CN103642942B - 一种丙型肝炎病毒（hcv）高精确核酸定量检测试剂盒 - Google Patents

一种丙型肝炎病毒（hcv）高精确核酸定量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种应用于生物医学临床诊断领域中的丙型肝炎病毒（HCV）高精确核酸定量检测试剂盒，该试剂盒包括磁珠法核酸提取试剂盒和HCV核酸扩增试剂盒，所述磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液A、漂洗液B、漂洗液C、洗脱液、磁珠液；所述HCV核酸扩增试剂盒包括RT-PCR反应液、酶混合液、HCV-内标、HCV定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品；所述磁珠法核酸提取试剂中裂解结合液组成为十二烷基硫酸钠0.5-2.5%，TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，异硫氰酸胍2mol/L-6.0mol/L，1-10mM？EDTA（PH7.5）。该发明操作简便快速、成本低廉、引物和探针基因型覆盖率高、保守性高、特异性强、检测灵敏度高，重复性好，能够很好的模拟真实病毒的提取状态。

Description

一种丙型肝炎病毒（HCV）高精确核酸定量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学临床诊断领域中的一种丙型肝炎病毒（HCV）高精确核酸定量检测试剂盒。
背景技术
丙型肝炎是全球最严重的公共卫生问题之一，丙型肝炎呈世界性分布。丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus，HCV)感染率为0.1％～10％，平均为3％，全球约1.7～2亿人感染HCV。中国拥有世界上最多的慢性丙型病毒性肝炎（HCV）感染者，约3800万。丙型肝炎病毒感染发展为慢性感染的机率远远高于乙肝病毒感染，一般来说，HCV感染者中70～80％发展成慢性丙型肝炎，慢性丙型肝炎的表现亦轻重不等，约20～30％可逐渐发展至肝硬化，肝硬化患者中，每年约1％～4％可发展为肝癌。
酶联免疫试剂是目前诊断丙型肝炎的主要手段。针对HCV抗原，抗体而设计的酶联免疫试剂目前已经普遍用于临床，急诊，血液筛查等各个领域。但是，酶联免疫方法作为一种间接滞后的检测方法，他所检测的目标是人体内产生的抗体而不是病原体本身。因此，虽然酶联免疫方法经过几代的改良和进化，在灵敏度、特异性、精确度和稳定性等方面有了巨大的提高。但是仍（任）然不能消除对“窗口期”标本的漏检。所谓“窗口期”，是指从感染病原体开始，直至用酶联免疫学检测方法能够检测到该病原体存在为止的这一段时间。丙肝的“窗口期”比较长，大约为56-60天，因此，HCV酶联免疫试剂容易造成漏检，不利于丙肝的早期诊断。近年来核酸分子检测技术在检验医学和临床研究中显示出强大的优势，相比较免疫诊断技术具有灵敏度高、特异性强、诊断快速等优点。血清中的HCVRNA是病毒复制和肝炎进程的确切标志，所以血清中HCVRNA的检测，已成为诊断丙肝的“金标准”方法。近几年来，通过荧光定量PCR方法直接检测HCVRNA已经成为一种通用丙肝医学检测方法，大大提高了丙肝的检测准确性，有利于疾病的早期诊断，可将“窗口期”大大的缩短。目前，丙型肝炎荧光定量PCR检测目前已经是通过国家认证临床PCR实验室的常规检测项目之一。丙型肝炎荧光定量PCR检测在丙肝病人的康复治疗过程中具有用药指导意义，同时，丙肝病毒载量的精确判读，也为患者提供了准确的康复治疗方案。
近年来，相比于传统的病毒核酸提取技术，市场上涌现了一些简单方便的核酸提取技术。主要涉及两种类型技术：离心柱法病毒核酸提取技术和磁珠法病毒核酸提取技术。前者由于提取技术中的离心柱配套使用的高通量自动化离心设备成本过高，难于普及推广。磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒（即磁珠-DNA混合物），再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。磁珠法不需要加入多种试剂，操作简单，符合核酸自动化提取要求，是未来核酸纯化方法发展的一个重要方向。另外，磁珠提取核酸能够获得较高的回收产率。国内已有的HCV荧光定量PCR检测试剂不多，仅有3-4种，且均为离心柱法回收核酸。
