JP2015058004A - Ｈｔｌｖ−１プロウイルス検出のためのプライマーセット、及びそれを用いた検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】従前の検査方法を改善し、単独で、あるいは、従前の１次〜３次スクリーニング検査後に、迅速かつ高感度・高精度な検出・判定が可能で、欠失型変異にも対応可能な、利便性の高い、ＨＴＬＶ−１プロウイルス検出用プライマーセットとそれを用いた高精度ＰＣＲ検出法を提供する。【解決手段】第１の態様は、特定の標的結合配列のうち、少なくともある特定の標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を有する配列を含む、オリゴヌクレオチドである。第２の実施態様は、上記オリゴヌクレオチドを有するプライマーを含む、ＨＴＬＶ−１プロウイルスを検出するためのキットである。該高精度ＰＣＲ検出法は、これら同期的に標的領域を増幅できる複数のプライマーと検出プローブを用いて、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの検出が、迅速に、高感度・高精度で行うことができる。【選択図】図１

Description

本発明は、ＨＴＬＶ−１プロウイルス検出のためのプライマーセットとそれを用いた検出方法に関する。

ＨＴＬＶ−１（Ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ Ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １）は、１９８０年にヒトにおける初めての病原性レトロウイルスとして、Ｇａｌｌｏ Ｒ．博士らにより単離・報告された。このＨＴＬＶ−１関連疾患として有名な成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）は、成人のＴリンパ球が白血病細胞となって皮下、リンパ節、末梢血で異常増殖する白血病で、有効な治療法が無く、極めて予後不良な疾患である。ＨＴＬＶ−１は、その他、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症（ＨＡＭ）、ＨＴＬＶ−１関連ぶどう膜炎（ＨＵ）等の原因ウイルスでもある。

ＨＴＬＶ−１感染者は、全世界で１〜２千万人存在し、日本南西部、パプア・ニューギニアを中心としたオセアニア地域、アフリカ中央部、南アメリカ、カリブ海沿岸地域、ソロモン諸島などに多く見られる。我が国では、九州・沖縄地方を含む南西日本に特に多く見られており、先進国の中で、日本は唯一ＨＴＬＶ−１感染者の多い国である。

このＨＴＬＶ−１感染症はかつて風土病とされていた時期があり、日本での研究は一時激減していたが、最近では、２００８年度〜２０１０年度に厚生労働科学研究班「本邦におけるＨＴＬＶ−１感染及び関連疾患の実態調査と総合対策」（国立感染症研究所）が組織され、全国的なＨＴＬＶ−１キャリア及び関連疾患の実態調査が行われた。その中で、全国の初回献血者中の抗体陽性者の調査から、全国のキャリア数が約１０８万人と推定された。また、以前に比べ、九州・沖縄地方のキャリアの割合が減少してはいたが、他方、関東地方と近畿地方の大都市圏で増加しているとの結果が示され、我が国のＨＴＬＶ−１キャリアは依然として多数存在し、しかも、全国に拡散する傾向のあることが指摘されている。

このＨＴＬＶ−１ウイルスの主な感染経路は、輸血（経静脈感染）、母子感染（垂直感染）、及び、性感染（水平感染）の３つといわれており、最も多い感染経路が母乳による母子感染であることがわかってきたことから、２０１０年１０月に、厚生労働省は、妊婦健康診査の項目の一つに「ＨＴＬＶ−１抗体検査」を追加している。また、献血時でのスクリーニングの重要性も指摘されている。

上記の成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）等、ＨＴＬＶ−１関連疾患は、ＨＴＬＶ−１感染キャリアから発症するのであるが、キャリアの大部分は当初無症状でそのままでは発見は不可能であるため、如何にしてＨＴＬＶ−１感染キャリアを精度良く迅速に検出するかが、これらＡＴＬ等のＨＴＬＶ−１感染症対策に極めて重大な問題で、感染者自体のためにも、また拡大感染を減らし、ＡＴＬ等による死亡者を減らすためにも、ＨＴＬＶ−１感染キャリアを早期に迅速に発見することは重要である。

