂盒及其使用方法,利用上述各组引物进行检测。
结果如图6~图9和表4。
表4各组MIX检测结果Ct值
引物与探针组合 | 内标Ct值 | 靶序列Ct值 |
本发明引物与探针组合 | 24.601 | 33.036 |
对照组1 | 30.260 | 36.939 |
对照组2 | 24.629 | 36.193 |
对照组3 | 28.379 | 37.893 |
结果显示,针对内标Ct均值,本发明所用引物与探针组合及对照组2最优,对照组3次之,对照组1较差;针对靶序列Ct均值,本发明所用引物与探针组合最优,对照组1和对照组2次之,对照组3较差。
针对扩增曲线线形,对照组2与对照组3的两次检测之间差异较大,重复性较差;对照组1中内靶序列扩增曲线线形没有平台期的趋势,非最优组合;本发明所用引物与探针组合的线形符合常规荧光PCR方法的扩增曲线,且Ct均值最优。
综上所述,本发明所用引物与探针组合为目前最优的组合。同时也表明对于EB病毒核酸检测的引物与探针设计是至关重要的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种细小病毒B19核酸定量检测引物与探针组合,其特征在于:包括如下组分:
用于检测靶基因的探针为:5’-ATTTGTCGGAAGCCCAGTT-’3,其5’端标记为FAM荧光发生基团,3’端标记为MGB;
用于内标检测的探针为:5’-ATGCCTGCTGACTTGCCTT-’3,其5’端标记为ROX荧光发生基团,3’端标记为MGB;
用于扩增靶基因的上游引物为:5’-TAGTGAAGACTTACACAAGCC-’3;
用于扩增靶基因的下游引物为:5’-ATACCTAAAGTCATGAATCCTT-’3;
用于扩增内标的上游引物为:5-CCCACTGCATTGCCGAA-’3;
用于扩增内标的下游引物为:5’-GCCCAGGAAGACATCCTT-’3。
2.权利要求1所述引物与探针组合在制备细小病毒B19检测产品方面的应用。
3.一种细小病毒B19核酸定量检测试剂盒,其特征在于:含有权利要求1所述引物与探针组合。
4.根据权利要求3所述试剂盒,其特征在于:用于检测靶基因的探针使用浓度为5-20pmol;所述用于检测内标的探针使用浓度为5-20pmol;所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为10-30pmol;所述用于检测内标的引物使用浓度为5-20pmol。
5.根据权利要求4所述试剂盒,其特征在于:用于检测靶基因的探针使用浓度为8pmol;所述用于检测内标的探针使用浓度为8pmol;所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为20pmol;所述用于检测内标的引物使用浓度为20pmol。
6.根据权利要求3-5任一所述试剂盒,其特征在于:还包括B19V-PCR反应液、酶混合液、B19V定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品;
所述B19V-PCR反应液包括权利要求1所述引物与探针组合和PCR缓冲液;
所述PCR缓冲液组成为30mol/L pH8.3 Tris-HCl,10mmol/L(NH4)2SO4,30mmol/L KC1,4.5mmol/L MgCl2,0.15mol/L dNTPs;
所述酶混合液包括热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG);其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份,尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份;
所述阴性质控品为灭活阴性人源血浆,B19V定量参考品1-4,临界阳性质控品和强阳性质控品均由B19V病毒血清样本稀释而成,浓度分别为5.0×105,5.0×104,5.0×103,5.0×102,1.0×102,1.0×105IU/ml,B19V病毒血清为灭活病毒血清样本。
7.根据权利要求6所述试剂盒,其特征在于:还包含内标,为人血DNA。
8.根据权利要求3-7任一所述试剂盒,其特征在于:试剂盒包括B19V核酸扩増试剂盒和磁珠法核酸提取试剂盒;
所述B19V核酸扩増试剂盒的组分如权利要求3-7所述;
所述磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液、洗脱液、磁珠液;
所述裂解结合液组成为含有十二烷基硫酸钠0.5-2.5%,Triton X-100 0.5-2.0ml/100ml,异硫氰酸胍2-6.0mol/L,1-10mmol/L EDTA,所述EDTA的pH值为7.5;
所述漂洗液组成为含有Triton X-100 0.5-2.0ml/l00ml,氯化钠0.1-0.3mol/L,60-80%乙醇;
所述洗脱液组成为含有10mmol/L Tris-HCl,所述Tris-HCl的pH值为8.3,0.01-0.05%Prolin300;
所述磁珠液组成为直径为1μm的氧化硅超顺纳米磁珠,浓度为10-40mg/ml。
9.根据权利要求3-8任一所述试剂盒,其特征在于:试剂盒使用时的扩增程序为:50℃2min,1个循环;95℃9min,1个循环;95℃10s,58℃50s,45个循环,采集荧光信号;38℃5s,1个循环;38℃5sec,1个循环,冷却。
10.根据权利要求3-8任一所述试剂盒,其特征在于:检测样本类型为血清和血浆。
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CN114410836A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-04-29 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 一种集样本处理、核酸提取及多重恒温扩增一体化的检测人细小病毒b19的试剂盒和方法 |
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