CN108203738A - 一种用于检测人嗜t淋巴细胞病毒1型的试剂盒 - Google Patents

一种用于检测人嗜t淋巴细胞病毒1型的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN108203738A
CN108203738A CN201810249808.1A CN201810249808A CN108203738A CN 108203738 A CN108203738 A CN 108203738A CN 201810249808 A CN201810249808 A CN 201810249808A CN 108203738 A CN108203738 A CN 108203738A
Authority
CN
China
Prior art keywords
human
type
lymphotropic virus
cell lymphotropic
reaction solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810249808.1A
Other languages
English (en)
Inventor
安顺
李乾
王少鑫
李振红
杜美
鲁清月
付光宇
吴学炜
苗拥军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Autobio Diagnostics Co Ltd
Original Assignee
Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Autobio Diagnostics Co Ltd filed Critical Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority to CN201810249808.1A priority Critical patent/CN108203738A/zh
Publication of CN108203738A publication Critical patent/CN108203738A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒，包括由红细胞裂解液、反应液1、反应液2、阴性质控品和阳性质控品构成的反应体系；所述反应液1中包括根据人嗜T淋巴细胞病毒1型gap区的特异性设计的2条特异性引物和1条特异性探针，依据人基因组β珠蛋白的特异性设计的2条引物和1条特异性探针。本发明试剂盒利用聚合酶链式反应技术，能在较短的时间内定性检测人嗜T淋巴细胞病毒1型；灵敏度高，最低检出限为100 Copies/ml；特异性好，本发明根据gap区基因序列设计1对引物，与其他病原体无交叉干扰，具有较高的特异性。本发明对于人嗜T淋巴细胞病毒1型的输血诊断与临床检测具有较高的参考价值，适于推广应用。