目前市售的丙型肝炎病毒（HCV）核酸定量检测试剂盒还有很多缺点，其中之一就是使用的质控品和标准品是裸露的RNA片段，由于裸露的RNA片段极不稳定，因此导致试剂的稳定性和重复性比较差。同时，由于裸露的RNA片段与真实病毒差距过大，无法模拟真实病毒的提取状态。另外，也导致产品无法与国际标准血清盘进行溯源。因此，研究开发一种丙型肝炎病毒（HCV）高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒是目前急待解决的新课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丙型肝炎病毒（HCV）高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒，该发明从根本上解决现有丙型肝炎病毒（HCV）核酸定量PCR技术存在的灵敏度低、准确性差等问题，其设计的引物和TaqMan荧光探针位于HCV基因组的5’UTR区域，该引物和探针具有基因型覆盖范围广，检测灵敏度高，特异性强、稳定性好，应用磁珠法进行RNA提取，方法简单，核酸纯度高，提取样本可为血清或血浆，样本量大，采用内标和防污染体系提高检测精确度，采用耐DNase和RNase假病毒作为工作标准品和质控品，提高试剂盒的稳定性。
本发明的目的是这样实现的：一种丙型肝炎病毒（HCV）高精确核酸定量检测试剂盒，该试剂盒包括磁珠法核酸提取试剂盒和HCV核酸扩增试剂盒，所述磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液A、漂洗液B、漂洗液C、洗脱液、磁珠液；所述HCV核酸扩增试剂盒包括RT-PCR反应液、酶混合液、HCV-内标、HCV定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品；所述磁珠法核酸提取试剂中裂解结合液组成为十二烷基硫酸钠0.5-2.5%，TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，异硫氰酸胍2mol/L-6.0mol/L，1-10mMEDTA（PH7.5）；所述漂洗液A组成为TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，氯化锂0.5-1mol/L；所述漂洗液B组成为TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，氯化钾0.1-0.3mol/L，60-80%乙醇；所述漂洗液C组成为TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，氯化钠0.1-0.3mol/L，60-80%乙醇；所述洗脱液为10mmol/LTris.HCl（PH8.3），0.01-0.05%Prolin300；所述磁珠液为直径为1μm的氧化硅超顺纳米磁珠，浓度为10-40mg/ml；所述HCV核酸扩增试剂盒中RT-PCR反应液包括用于检测靶基因和内标的探针、用于扩增靶基因和内标的上游引物以及下游引物、RT-PCR缓冲液，HCV核酸扩增试剂盒中用于检测靶基因的探针序列为：5'-TACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCC-'3（SEQIDNO:1），5'端标记为FAM荧光发生基团，3'端标记为BHQ1荧光淬灭基团；用于扩增内标检测的探针序列为：5'-CAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGC-'3（SEQIDNO:2），5'端标记为HEX荧光发生基团，3'端标记为BHQ1荧光淬灭基团；用于扩增靶基因的上游引物序列为5'-ACTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-'3（SEQIDNO:3），下游序列为5'-AGTGTGCTCATGTTGCACGGTC-'3（SEQIDNO:4）；用于扩增内标的上游引物序列为5'-TTCGATCTCCGTCGAACCTTG-'3（SEQIDNO:5），下游序列为5'-TTCTCAGGACTCCAGTCGCTG-'3（SEQIDNO:6）；所述用于检测靶基因的使用探针浓度为5-20pmol，优选靶基因探针使用浓度为8pmol；用于检测内标的探针使用浓度为5-20pmol，优选内标探针使用浓度为8pmol；用于检测靶基因的上游引物以及下游引物使用浓度为10-30pmol，优选靶基因上游引物以及下游引物使用浓度为20pmol；用于检测内标的上游引物以及下游引物使用浓度为5-20pmol，优选内标上游引物以及下游引物使用浓度为8pmol；所述RT-PCR缓冲液组成为50mmol/LTris-HCl（PH8.3），10mmol/L(NH4)2SO4，75mmol/LKCl，2.5mmol/LMgSO4，0.15mmol/LdNTPs；所述酶混合液包括逆转录酶（M-MLV酶）、热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶（UNG）、RNase抑制剂、T4噬菌体GP32蛋白；其中M-MLV酶用量为50-200U/人份，热启动Taq酶用量为3-8U/人份、尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份、RNase抑制剂用量为5-10U/人份、T4噬菌体GP32蛋白用量为1-5μg/人份；所述试剂盒中“HCV-内标”是将序列