従来、ＨＴＬＶ−１に対して通常行われる検査のほとんどは血清学的な抗体検査であり、感作粒子凝集法（ＰＡ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、蛍光抗体法（ＩＦ法）、ウエスタンブロット法（ＷＢ法）などが開発されている（非特許文献１）。

日本赤十字（ＪＲＣ）は、輸血によるウイルス感染を防ぎ、献血等による血液製剤の安全性の向上と安定供給に努めており、献血ドナースクリーニングとして、感作粒子凝集法（ＰＡ法）による抗体検査を導入した。それ以後、ＨＴＬＶ−１ウイルスの主な感染経路のひとつである、輸血による感染（経静脈感染）が減少しているといわれているが、血清学的な抗体検査法は、単独で真の抗体陽性者（キャリア）と真の陰性者（未感染者）を確実に識別できる方法では、決してない。

血清学的抗体によるスクリーニング検査によって、輸血による感染が減ったとしても、輸血による感染がゼロになったわけではなく、確実な判断ができずに、「判定保留」、「判定不能」とした検体を輸血に用いないためであって、その様な、「判定保留」等の検体提供者の中に潜在するＨＴＬＶ−１キャリアを発見することはできない。

そこで、近年、ＨＴＬＶ−１キャリアの検出に関して、ＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡの断片をＤＮＡポリメラーゼによって増幅して検出するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法による検査法が注目されている（非特許文献１、２）。

松本千恵子他、Japanese Journal of Transfusion Medicine, 日本, 2001, Vol.47, No.3, p. 378-383 Watanabe et al., Blood, USA, 2005, Vol. 106, No. 7, p. 2462-2471 Miyazaki, et al., Journal of Virology, USA, June 2007, Vol. 81, No. 11, p5714-5723 J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd Edition, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001

しかしながら、ＨＴＬＶ−１キャリアの検出に関して、通常、上記ＪＲＣ等では、ＨＴＬＶ−１プロウイルスのｐＸ領域という比較的配列が安定した領域を標的とする、ｐＸ２プライマー（配列は、非特許文献２等参照）を用いて通常のＰＣＲ検査（従来法）を行っているが、この様な検査法では、判定不能な検体が多く存在し、それらは、結局は、「判定不能」、「判定保留」等とされて結論を出すことができない。また、ｐＸ２以外のプライマーを用いた例があったとしても、個々に研究室レベルで設定されたものであるため、増幅領域の配列が従来のものとオーバーラップしていたり、ＰＣＲ法の設定条件や増幅効率がそれぞれ異なるため、十分に規格化がなされてはいない。

さらに、ｐＸ領域を標的として検出感度を増すための工夫も試行されている（非特許文献１）が、定量性の問題もあり、未だ個々の実験室で独自の手法で行われているため、簡便に利用することができないのが現状である。

一方、ＨＴＬＶ−１キャリアからＡＴＬを発症した患者では、約４０〜６０％という高率で、ＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡの部分欠失（欠失型のウイルス遺伝子変異）が生じていることが報告されており、ＡＴＬの発症とＨＴＬＶ−１プロウイルスの欠失型変異との関連性が強く指摘されているが、上記ＪＲＣ等での一般的なＰＣＲ検査法では、欠失型のウイルス遺伝子変異を検出することは困難で、欠失の有無や詳細を検討するためには、個々に複数の分子生物学的な手法を駆使して、多大な時間やコストをかけて調べなくてはならず、これらの手法は、多くの検体を扱うための検査法としては現実的ではない。

