CN108203738A - 一种用于检测人嗜t淋巴细胞病毒1型的试剂盒 - Google Patents
一种用于检测人嗜t淋巴细胞病毒1型的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108203738A CN108203738A CN201810249808.1A CN201810249808A CN108203738A CN 108203738 A CN108203738 A CN 108203738A CN 201810249808 A CN201810249808 A CN 201810249808A CN 108203738 A CN108203738 A CN 108203738A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- human
- type
- lymphotropic virus
- cell lymphotropic
- reaction solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒,包括由红细胞裂解液、反应液1、反应液2、阴性质控品和阳性质控品构成的反应体系;所述反应液1中包括根据人嗜T淋巴细胞病毒1型gap区的特异性设计的2条特异性引物和1条特异性探针,依据人基因组β珠蛋白的特异性设计的2条引物和1条特异性探针。本发明试剂盒利用聚合酶链式反应技术,能在较短的时间内定性检测人嗜T淋巴细胞病毒1型;灵敏度高,最低检出限为100 Copies/ml;特异性好,本发明根据gap区基因序列设计1对引物,与其他病原体无交叉干扰,具有较高的特异性。本发明对于人嗜T淋巴细胞病毒1型的输血诊断与临床检测具有较高的参考价值,适于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,尤其是涉及一种用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒。
背景技术
人嗜T淋巴细胞病毒1型与多种疾病有关,主要与成人T细胞白血病有密切关系,其传播途径主要是输血、性传播、静脉吸毒和家庭内传播,广泛分布与全世界,主要流行于日本西南部、加勒比海地区、非洲中部和中国东南沿海,严重威胁公共卫生安全。目前对人嗜T淋巴细胞病毒1型的检测主要采用传统的酶联免疫吸附法、明胶颗粒凝集法和间接荧光法,存在窗口期长、操作繁琐、假阳性和假阴性等问题。PCR技术由于其灵敏度高、特异性好和操作简便等优点,已经越来越广泛的应用于病毒检测,但目前尚未有将PCR技术应用于人嗜T淋巴细胞病毒1型检测方面。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用PCR技术检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒。
为实现上述目的,本发明可采取下述技术方案:
本发明所述的用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒,包括由红细胞裂解液、反应液1、反应液2、阴性质控品和阳性质控品构成的反应体系;所述反应液1中包括根据人嗜T淋巴细胞病毒1型gap区的特异性设计的2条特异性引物和1条特异性探针,依据人基因组β珠蛋白的特异性设计的2条引物和1条特异性探针:
引物1:5’- AGCCTTACCACACCTTCGTAG -3’(SEQ ID No.1);
引物2:5’- TGGCATTCTTTGTTTGCATTGGAG -3’(SEQ ID No.2);
引物3:5’- TGGAACATATTTGACGGCTTT -3’(SEQ ID No.3);
引物4:5’- GATCTTAGCTACTACTGCCAA -3’(SEQ ID No.4);
探针1:FAM- ACGTAGCCCTTGACAACGGACT –BHQ1(SEQ ID No.5);
探针2:ROX- AAACCCACTGCATCACTCT –BHQ2(SEQ ID No.6)。
所述反应液2中含有20~30mM MgCl2和0.09%叠氮化钠。
所述阴性质控品中仅含人β珠蛋白基因质粒;所述阳性质控品中含有人嗜T淋巴细胞病毒1型RNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒。
所述红细胞裂解液中包含0.1~0.2M NH4Cl,0.1~0.2mM EDTA和10~20mM NaHCO3。
本发明的优点在于利用聚合酶链式反应技术,在50℃ 2min,94℃ 2min,(94℃5s, 55℃ 30s)40循环扩增条件下,使用实时荧光定量PCR仪进行荧光检测,依据Ct值对人嗜T淋巴细胞病毒1型进行定性检测,使用内部对照(β珠蛋白)、阴性质控品和阳性质控品对检测结果进行监控。
使用本发明试剂盒,能在较短的时间内定性检测人嗜T淋巴细胞病毒1型;灵敏度高,最低检出限为100 Copies/ml;特异性好,本发明根据gap区基因序列设计1对引物,与其他病原体无交叉干扰,具有较高的特异性。本发明对于人嗜T淋巴细胞病毒1型的输血诊断与临床检测具有较高的参考价值,适于推广应用。
附图说明
图1是采用本发明试剂盒对20份最低检出限样本进行检测的扩增曲线图。
具体实施方式
实施例1 试剂盒反应体系(聚合酶链式反应)的准备:
1、红细胞裂解液:H2O 200ul,其中包含0.1~0.2M NH4Cl,0.1~0.2mM EDTA和10~20mMNaHCO3。
