CN103898239B - 一种同管检测htlv-i和htlv-ii前病毒的引物和方法 - Google Patents

一种同管检测htlv-i和htlv-ii前病毒的引物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测人类T淋巴细胞白血病病毒I型和II型前病毒的引物和方法，包括检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针和检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针，并在同一PCR管中按合理的浓度比加入上述两种引物及探针，并通过已优化的Real-time？PCR反应条件对样本进行检测。本检测方法在血清学变化之前即可检测是否有HTLV感染，大幅度缩短了窗口期，同时相对于常规的血清学检测方法具有检测周期短，特异性高，准确度高，灵敏度高，条件依赖少，污染风险低等优点。检测结果有助于监测患者HTLV前病毒载量的变化及限制HTLV病毒的传播。

Description

一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物和方法
技术领域
本发明属于医学检验领域，具体涉及一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物和方法。
背景技术
人类T淋巴细胞白血病病毒（HumanT-celllymphotropicvirus,HTLV）是1980年美国人Gallo首先从皮肤型T细胞淋巴瘤患者体内发现的第一种人类逆转录病毒，按基因组学及血清学反应可分为1型（HTLV-I）和2型（HTLV-II）。该病毒为球型颗粒，内部由RNA核蛋白及围绕在外的20面体蛋白衣壳组成，最外层具有包膜结构，表面镶嵌有糖蛋白。目前全世界大约1000到2000万人感染HTLV病毒，而在我国的北京、广西、江西、新疆、柳州、合肥和四川等10多个省市已发现了HTLV感染病例，同时某些沿海地区也出现了局部小规模流行。
HTLV感染细胞主要通过细胞间感染的方式，游离病毒颗粒是没有感染能力的。HTLV感染细胞与未感染细胞建立突触，进而使病毒蛋白和RNA染色体组进入靶细胞。通过逆转录酶使病毒RNA逆转录为cDNA，同时这种前病毒DNA被整合到宿主细胞，最终引起成人T细胞白血病、热带痉挛性瘫痪及其他相关神经疾病的产生。
HTLV病毒的传播途径主要有输血传播、母乳传播及性传播三种，而迄今有效的治疗药物和预防性疫苗尚未研制成功。因此，唯一积极的控制办法就是及时发现HTLV感染者，并采取措施切断其传播途径。
目前较为常用的检测方法是采用ELISA法检测HTLV抗体，其它还有间接免疫荧光法、蛋白印迹试验及重组免疫印记等。但研究显示并非所有的HTLV感染者都会产生抗体，且血液标本中尚存在单细胞感染，因此血清学检测存在一些假阳性和假阴性问题，特异性较差，无法很好地解决上述问题。本检测方法在血清学变化之前即可检测是否有HTLV感染，大幅度缩短了窗口期，同时相对于常规的血清学检测方法具有检测周期短，特异性高，准确度高，灵敏度高，条件依赖少，污染风险低等优点。检测结果将有助于临床筛选，监测患者HTLV前病毒载量的变化及限制HTLV病毒的传播。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物，包括检测HTLV-I前病毒的特异性引物（SEQNO1和SEQNO2）及探针（SEQNO3）和检测HTLV-II前病毒的特异性引物（SEQNO4和SEQNO5）及探针（SEQNO6），其中：
(i)检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针：
SEQNO1：CCCATTGGCTCCTGTGAAAG；
SEQNO2：TTGAGACAGCGCCACGAAC；
SEQNO3：JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(ii)检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针：
SEQNO4：TTGCCATACCTGTCAAACCATC；
SEQNO5：CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC；
SEQNO6：FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA。
进一步地，在检测HTLV-I和HTLV-II前病毒时，所述的引物同时被使用，并被放置在同一个反应管中。
进一步地，在总反应体积为25ul时，引物和探针的使用量为：引物SEQNO1、SEQNO2、SEQNO4、SEQNO5各0.6ul、探针SEQNO3和SEQNO6各0.3ul。
进一步地，所述的引物参与的反应程序为95℃5min预变性；95℃15s，59℃35s循环40次。
本发明还提供一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的方法，包括：
(1)提取样本中的DNA；
(2)以步骤(1)中的DNA作为模板，在同一PCR管同时加入检测HTLV-I前病毒的引物及探针和检测HTLV-II前病毒的引物及探针，并通过Real-timePCR反应对样本进行检测，其中：
(i)检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针：
SEQNO1：CCCATTGGCTCCTGTGAAAG；
SEQNO2：TTGAGACAGCGCCACGAAC；
SEQNO3：JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(ii)检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针：
SEQNO4：TTGCCATACCTGTCAAACCATC；
SEQNO5：CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC；
SEQNO6：FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA；
(3)根据结果来分析样本是否感染HTLV病毒。