5'-TTCGATCTCCGTCGAACCTTGCACTCTGCATCCTGGACTCATGCTGACTGCAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGCTCTACTGCACTCCTGCGTCATCACGCGACTGGAGTCCTGAGAA-'3（SEQIDNO:7）插入到pUC18T载体而构成的重组体；HCV-内标质粒使用浓度为100-500copies/次，优选使用浓度为100copies/次；所述试剂盒中阴性质控品为灭活阴性人源血浆，HCV定量参考品1-4，临界阳性质控品和强阳性质控品均由含有HCVRNA片段假病毒颗粒稀释而成，稀释基质为灭活阴性人源血浆，且浓度分别为1.0×107，1.0×106，1.0×105，1.0×104，1.0×103，1.0×106IU/ml；所述试剂盒需要进行“RT-PCR”反应，其扩增的最佳反应温度和时间为：50℃逆转录20min，1个循环；95℃5min，1个循环；最后94℃10s，60℃30s，45个循环采集荧光信号；所述试剂盒中检测样本类型为血清和血浆，试剂盒的检测灵敏度为25IU/ml，检测线性范围为100-1×108IU/ml。
本发明的要点在于一种丙型肝炎病毒（HCV）高精确核酸定量检测试剂盒。其药学原理是：首先采用纳米磁珠法提取血清、血浆样品中HCVRNA作为扩增模板，然后应用TaqMan荧光探针技术完成对该模板实时荧光定量RT-PCR检测过程。同时扩增体系中引入了高效的内标系统，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。其中，通过应用专业生物信息学软件，分析比较了800多条HCV基因组序列，设计了高保守性、特异性和高效性的TaqMan荧光探针和引物以及内标的探针和引物。所述靶基因和内标探针分别标记FAM和HEX荧光报告基团；所述实时荧光定量PCR产物在70-130个碱基对范围。同时，荧光定量RT-PCR检测过程使用了双酶一步法技术，避免了两步法的易污染，操作繁琐，灵敏度低等众多缺陷。
本发明试剂盒采用吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取血清、血浆样品中丙肝病毒核酸作为模板，应用TaqMan荧光探针技术完成对该模板荧光定量PCR检测过程。同时在反应体系中添加了高效的内标，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性的存在。
本发明的优点在于：
1、引物和探针基因型覆盖率高、保守性高、特异性强。经测试表明本发明能够覆盖HCV的6个基因型，与国际先进的丙型肝炎核酸诊断试剂性能基本相当。
2、检测灵敏度高，重复性好。本发明使用自主开发的磁珠法核酸提取技术，能够从样品中获得高纯度丙型肝炎病毒（HCV）核酸，消除提取物对PCR反应的干扰，加大了检测样本量，提高了检测灵敏度和稳定性。
3、引入了高效的内标系统，解决了靶基因和内标同时扩增而导致的相互抑制和干扰等问题，能够高效的监控整个PCR扩增整个过程，避免出现假阴性结果。
4、引入RNA假病毒制备工艺，增加了HCV核酸检测试剂的安全性，并能提供稳定的工作标准品和阳性质控品。同时，工作标准品和阳性质控品与样本同步参与核酸提取过程，能够很好的模拟真实病毒的提取状态。
5、本发明操作简便、快速、成本低廉，并且易于开发为自动化检测系统，以便对大量样品的进行高通量筛检。所检测的样品中包括人源或动物源的血液、精液、唾液。适合常规血液样品的检测，也适合自动化和高通量检测。该诊断试剂可以判断传染病的病情、预后和传染性，预测抗病毒治疗的效果，监测和评价抗病毒药物的疗效，提高血液和血液制品的筛选质量和应用于流行病学调查领域，为临床病原体载量的监测和治疗方案以及药物的筛选提供了重要参考。
一种丙型肝炎病毒（HCV）高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒与现有技术相比，具有操作简便快速、成本低廉、引物和探针基因型覆盖率高、保守性高、特异性强、检测灵敏度高，重复性好、引入高效的内标系统解决靶基因和内标同时扩增而导致的相互抑制和干扰，能够高效的监控整个PCR扩增整个过程，避免出现假阴性结果、引入RNA假病毒制备工艺增加HCV核酸检测试剂的安全性、提供稳定的工作标准品和阳性质控品、工作标准品和阳性质控品与样本同步参与核酸提取过程，能够很好的模拟真实病毒的提取状态等优点，将广泛的应用于生物医学临床诊断领域中。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。