Description

一种用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒。
背景技术
人嗜T淋巴细胞病毒1型与多种疾病有关，主要与成人T细胞白血病有密切关系，其传播途径主要是输血、性传播、静脉吸毒和家庭内传播，广泛分布与全世界，主要流行于日本西南部、加勒比海地区、非洲中部和中国东南沿海，严重威胁公共卫生安全。目前对人嗜T淋巴细胞病毒1型的检测主要采用传统的酶联免疫吸附法、明胶颗粒凝集法和间接荧光法，存在窗口期长、操作繁琐、假阳性和假阴性等问题。PCR技术由于其灵敏度高、特异性好和操作简便等优点，已经越来越广泛的应用于病毒检测，但目前尚未有将PCR技术应用于人嗜T淋巴细胞病毒1型检测方面。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用PCR技术检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒，包括由红细胞裂解液、反应液1、反应液2、阴性质控品和阳性质控品构成的反应体系；所述反应液1中包括根据人嗜T淋巴细胞病毒1型gap区的特异性设计的2条特异性引物和1条特异性探针，依据人基因组β珠蛋白的特异性设计的2条引物和1条特异性探针：
引物1：5’- AGCCTTACCACACCTTCGTAG -3’（SEQ ID No.1）；
引物2：5’- TGGCATTCTTTGTTTGCATTGGAG -3’（SEQ ID No.2）；
引物3：5’- TGGAACATATTTGACGGCTTT -3’（SEQ ID No.3）；
引物4：5’- GATCTTAGCTACTACTGCCAA -3’（SEQ ID No.4）；
探针1：FAM- ACGTAGCCCTTGACAACGGACT –BHQ1（SEQ ID No.5）；
探针2：ROX- AAACCCACTGCATCACTCT –BHQ2（SEQ ID No.6）。
所述反应液2中含有20~30mM MgCl2和0.09%叠氮化钠。
所述阴性质控品中仅含人β珠蛋白基因质粒；所述阳性质控品中含有人嗜T淋巴细胞病毒1型RNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒。
所述红细胞裂解液中包含0.1~0.2M NH4Cl，0.1~0.2mM EDTA和10~20mM NaHCO3。
本发明的优点在于利用聚合酶链式反应技术，在50℃ 2min，94℃ 2min，（94℃5s， 55℃ 30s）40循环扩增条件下，使用实时荧光定量PCR仪进行荧光检测，依据Ct值对人嗜T淋巴细胞病毒1型进行定性检测，使用内部对照（β珠蛋白）、阴性质控品和阳性质控品对检测结果进行监控。
使用本发明试剂盒，能在较短的时间内定性检测人嗜T淋巴细胞病毒1型；灵敏度高，最低检出限为100 Copies/ml；特异性好，本发明根据gap区基因序列设计1对引物，与其他病原体无交叉干扰，具有较高的特异性。本发明对于人嗜T淋巴细胞病毒1型的输血诊断与临床检测具有较高的参考价值，适于推广应用。
附图说明
图1是采用本发明试剂盒对20份最低检出限样本进行检测的扩增曲线图。
具体实施方式
实施例1 试剂盒反应体系（聚合酶链式反应）的准备：
1、红细胞裂解液：H2O 200ul，其中包含0.1~0.2M NH4Cl，0.1~0.2mM EDTA和10~20mMNaHCO3。
2、反应液1：pH8.0的 0.1M Tris-HCl 30ul，其中包括4pmol/µl引物1、4 pmol/µl引物2、4pmol/µl引物3、4 pmol/µl引物4、1 pmol/µl探针1、1 pmol/µl探针2、10U Taq酶、5UMMLV、0.1U UNG和10×PCR反应缓冲液，四条引物及两条探针分别为：
引物1：5’- AGCCTTACCACACCTTCGTAG -3’（SEQ ID No.1）；
引物2：5’- TGGCATTCTTTGTTTGCATTGGAG -3’（SEQ ID No.2）；
引物3：5’- TGGAACATATTTGACGGCTTT -3’（SEQ ID No.3）；
引物4：5’- GATCTTAGCTACTACTGCCAA -3’（SEQ ID No.4）；
探针1：FAM- ACGTAGCCCTTGACAACGGACT –BHQ1（SEQ ID No.5）；
探针2：ROX- AAACCCACTGCATCACTCT –BHQ2（SEQ ID No.6）。
3、反应液2：H2O 10ul，其中包含20~30mM MgCl2和0.09%叠氮化钠。
4、阴性质控品：TE 50ul，含人β珠蛋白基因质粒，浓度为103 Copies/ml。
5、阳性质控品：TE 50ul，含人嗜T淋巴细胞病毒1型RNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒，浓度均为103 Copies/ml。
实施例2 用实施例1的反应体系按以下方法对人嗜T淋巴细胞病毒1型进行定性检测
待测样品为含有100copies/ml人嗜T淋巴细胞病毒1型的人全血样本，当然，也可以为其他可能含有人嗜T淋巴细胞病毒1型的样本类型。
1、全血前处理
将全血样本与红细胞裂解液以1:3的体积比加入离心管中混合，上下颠倒混匀10次后，12000r/min离心5min；去上清，用1ml的生理盐水重悬沉淀。
2、模板RNA提取（可使用商用提取试剂盒提取模板RNA，以备后续PCR反应使用，如可使用芯超生物--全血基因组DNA/RNA提取试剂盒）：
1）添加10ul磁珠混悬液到上述处理后的待检样本中（磁珠混悬液的基础液是H2O，包含直径为0.5nm~1nm的超纯磁性氧化硅纳米磁珠）；
2）再添加1ml裂解液到待检样本中，室温裂解3min（裂解液的基础液是H2O，包含3~5M的异硫氰酸胍和0.5%的Tween-20）；
3）使用磁板对待检样本靠磁30s，去上清液；
4）在上述离心管中添加2ml洗液A，吹打混匀（洗液A的基础液是H2O，包含1~3M的高氯酸钠，0.1~0.5M 乙酸钾和25%的乙醇）；
5）使用磁板对待检样本靠磁30s，去上清液；
6）上述离心管中添加2ml洗液B，吹打混匀（洗液B的基础液是H2O，包含70~85%的乙醇）；
7）使用磁板对待检样本靠磁30s，去上清液；
8）在离心管中添加0.2ml洗脱液，吹打混匀（洗脱液：pH8.0 TE）；
9）70℃解离后靠磁取出上清液备用。
3、聚合酶链式反应：在100µl PCR管配制反应体系：PCR反应液1 10µl，PCR反应液210µl，模板RNA 20~50µl（阴阳性质控按照模板加样量直接添加），将上述反应管于50℃2min，94℃ 2min，（94℃ 5s， 55℃ 30s）40循环扩增条件下反应。
4、结果判定：阴性质控品应ROX显示Ct值≤40，FAM显示No Ct；阳性质控品应ROX显示Ct值≤40，FAM显示Ct值≤35。在以上2个条件下，仪器ROX显示Ct值≤40，FAM显示No Ct表示待检样品为阴性；仪器ROX显示Ct值≤40，FAM显示Ct值≤45表示待检样品为阴性。
按照上述方法对20份最低检出限样本进行检测，得到的扩增曲线如图1所示，数据如表1所示：
结论：采用本发明试剂盒对上述20例100 Copies/ml的阳性临床样本进行检测，结果均为阳性，证明本发明试剂盒的检测限可以达到100 Copies/ml。