2、反应液1:pH8.0的 0.1M Tris-HCl 30ul,其中包括4pmol/µl引物1、4 pmol/µl引物2、4pmol/µl引物3、4 pmol/µl引物4、1 pmol/µl探针1、1 pmol/µl探针2、10U Taq酶、5UMMLV、0.1U UNG和10×PCR反应缓冲液,四条引物及两条探针分别为:
引物1:5’- AGCCTTACCACACCTTCGTAG -3’(SEQ ID No.1);
引物2:5’- TGGCATTCTTTGTTTGCATTGGAG -3’(SEQ ID No.2);
引物3:5’- TGGAACATATTTGACGGCTTT -3’(SEQ ID No.3);
引物4:5’- GATCTTAGCTACTACTGCCAA -3’(SEQ ID No.4);
探针1:FAM- ACGTAGCCCTTGACAACGGACT –BHQ1(SEQ ID No.5);
探针2:ROX- AAACCCACTGCATCACTCT –BHQ2(SEQ ID No.6)。
3、反应液2:H2O 10ul,其中包含20~30mM MgCl2和0.09%叠氮化钠。
4、阴性质控品:TE 50ul,含人β珠蛋白基因质粒,浓度为103 Copies/ml。
5、阳性质控品:TE 50ul,含人嗜T淋巴细胞病毒1型RNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒,浓度均为103 Copies/ml。
实施例2 用实施例1的反应体系按以下方法对人嗜T淋巴细胞病毒1型进行定性检测
待测样品为含有100copies/ml人嗜T淋巴细胞病毒1型的人全血样本,当然,也可以为其他可能含有人嗜T淋巴细胞病毒1型的样本类型。
1、全血前处理
将全血样本与红细胞裂解液以1:3的体积比加入离心管中混合,上下颠倒混匀10次后,12000r/min离心5min;去上清,用1ml的生理盐水重悬沉淀。
2、模板RNA提取(可使用商用提取试剂盒提取模板RNA,以备后续PCR反应使用,如可使用芯超生物--全血基因组DNA/RNA提取试剂盒):
1)添加10ul磁珠混悬液到上述处理后的待检样本中(磁珠混悬液的基础液是H2O,包含直径为0.5nm~1nm的超纯磁性氧化硅纳米磁珠);
2)再添加1ml裂解液到待检样本中,室温裂解3min(裂解液的基础液是H2O,包含3~5M的异硫氰酸胍和0.5%的Tween-20);
3)使用磁板对待检样本靠磁30s,去上清液;
4)在上述离心管中添加2ml洗液A,吹打混匀(洗液A的基础液是H2O,包含1~3M的高氯酸钠,0.1~0.5M 乙酸钾和25%的乙醇);
5)使用磁板对待检样本靠磁30s,去上清液;
6)上述离心管中添加2ml洗液B,吹打混匀(洗液B的基础液是H2O,包含70~85%的乙醇);
7)使用磁板对待检样本靠磁30s,去上清液;
8)在离心管中添加0.2ml洗脱液,吹打混匀(洗脱液:pH8.0 TE);
9)70℃解离后靠磁取出上清液备用。
3、聚合酶链式反应:在100µl PCR管配制反应体系:PCR反应液1 10µl,PCR反应液210µl,模板RNA 20~50µl(阴阳性质控按照模板加样量直接添加),将上述反应管于50℃2min,94℃ 2min,(94℃ 5s, 55℃ 30s)40循环扩增条件下反应。
4、结果判定:阴性质控品应ROX显示Ct值≤40,FAM显示No Ct;阳性质控品应ROX显示Ct值≤40,FAM显示Ct值≤35。在以上2个条件下,仪器ROX显示Ct值≤40,FAM显示No Ct表示待检样品为阴性;仪器ROX显示Ct值≤40,FAM显示Ct值≤45表示待检样品为阴性。
按照上述方法对20份最低检出限样本进行检测,得到的扩增曲线如图1所示,数据如表1所示:
结论:采用本发明试剂盒对上述20例100 Copies/ml的阳性临床样本进行检测,结果均为阳性,证明本发明试剂盒的检测限可以达到100 Copies/ml。
Claims (4)
1.一种用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒,其特征在于:包括由红细胞裂解液、反应液1、反应液2、阴性质控品和阳性质控品构成的反应体系;所述反应液1中包括根据人嗜T淋巴细胞病毒1型gap区的特异性设计的2条特异性引物和1条特异性探针,依据人基因组β珠蛋白的特异性设计的2条引物和1条特异性探针:
引物1:5’- AGCCTTACCACACCTTCGTAG -3’;
引物2:5’- TGGCATTCTTTGTTTGCATTGGAG -3’;
引物3:5’- TGGAACATATTTGACGGCTTT -3’;
引物4:5’- GATCTTAGCTACTACTGCCAA -3’;
探针1:FAM- ACGTAGCCCTTGACAACGGACT –BHQ1;
探针2:ROX- AAACCCACTGCATCACTCT –BHQ2。
2.根据权利要求1所述的用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒,其特征在于:所述反应液2中含有20~30mM MgCl2和0.09%叠氮化钠。
3.根据权利要求1所述的用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒,其特征在于:所述阴性质控品中仅含人β珠蛋白基因质粒;所述阳性质控品中含有人嗜T淋巴细胞病毒1型RNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒。