进一步地，Real-timePCR的反应体系为25ul，包括2*qPCRMIX12.5ul、引物SEQNO1、SEQNO2、SEQNO4、SEQNO5各0.6ul、探针SEQNO3和SEQNO6各0.3ul、灭菌水7.5ul、DNA模板2ul。
进一步地，Real-timePCR反应程序为：95℃5min预变性；95℃15s，59℃35s循环40次。
进一步地，对检测结果分析包括：若样本产生一条扩增曲线，且CT值≤38，则样本为HTLV阳性，且根据相对应的探针，可判断样本所感染的HTLV基因型；若样本未产生扩增曲线，则判定样本为阴性。
有益效果：目前较为常用的检测方法有是ELISA法、间接免疫荧光法、蛋白印迹试验及重组免疫印记等。但并非所有的HTLV感染者都会产生抗体，且血液标本中尚存在单细胞感染，因此血清学检测存在一些假阳性和假阴性问题，特异性较差，无法很好地解决上述问题，而检测HTLV的核酸检测方法主要是常规的PCR法，但操作繁琐且容易出现假阳性。本发明的同管检测方法采用Real-timePCR，在血清学变化之前即可检测是否有HTLV感染，大幅度缩短了窗口期，同时相对于常规的血清学检测和PCR法具有检测周期短，特异性高，准确度高，灵敏度高，条件依赖少，污染风险低等优点。检测结果将有助于临床筛选，监测患者HTLV前病毒载量的变化及限制HTLV病毒的传播。
附图说明
图1是同管real-timePCR检测体系扩增产生的两种标准曲线（质粒梯度为10、102、103、104、105、106copies/ul），其中HTLV-I标准曲线Slope为-3.41，R2为0.996；HTLV-II标准曲线Slope为-3.35，R2为0.995。根据Slope及R2值说明本发明的同管Real-time体系扩增效果理想，最低下限均可达10copies/ul。
图2是同管real-timePCR检测体系扩增两种10copies/ul质粒的结果。
图3是样本A的同管Real-timePCR检测结果。由于只产生一条扩增曲线，且对应探针SEQNO3，CT值＜38。因此A样本为HTLV-I型。
图4是样本B的同管Real-timePCR检测结果。由于只产生一条扩增曲线，且对应探针SEQNO6，CT值＜38。因此B样本为HTLV-II型。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物和试剂盒
用于检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物，包括检测HTLV-I前病毒的特异性引物（SEQNO1和SEQNO2）及探针（SEQNO3）和检测HTLV-II前病毒的特异性引物（SEQNO4和SEQNO5）及探针（SEQNO6），其中：
(i)检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针：
SEQNO1：CCCATTGGCTCCTGTGAAAG；
SEQNO2：TTGAGACAGCGCCACGAAC；
SEQNO3：JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(ii)检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针：
SEQNO4：TTGCCATACCTGTCAAACCATC；
SEQNO5：CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC；
SEQNO6：FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA。
在同一PCR管中加入上述两种引物及探针，并通过Real-timePCR反应条件对样本进行检测。
用于检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的试剂盒，包括DNA提取试剂、PCR扩增体系，所述PCR扩增体系包括用于检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物，包括检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针和检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针，其中：
(i)检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针：
SEQNO1：CCCATTGGCTCCTGTGAAAG；
SEQNO2：TTGAGACAGCGCCACGAAC；
SEQNO3：JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(ii)检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针：
SEQNO4：TTGCCATACCTGTCAAACCATC；
SEQNO5：CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC；
SEQNO6：FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA
实施例2一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的方法
一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的方法包括：
(1)提取样本中的DNA；
(2)以步骤(1)中的DNA作为模板，在同一PCR管中按合理的浓度比同时加入检测HTLV-I前病毒的引物及探针和检测HTLV-II前病毒的引物及探针，并通过Real-timePCR反应对样本进行检测，其中：
(i)检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针：
SEQNO1：CCCATTGGCTCCTGTGAAAG；
SEQNO2：TTGAGACAGCGCCACGAAC；
SEQNO3：JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(ii)检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针：
SEQNO4：TTGCCATACCTGTCAAACCATC；