Claims (4)

1.一种用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒，其特征在于：包括由红细胞裂解液、反应液1、反应液2、阴性质控品和阳性质控品构成的反应体系；所述反应液1中包括根据人嗜T淋巴细胞病毒1型gap区的特异性设计的2条特异性引物和1条特异性探针，依据人基因组β珠蛋白的特异性设计的2条引物和1条特异性探针：
引物1：5’- AGCCTTACCACACCTTCGTAG -3’；
引物2：5’- TGGCATTCTTTGTTTGCATTGGAG -3’；
引物3：5’- TGGAACATATTTGACGGCTTT -3’；
引物4：5’- GATCTTAGCTACTACTGCCAA -3’；
探针1：FAM- ACGTAGCCCTTGACAACGGACT –BHQ1；
探针2：ROX- AAACCCACTGCATCACTCT –BHQ2。
2.根据权利要求1所述的用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒，其特征在于：所述反应液2中含有20~30mM MgCl2和0.09%叠氮化钠。
3.根据权利要求1所述的用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒，其特征在于：所述阴性质控品中仅含人β珠蛋白基因质粒；所述阳性质控品中含有人嗜T淋巴细胞病毒1型RNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒。
4.根据权利要求1所述的用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒，其特征在于：所述红细胞裂解液中包含0.1~0.2M NH4Cl，0.1~0.2mM EDTA和10~20mM NaHCO3。
CN201810249808.1A 2018-03-26 2018-03-26 一种用于检测人嗜t淋巴细胞病毒1型的试剂盒 Pending CN108203738A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810249808.1A CN108203738A (zh) 2018-03-26 2018-03-26 一种用于检测人嗜t淋巴细胞病毒1型的试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810249808.1A CN108203738A (zh) 2018-03-26 2018-03-26 一种用于检测人嗜t淋巴细胞病毒1型的试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108203738A true CN108203738A (zh) 2018-06-26

Family

ID=62606856

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810249808.1A Pending CN108203738A (zh) 2018-03-26 2018-03-26 一种用于检测人嗜t淋巴细胞病毒1型的试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108203738A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109022619A (zh) * 2018-08-27 2018-12-18 郑州安图生物工程股份有限公司 一种用于检测人类疱疹病毒4型的试剂盒
CN110894534A (zh) * 2019-12-23 2020-03-20 郑州安图生物工程股份有限公司 一种检测生殖支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103898239A (zh) * 2014-03-10 2014-07-02 上海艾迪康医学检验所有限公司 一种同管检测htlv-i和htlv-ii前病毒的引物和方法
JP2015058004A (ja) * 2013-09-20 2015-03-30 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 Ｈｔｌｖ−１プロウイルス検出のためのプライマーセット、及びそれを用いた検出方法
WO2016054708A1 (pt) * 2014-10-06 2016-04-14 Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto Oligonucleotídeos, conjunto de oligonucleotídeos, kit para diagnóstico e discriminação de infecção por htlv-1/2, polinucleotídeo adequado para uso como alvo de referência para o desenho de iniciadores e sondas para detecção e diferenciação de htlv-1 e htlv- 2, amplicon, e, método para detecção de pelo menos um alvo de htlv