图1本发明检测线性样本血清的检测结果图。
图2本发明对四种浓度HCV阳性血清样本的重复性测试检测结果图。
图3本发明对25IU/ml灵敏度血清样本的检测结果图。
图4本发明内标检测结果图。
具体实施方式
以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。
实施例一
HCVRNA的荧光定量PCR检测实例
（1）试剂准备
a.RT-PCR反应液的配制
RT-PCR缓冲液组成为50mmol/LTris-HCl（PH8.3），10mmol/L(NH4)2SO4，75mmol/LKCl，2.5mmol/LMgSO4，0.15mmol/LdNTPs。扩增靶基因的上游引物以及下游引物，使用浓度为20pmol，靶基因检测的探针使用浓度为8pmol，内标的上游引物以及下游引物使用浓度为8pmol，内标探针使用浓度为8pmol。
b.按比例(裂解结合液400μl/人份+内标0.1μl/人份)取相应量的裂解液结合液及内标，充分混匀成裂解结合液-mix，瞬时离心后备用。
c.根据待测样本、阴性对照、阳性对照、临界阳性和工作标准品1-4的量，按比例(RT-PCR反应液28.5μl/人份+酶混合液1.5μl/人份)，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。酶混合液组成包括逆转录酶（M-MLV酶）120U、热启动Taq酶3U、尿嘧啶糖基化酶（UNG）0.1U、RNase抑制剂5U、T4噬菌体GP32蛋白1μg。
（2）标本提取
a.取适量1.5ml离心管，分别标记阴性对照、阳性对照、临界阳性对照、工作标准品1-4及待测样本，每管中加入400μl裂解结合液,裂解结合液组成为含有十二烷基硫酸钠0.5-2.5%，TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，异硫氰酸胍2mol/L-6.0mol/L，1-10mMEDTA（PH7.5）；
b.每管加入200μl待测样本或阴性对照、阳性对照、临界阳性对照、工作标准品1-4；每管加入10μl磁珠悬液（磁珠液直径为1μm的氧化硅超顺纳米磁珠，浓度为20mg/ml），震荡混匀10秒钟后，室温静置10分钟，瞬时离心；
c.将离心管置于磁力架上吸附约2分钟，弃掉上清液，瞬时离心，吸干残液；
d.加入600μl漂洗液A，漂洗液A组成为含有TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，氯化锂0.5-1mol/L，60-80%乙醇。用移液器反复吸打10次后，瞬时离心。在磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液，然后瞬时离心，将离心管再置于磁力架上吸附约2分钟，吸干残液；
e.加入600μl漂洗液B，所述漂洗液B组成为含有TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，氯化钾0.1-0.3mol/L，60-80%乙醇；用移液器反复吸打10次后，瞬时离心。在磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液，然后瞬时离心，将离心管再置于磁力架上吸附约2分钟，吸干残液；
f.加入600μl漂洗液C，所述漂洗液C组成为含有TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，氯化钠0.1-0.3mol/L，60-80%乙醇。用移液器反复吸打10次后，瞬时离心。在磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液，然后瞬时离心，将离心管再置于磁力架上吸附约2分钟，吸干残液；
g.加入40μl洗脱液，所述洗脱液为含有10mmol/LTris.HCl（PH8.3），0.01-0.05%Prolin300。震荡混匀10秒钟，然后65℃温浴2分钟；将离心管放置在磁力架上吸附2分钟，吸出上清液。
（3）扩增和检测
向含有RT-PCR反应液的反应管中，分别加入提取的样本、阴性对照、阳性对照、临界阳性对照、及工作标准品各20μl，盖紧管盖，置于PCR仪上进行检测。扩增程序如下：
以ABI7500为例，设置如表.1：
检测通道选择：荧光信号收集设定为F1（FAM）和F2（VIC）通道，然后设置四个工作标准品的浓度。
（4）结果判定
a)反应结束后保存检测数据文件；
b)分析条件设置：点击Analysis按钮进入分析界面，手动调整Baseline；