この様な現状から、献血検査・血液検査や集団検診などの際に、従来法では検出不能あるいは検出限界付近の検体でも、真のＨＴＬＶ−１キャリアと真の陰性者（未感染者）を最終的に、より確実に識別できるように、日本赤十字（ＪＲＣ）血液センターで行われている従来の抗体検査や他の検査と組み合わせて行うことができる、あるいは単独でも行いうる、ＨＴＬＶ−１プロウイルス検出法の開発が期待されている。

この発明は、上記課題に鑑みてなされたもので、単独で、あるいは、従前のスクリーニング検査後に、迅速かつ高感度・高精度な検出・判定が可能で、欠失型変異にも対応可能な、利便性の高い、ＨＴＬＶ−１プロウイルス検出用プライマーセットとそれを用いた高精度ＰＣＲ検出法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明に係る第１の実施態様は、配列番号３、４、１５、１６の各標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を有する配列を含む、オリゴヌクレオチドである。
この場合、さらに、配列番号１、２、配列番号５、６、１７〜２０、配列番号２１、２２、配列番号７〜１４の各標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を有する配列のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。

本発明に係る第２の実施態様は、配列番号３、４、１５、１６の各標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を有する配列を含むプライマーを含有する、ＨＴＬＶ−１プロウイルスを検出するためのキットである。
この場合、さらに、配列番号１、２、配列番号５、６、１７〜２０、配列番号２１、２２、配列番号７〜１４の各標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を有する配列を含むプライマーを含有してもよい。
そして、配列番号２３〜３３の配列からなる検出プローブのうち、いずれかの検出プローブをさらに含んでもよい。また、内部コントロールプライマーとその検出プローブをさらに含有してもよい。

本発明に係る第３の実施態様は、臨床サンプル中のＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列の存在を検出する方法であって、前記方法が、
（ａ）第１の実施態様に含まれるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対入りの各ウェル内に前記臨床サンプル由来ＤＮＡを添加して、増幅されたＨＴＬＶ−１プロウイルス核酸生成物を産生する工程、
（ｂ）前記増幅されたＨＴＬＶ−１プロウイルス核酸生成物とＣｔ値を検出する工程、および、
（ｃ）前記Ｃｔ値が基準値内の時に、２ウェル以上の、前記増幅されたＨＴＬＶ−１プロウイルス核酸生成物の検出を指標として、サンプル中のＨＴＬＶ−１プロウイルスの存在の有無を確認する工程、を含む。

本発明に係る第４の実施態様は、臨床サンプル中のＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列の存在を検出するためのシステムであって、
第１の実施態様に含まれるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対入りの各ウェル内に前記臨床サンプル由来ＤＮＡを添加して、増幅されたＨＴＬＶ−１プロウイルス核酸生成物を産生する手段と、
前記増幅された前記ＨＴＬＶ−１プロウイルス核酸生成物とＣｔ値を検出する手段と、
前記Ｃｔ値が基準値内の時に、２ウェル以上の、前記増幅されたＨＴＬＶ−１プロウイルス核酸生成物の検出を指標として、サンプル中のＨＴＬＶ−１プロウイルスの存在の有無を確認する手段と、を有する。

さらに、本発明に係る第５の実施態様は、第３の実施態様である、臨床サンプル中のＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列の存在を検出する方法の、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を実行するように適合されたコンピュータプログラムである。

本発明によれば、選別された複数のプライマー対を用いた高精度ＰＣＲ検出法を使用して、一度に同期的・定量的に標的領域を増幅することにより、従来のＰＣＲ法では判定困難な、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの低コピー数検体や欠失型変異の検体でも、内在するＨＴＬＶ−１プロウイルスの検出を、迅速に、高感度・高精度で行うことができ、容易に判定結果を出すことができる。