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015058004A (ja) * 2013-09-20 2015-03-30 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 Ｈｔｌｖ−１プロウイルス検出のためのプライマーセット、及びそれを用いた検出方法
CN103898239A (zh) * 2014-03-10 2014-07-02 上海艾迪康医学检验所有限公司 一种同管检测htlv-i和htlv-ii前病毒的引物和方法
WO2016054708A1 (pt) * 2014-10-06 2016-04-14 Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto Oligonucleotídeos, conjunto de oligonucleotídeos, kit para diagnóstico e discriminação de infecção por htlv-1/2, polinucleotídeo adequado para uso como alvo de referência para o desenho de iniciadores e sondas para detecção e diferenciação de htlv-1 e htlv- 2, amplicon, e, método para detecção de pelo menos um alvo de htlv

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AXELLE DEHEE ET AL.: ""Quantitation of HTLV-I proviral load by a TaqMan real-time PCR assay"", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *
KM WILSON ET AL.: ""DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A HUMAN T-CELL LYMPHOTROPIC VIRUS TYPE-1 PROVIRAL LOAD ASSAY"", 《SEX TRANSM INFECT》 *
李自刚等: "《生物检测技术》", 31 August 2016, 中国轻工业出版社 *
白松涛等: ""人类嗜 T 淋巴细胞病毒Ⅰ型的PCR检测方法研究"", 《中国卫生检验杂志》 *
白松涛等: ""人类嗜 T 淋巴细胞病毒I型的PCR检测方法研究"", 《现代预防医学》 *
霍利: "《流式细胞术操作规程》", 30 November 2012, 人民军医出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109022619A (zh) * 2018-08-27 2018-12-18 郑州安图生物工程股份有限公司 一种用于检测人类疱疹病毒4型的试剂盒
CN110894534A (zh) * 2019-12-23 2020-03-20 郑州安图生物工程股份有限公司 一种检测生殖支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sharma et al. COVID-19 diagnosis: current and future techniques
WO2021175298A1 (zh) 新冠病毒检测的试剂以及检测方法
CN105695631B (zh) 人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒快速联检试剂盒及其制备和应用
CN111549184B (zh) 一种呼吸道腺病毒的pcr荧光检测试剂盒及其应用
CN107557496A (zh) 一种用于检测MERS‑CoV病毒的荧光RT‑RAA引物、探针及检测方法
CN111286559B (zh) 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒
CN108624720A (zh) Raa荧光法检测裂谷热病毒的引物探针组及试剂盒
CN109517927A (zh) 一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用
CN101712973A (zh) 常温核酸扩增链替换反应试剂及常温核酸扩增方法
CN108203738A (zh) 一种用于检测人嗜t淋巴细胞病毒1型的试剂盒
CN110894534A (zh) 一种检测生殖支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法
CN106636454A (zh) 一种同时检测人冠状病毒229e，oc43，nl63和hku1的实时荧光多重rt-pcr方法
CN107574262A (zh) 一种用于检测甲型h1n1病毒的荧光rt‑raa引物、探针及检测方法
TWI362419B (en) Nucleic acid detection
CN108239676A (zh) 一种副流感病毒一步法荧光分型rt-pcr检测试剂盒
CN101812538B (zh) 一种检测肠道病毒71型的荧光定量rt-pcr试剂盒
CN102071247B (zh) 一种区分非嗜肺与嗜肺军团菌的检测方法及试剂盒
CN104561375A (zh) 一种新布尼亚病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
CN112458201A (zh) 一种用于检测新型冠状病毒的荧光rt-rpa引物、探针及检测方法
CN112301159A (zh) 一种快速检测乙型流感病毒的rda方法及试剂盒
CN111172301A (zh) 一种艰难梭菌毒素b的pcr荧光检测试剂盒及其应用
CN110607381A (zh) 一种结核分枝杆菌检测试剂盒及方法
WO2022156073A1 (zh) 一种rap基因检测试剂盒、检测方法和应用及rap病毒检测试剂盒
CN108060216A (zh) 基于一步巢式qPCR法或一步巢式PCR法检测病毒用锁核酸引物及检测试剂盒
Luan et al. A CRISPR/Cas12a-assisted rapid detection platform by biosensing the apxIVA of Actinobacillus pleuropneumoniae

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180626