c)检测样本中100IU/ml≤HCVRNA≤1×108IU/ml，结果有效，可直接报告阳性及相应拷贝量；
d)检测样本中HCVRNA＞1×108IU/ml，即可直接报告为＞1×108IU/ml，也可用正常人HCVRNA阴性血清按10倍梯度做相应稀释，使其拷贝量在1×105～1×107IU/ml范围内再重新测定，测定结果应按稀释倍数进行校正；
e)检测样本中HCVRNA的拷贝量为25-100IU/ml时，同时，内标检测为阳性且Ct≤35，则报告为HCVRNA阳性，HCVRNA浓度定量值仅供参考。
f)检测样本中HCVRNA的拷贝量＜25IU/ml，同时，内标检测为阳性且Ct≤35，则报告为灰区，HCVRNA浓度低于试剂盒检测下限。
g)若定量检测结果不显示，同时，内标检测为阳性且Ct≤35，则报告为HCVRNA阴性。
（5）质量控制
标准曲线的相关系数R≥0.980。阳性对照的HCVRNA拷贝量应为5×105-5×106IU/ml，临界阳性对照拷贝量应为500～5×103IU/ml，阴性对照的Ct值应不显示，同时内标的Ct≤35，试验视为有效。
（一）线性血清样本测试
以临床HCV高值阳性血清样本（3x108IU/ml）作为初始样本，使用阴性血清进行稀释，最终稀释成为7个梯度的线性样本，浓度分别为1x108IU/ml，1x107IU/ml，1x106IU/ml，1x105IU/ml，1x104IU/ml，1x103IU/ml和1x102IU/ml，采用本发明方法进行检测，检测结果见图.1。检测结果表明，本发明对于线性样本检测结果的线性相关系数R=0.993，表明本发明的线性范围较宽适合临床绝大多数样本的检测。
（二）样本的重复性测试
以临床HCV阳性血清（1x107IU/ml）为初始样本，用血清将其稀释成为1x106，1x105，1x104和1x103IU/ml四个梯度样本。每个样本重复测试四次，结果如图.2所示。CT值的变异系数分别为0.22%，0.35%，0.28%，0.31%，变异系数均控制在1%以内，表明运用本发明方法检测血清样本的重复性很好。
（三）灵敏度样本测试
以国际NIBSCHCV标准品血清盘（5.0x105IU/ml）作为初始样本，用血清将其稀释到25IU/ml制备成为灵敏度血清样本，样本重复测试20次，阳性检出率为100%，结果如图.3。
（四）内标干扰测试
以上述7个梯度的线性样本作为待测样本，每个样本重复测试3次，每个样本中内标添加浓度为100copies。测试结果表明，在这些样本检测过程中，内标检测信号稳定，内标阳性检出率为100%。并且内标没有对低浓度的线性样本（100IU/ml）检测带来负面影响。同时高浓度的线性样本（1x108IU/ml）样本也没有对内标扩增产生影响，结果如图.4。测试结果表明，运用本发明的内标能够对PCR扩增假阴性起到高效的监控作用。
综上，本发明与目前国内外常用的柱提法相比，无论是在基因型覆盖率，灵敏度上，还是在操作的简便程度上都有很大的优势。本发明适用于临床血液检测和诊断，监测和评价药物的疗效，也可用于中心血站血液筛查以及流行病学调查。

Claims (4)

1.一种丙型肝炎病毒(HCV)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括磁珠法核酸提取试剂盒和HCV核酸扩增试剂盒，所述磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液A、漂洗液B、漂洗液C、洗脱液、磁珠液；所述HCV核酸扩增试剂盒包括RT-PCR反应液、酶混合液、HCV-内标、HCV定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品；
所述磁珠法核酸提取试剂中裂解结合液组成为十二烷基硫酸钠0.5-2.5％，TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，异硫氰酸胍2mol/L-6.0mol/L，1-10mMEDTA；所述漂洗液A组成为TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，氯化锂0.5-1mol/L；所述漂洗液B组成为TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，氯化钾0.1-0.3mol/L，60-80％乙醇；所述漂洗液C组成为TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，氯化钠0.1-0.3mol/L，60-80％乙醇；所述洗脱液为10mmol/LTris.HCl，0.01-0.05％Prolin300；所述磁珠液为直径为1μm的氧化硅超顺纳米磁珠，浓度为10-40mg/ml；