SEQNO5：CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC；
SEQNO6：FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA。
(3)根据Real-timePCR结果来分析样本是否感染HTLV病毒。
采用常规的酚-氯仿提取样本血液DNA。
PCR扩增方法如下：
一例样本的总Real-timePCR体系为25ul：包括2*qPCRMIX12.5ul、引物SEQNO1、SEQNO2、SEQNO4、SEQNO5各0.6ul、探针SEQNO3和SEQNO6各0.3ul、灭菌水7.5ul、DNA模板2ul。
Real-timePCR反应程序：95℃5min预变性；95℃15s，59℃35s循环40次。
对样本检测结果分析：若样本产生一条扩增曲线，且CT值≤38，则样本为HTLV阳性，且根据相对应的探针，可判断样本所感染的HTLV基因型；若样本未产生扩增曲线，则判定样本为阴性。
使用该检测方法中的引物及探针（SEQNO1、SEQNO2、SEQNO3、SEQNO4、SEQNO5、SEQNO6）进行样本检测，发现其相比于现有技术具有检测周期短，特异性高，准确度高，重复性好，条件依赖少，污染风险低等优点。同时也可检测出10copies/ulHTLV-I及HTLV-II，说明本方法具有较好的灵敏度。
实施例3：灵敏度测定
分别将重组的HTLV-I质粒和HTLV-II质粒梯度稀释（质粒梯度为10、102、103、104、105、106copies/ul）作为模板，依照本发明所述方法进行Real-timePCR反应。图1是同管real-timePCR检测体系扩增产生的两种标准曲线（质粒梯度为10、102、103、104、105、106copies/ul），其中HTLV-I标准曲线Slope为-3.41，R2为0.996；HTLV-II标准曲线Slope为-3.35，R2为0.995。根据Slope及R2值说明本发明的同管Real-time体系扩增效果理想，最低下限均可达10copies/ul。
图2是同管real-timePCR检测体系扩增两种10copies/ulHTLV-I质粒和HTLV-II质粒的结果。
实施例4：临床样本检测
取2份临床标本A和B，经本发明所述方法完成Real-timePCR检测，检测结果如图3和4所示。
图3是样本A的同管Real-timePCR检测结果。由于只产生一条扩增曲线，且对应探针SEQNO3，CT值＜38。因此A样本为HTLV-I型。
图4是样本B的同管Real-timePCR检测结果。由于只产生一条扩增曲线，且对应探针SEQNO6，CT值＜38。因此B样本为HTLV-II型。
利用本发明所述方法检测临床样本A和B的结果与ELISA试剂盒比较，两种方法的结果完全一样。
SEQUENCELISTING
<110>上海艾迪康医学检验所有限公司
<120>一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物和方法
<130>
<160>6
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cccattggctcctgtgaaag20
<210>2
<211>19
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<213>人工序列
<400>2
ttgagacagcgccacgaac19
<210>3
<211>25
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tctcggacttttgcatggcctctcc25
<210>4
<211>22
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<210>5
<211>22
<212>DNA
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<400>5
ctgaagaacggcgctgatagtc22
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cttctccggtgcggtttccgtct23

Claims (4)

1.一种用于检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物，包括检测HTLV-I前病毒的特异性引物SEQNO1和SEQNO2及探针SEQNO3和检测HTLV-II前病毒的特异性引物SEQNO4和SEQNO5及探针SEQNO6，其中：
(i)检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针：
SEQNO1：CCCATTGGCTCCTGTGAAAG；
SEQNO2：TTGAGACAGCGCCACGAAC；
SEQNO3：JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(ii)检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针：
SEQNO4：TTGCCATACCTGTCAAACCATC；
SEQNO5：CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC；
SEQNO6：FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，在同一PCR管同时加入检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物及探针，并通过Real-timePCR反应对样本进行检测。
3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，在总反应体积为25ul时，引物和探针的使用量为：引物SEQNO1、SEQNO2、SEQNO4、SEQNO5各0.6ul、探针SEQNO3和SEQNO6各0.3ul。
4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述的引物参与的反应程序为95℃5min预变性；95℃15s，59℃35s循环40次。
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