4.根据权利要求1所述的用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒,其特征在于:所述红细胞裂解液中包含0.1~0.2M NH4Cl,0.1~0.2mM EDTA和10~20mM NaHCO3。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810249808.1A CN108203738A (zh) | 2018-03-26 | 2018-03-26 | 一种用于检测人嗜t淋巴细胞病毒1型的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810249808.1A CN108203738A (zh) | 2018-03-26 | 2018-03-26 | 一种用于检测人嗜t淋巴细胞病毒1型的试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108203738A true CN108203738A (zh) | 2018-06-26 |
Family
ID=62606856
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810249808.1A Pending CN108203738A (zh) | 2018-03-26 | 2018-03-26 | 一种用于检测人嗜t淋巴细胞病毒1型的试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108203738A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109022619A (zh) * | 2018-08-27 | 2018-12-18 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种用于检测人类疱疹病毒4型的试剂盒 |
CN110894534A (zh) * | 2019-12-23 | 2020-03-20 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种检测生殖支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103898239A (zh) * | 2014-03-10 | 2014-07-02 | 上海艾迪康医学检验所有限公司 | 一种同管检测htlv-i和htlv-ii前病毒的引物和方法 |
JP2015058004A (ja) * | 2013-09-20 | 2015-03-30 | 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | Htlv−1プロウイルス検出のためのプライマーセット、及びそれを用いた検出方法 |
WO2016054708A1 (pt) * | 2014-10-06 | 2016-04-14 | Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto | Oligonucleotídeos, conjunto de oligonucleotídeos, kit para diagnóstico e discriminação de infecção por htlv-1/2, polinucleotídeo adequado para uso como alvo de referência para o desenho de iniciadores e sondas para detecção e diferenciação de htlv-1 e htlv- 2, amplicon, e, método para detecção de pelo menos um alvo de htlv |
-
2018
- 2018-03-26 CN CN201810249808.1A patent/CN108203738A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015058004A (ja) * | 2013-09-20 | 2015-03-30 | 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | Htlv−1プロウイルス検出のためのプライマーセット、及びそれを用いた検出方法 |
CN103898239A (zh) * | 2014-03-10 | 2014-07-02 | 上海艾迪康医学检验所有限公司 | 一种同管检测htlv-i和htlv-ii前病毒的引物和方法 |
WO2016054708A1 (pt) * | 2014-10-06 | 2016-04-14 | Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto | Oligonucleotídeos, conjunto de oligonucleotídeos, kit para diagnóstico e discriminação de infecção por htlv-1/2, polinucleotídeo adequado para uso como alvo de referência para o desenho de iniciadores e sondas para detecção e diferenciação de htlv-1 e htlv- 2, amplicon, e, método para detecção de pelo menos um alvo de htlv |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