所述HCV核酸扩增试剂盒中RT-PCR反应液包括用于检测靶基因和内标的探针、用于扩增靶基因和内标的上游引物以及下游引物、RT-PCR缓冲液，HCV核酸扩增试剂盒中用于检测靶基因的探针序列为：
5'-TACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCC-'3(SEQIDNO:1)，5'端标记为FAM荧光发生基团，3'端标记为BHQ1荧光淬灭基团；用于扩增内标检测的探针序列为：5'-CAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGC-'3(SEQIDNO:2)，5'端标记为HEX荧光发生基团，3'端标记为BHQ1荧光淬灭基团；用于扩增靶基因的上游引物序列为5'-ACTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-'3(SEQIDNO:3)，下游序列为5'-AGTGTGCTCATGTTGCACGGTC-'3(SEQIDNO:4)；用于扩增内标的上游引物序列为5'-TTCGATCTCCGTCGAACCTTG-'3(SEQIDNO:5)，下游序列为5'-TTCTCAGGACTCCAGTCGCTG-'3(SEQIDNO:6)；
所述用于检测靶基因的使用探针浓度为5-20pmol；用于检测内标的探针使用浓度为5-20pmol；用于检测靶基因的上游引物以及下游引物使用浓度为10-30pmol；用于检测内标的上游引物以及下游引物使用浓度为5-20pmol；
所述RT-PCR缓冲液组成为50mmol/LTris-HCl，10mmol/L(NH4)2SO4，75mmol/LKCl，2.5mmol/LMgSO4，0.15mmol/LdNTPs；
所述酶混合液包括逆转录酶、热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG)、RNase抑制剂、T4噬菌体GP32蛋白；所述的逆转录酶为M-MLV酶，其中M-MLV酶用量为50-200U/人份，热启动Taq酶用量为3-8U/人份、尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份、RNase抑制剂用量为5-10U/人份、T4噬菌体GP32蛋白用量为1-5μg/人份；
所述试剂盒中“HCV-内标”是将序列
5'-TTCGATCTCCGTCGAACCTTGCACTCTGCATCCTGGACTCATGCTGACTGCAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGCTCTACTGCACTCCTGCGTCATCACGCGACTGGAGTCCTGAGAA-'3(SEQIDNO:7)插入到pUC18T载体而构成的重组体；HCV-内标质粒使用浓度为100-500copies/次；
所述试剂盒中阴性质控品为灭活阴性人源血浆，HCV定量参考品1-4，临界阳性质控品和强阳性质控品均由含有HCVRNA片段假病毒颗粒稀释而成，稀释基质为灭活阴性人源血浆，且浓度分别为1.0×107，1.0×106，1.0×105，1.0×104，1.0×103，1.0×106IU/ml。
2.如权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒(HCV)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒需要进行“RT-PCR”反应，其扩增的最佳反应温度和时间为：50℃逆转录20min，1个循环；95℃5min，1个循环；最后94℃10s，60℃30s，45个循环采集荧光信号。
3.如权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒(HCV)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中检测样本类型为血清和血浆，试剂盒的检测灵敏度为25IU/ml，检测线性范围为100-1×108IU/ml。
4.如权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒(HCV)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述靶基因探针使用浓度为8pmol；用于检测内标的探针使用浓度为8pmol；用于检测靶基因的上游引物以及下游引物使用浓度为20pmol；用于检测内标的上游引物以及下游引物使用浓度为8pmol；HCV-内标质粒使用浓度为100copies/次。
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