本発明のプライマーが標的とする部位の、ＨＴＬＶ−１プロウイルスゲノム上の相対的位置を示す図である。 本実施態様における同期的増幅を示す、マルチプルプライマー法のＰＣＲ増幅曲線を示す図である（正常ＰＢＭＣ（末梢血細胞）に対して０．８％濃度のＴＬ−Ｏｍ１（ＨＴＬＶ−１陽性細胞株）とした場合の抽出ＤＮＡを使用）。 本実施態様における同期的増幅を示す、マルチプルプライマー法のＰＣＲ増幅曲線を示す図である（正常ＰＢＭＣに対して０．０２％濃度のＴＬ−Ｏｍ１とした場合の抽出ＤＮＡを使用）。 本実施態様における同期的増幅を示す、マルチプルプライマー法のＰＣＲ増幅曲線を示す図である（正常ＰＢＭＣ由来のＤＮＡを使用）。 ＨＴＬＶ−１プロウイルスの欠失領域（破線で囲んだ領域）を示す図である。

本発明の種々の目的、利点、および新規な特徴は、添付の図面と組み合わせた以下の詳細な説明から理解されるであろう。

本実施形態に係るＨＴＬＶ−１検出のためのプライマーを含むセットやキット及びそれらを用いたＰＣＲ検出方法は、ＪＲＣ（日本赤十字社）のｐＸ２プライマーで行う従来のＰＣＲ検査法（従来法）では実現されない、迅速かつ高感度・高精度なＨＴＬＶ−１の検出のために提供されるものである。

従来のＰＣＲ法では、検体がＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡ陽性と判定される条件は、ｐＸ２プライマー入りの２つのウェル（Ｗｅｌｌ）が共に陽性となることであり、その場合、２つのウェルが共に、数コピー以上のＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡを含む場合に検出可能であるとされているが、本願のＰＣＲ検出法では、選択された複数のプライマーを用いて一度に同期的・網羅的に多反応を行うことによって、検出感度と特異性の向上が達成され、結果的に、全体の反応ウェル（例えば、最大１２ウェル）のうち、少なくともいずれか２つのウェルが陽性であれば、各陽性ウェル中に数コピー以上のウイルスＤＮＡが含まれているとされ、ＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡ陽性の検体であると判定される。

この様に、本願発明は、ほぼ同じ増幅効率のプライマーセットを用いるためウェル数が増える分だけ感度があがり、さらに、それぞれの標的結合配列が異なるため精度が向上する。

つまり、本願発明は、少なくともいずれか２つのウェルに数コピー以上のウイルスＤＮＡが含まれていれば陽性検体と判定できる方法であって、検出感度と特異性の向上が達成されるため、高感度性を要求される低コピー数検体におけるスクリーニングにも対応可能であり、また、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの欠失型遺伝子変異を有する検体でも、一回の高精度ＰＣＲ検出法の実施で、迅速に、高感度・高精度で検出することができる検査法である。

（用語の説明）
本明細書で使用する用語「標的」、「標的配列」または「標的結合配列」とは、基本的には、増幅および検出されるＨＴＬＶ−１核酸配列をいう。これらには、増幅される本来のＨＴＬＶ−１核酸配列、増幅される本来のＨＴＬＶ−１核酸配列の相補性第二鎖、および増幅反応で産生される本来のＨＴＬＶ−１配列のコピーのどちらかの鎖が含まれる。これらのコピーは、増幅プライマーがアニールする配列のコピーを含有するので、増幅可能な標的として機能する。

本明細書で使用する「プライマー」は、標的結合配列にアニールし、増幅によって伸張されうるオリゴヌクレオチドである。標的結合配列に結合するプライマーの領域は標的結合配列である。

本明細書で使用する「検出用プローブ」は、リアルタイムＰＣＲ専用の検出用プローブで、例えば、５’末端を蛍光物質で、３’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるＴａｑＭａｎプローブ（登録商標、アプライドバイオシステムズ、Ｉｎｃ）等があげられる。ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）は、アニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制され、伸長反応ステップのときに、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発せられる。
その他に、ＲＮＡとＤＮＡからなるキメラプローブとＲＮａｓｅ Ｈの組み合わせによる、サイクリングプローブ等、ＰＣＲ産物の検出用プローブとされるものであれば使用可能である。