AXELLE DEHEE ET AL.: ""Quantitation of HTLV-I proviral load by a TaqMan real-time PCR assay"", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 * |
KM WILSON ET AL.: ""DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A HUMAN T-CELL LYMPHOTROPIC VIRUS TYPE-1 PROVIRAL LOAD ASSAY"", 《SEX TRANSM INFECT》 * |
李自刚等: "《生物检测技术》", 31 August 2016, 中国轻工业出版社 * |
白松涛等: ""人类嗜 T 淋巴细胞病毒Ⅰ型的PCR检测方法研究"", 《中国卫生检验杂志》 * |
白松涛等: ""人类嗜 T 淋巴细胞病毒I型的PCR检测方法研究"", 《现代预防医学》 * |
霍利: "《流式细胞术操作规程》", 30 November 2012, 人民军医出版社 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109022619A (zh) * | 2018-08-27 | 2018-12-18 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种用于检测人类疱疹病毒4型的试剂盒 |
CN110894534A (zh) * | 2019-12-23 | 2020-03-20 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种检测生殖支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sharma et al. | COVID-19 diagnosis: current and future techniques | |
CN108411036A (zh) | 一种快速检测甲、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及方法 | |
WO2021175298A1 (zh) | 新冠病毒检测的试剂以及检测方法 | |
CN105695631B (zh) | 人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒快速联检试剂盒及其制备和应用 | |
CN111549184B (zh) | 一种呼吸道腺病毒的pcr荧光检测试剂盒及其应用 | |
CN107557496A (zh) | 一种用于检测MERS‑CoV病毒的荧光RT‑RAA引物、探针及检测方法 | |
CN111286559B (zh) | 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒 | |
CN108624720A (zh) | Raa荧光法检测裂谷热病毒的引物探针组及试剂盒 | |
CN109517927A (zh) | 一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用 | |
CN101712973A (zh) | 常温核酸扩增链替换反应试剂及常温核酸扩增方法 | |
TWI362419B (en) | Nucleic acid detection | |
CN108203738A (zh) | 一种用于检测人嗜t淋巴细胞病毒1型的试剂盒 | |
CN110894534A (zh) | 一种检测生殖支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法 | |
CN112301159A (zh) | 一种快速检测乙型流感病毒的rda方法及试剂盒 | |
CN107574262A (zh) | 一种用于检测甲型h1n1病毒的荧光rt‑raa引物、探针及检测方法 | |
CN108239676A (zh) | 一种副流感病毒一步法荧光分型rt-pcr检测试剂盒 | |
CN101812538B (zh) | 一种检测肠道病毒71型的荧光定量rt-pcr试剂盒 | |
CN102071247B (zh) | 一种区分非嗜肺与嗜肺军团菌的检测方法及试剂盒 | |
CN110607381B (zh) | 一种结核分枝杆菌检测试剂盒及方法 | |
CN104561375A (zh) | 一种新布尼亚病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法 | |
CN112458201A (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒的荧光rt-rpa引物、探针及检测方法 | |
CN111172301A (zh) | 一种艰难梭菌毒素b的pcr荧光检测试剂盒及其应用 | |
WO2022156073A1 (zh) | 一种rap基因检测试剂盒、检测方法和应用及rap病毒检测试剂盒 | |
CN108060216A (zh) | 基于一步巢式qPCR法或一步巢式PCR法检测病毒用锁核酸引物及检测试剂盒 | |
CN111206117A (zh) | 一种检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180626 |