本明細書で使用する「検出用試薬」は、増幅産物の生成量を定量的に検出するための試薬で、例えば、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター）を用いて、励起光の照射により発生する蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターすることができる。その他、蛍光染料や励起光照射装置を用いずに、ＰＣＲ増幅産物の生成量を伝導度によって測定する方法等、定量的に検出する他の方法も適用しうることは、当業者であれば理解可能なことである。

以下、本願発明に係るＨＴＬＶ−１検出のためのオリゴヌクレオチド、プライマーキット及びそれらを用いた検出方法の実施の形態を説明する。

（オリゴヌクレオチドプライマー）表１、図１
本実施形態に係るＨＴＬＶ−１検出のためのプライマーは、２００セット以上の新規に設定したプライマーをスクリーニングして最終的に得られたものであり、表１に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーを少なくとも１つ以上含む。

ＨＴＬＶ−１／ＡＴＬＶのプロウイルスは、約９Ｋｂの塩基配列からなり、本実施形態に係る、これらオリゴヌクレオチドプライマーは、標的結合配列が、図１に示される領域にアニールするように設計され、かつ、これらプライマーは、以下のスクリーニングによって、同期的に増幅することが確認されたものである。
このオリゴヌクレオチドプライマーを最終的に選択したスクリーニング方法について、以下に述べる。

（プライマー及びプローブのスクリーニング方法）
２００セットのＦｗｄ−Ｒｅｖオリゴヌクレオチドプライマーを設定した後、下記のＰＣＲ反応でそれぞれのセットが同期的に増幅するか否かＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮ（登録商標）でスクリーニングして、２００セットのうち結果の良好な４０セットを選択し、その後、同じく同時期に増幅する４０セットのＴａｑｍａｎプローブ（登録商標）をスクリーニングして絞り込むことにより、極めて増幅特性の近いプライマー対とプローブのセット、合計１１セットを得ることが出来た。その内訳は、表１にあるように、１０セットが新規の配列を有するプライマー対で、他の１セットが既知のプライマーと同様の配列を有するプライマー対（ｐＸ２）であった。

ＰＣＲ反応は、ポジティブコントロールの細胞であるＴＬ−Ｏｍ１から抽出したＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ量５００ｎｇ／ｗｅｌｌ、ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ １５〜３０μｌで、ＰＣＲ装置Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ ｆａｓｔ（登録商標）を用いて、機器のＦａｓｔプログラムで９５℃ １０分の後、９５℃ ５秒−６０℃ ３０秒のＰＣＲサーマルサイクルを４０サイクル行った。内部コントロール（Ｉ．Ｃ．）としては、Ｓ１９−４０Ｆ、Ｓ１９−４０Ｒ、Ｌ１１−２０Ｆ、Ｌ１１−２０Ｒ、ＲＡＧ１−３２Ｆ、ＲＡＧ１−３２Ｒ、の各プライマー及び検出プローブを用いた（表１）。

なお、ＴＬ−Ｏｍ１細胞は、ＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡが平均１．８個／細胞でゲノムに挿入されていることがＦＩＳＨ解析で明らかにされている細胞である。全塩基配列は決定済みで、Ｅｎｖ遺伝子に９３塩基の欠失があり、ＴＬ−Ｏｍ１の欠失領域は、Ｊ０２０２９ ＡＴＫ−１ ｎｔ．５５４７−６６６９に相当する配列部分である（なお、Ｊ０２０２９はＧｅｎｂａｎｋのＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ登録番号で、配列はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/j02029を参照のこと。）。
また、ネガティブコントロールとしては、市販品のＰＢＭＣ（ヒト末梢血単核球）由来のＤＮＡを使用した。

以上のように、プライマー及び検出プローブの選定を厳密に行ったため、ポジティブコントロールの細胞であるＴＬ−Ｏｍ１から抽出したＤＮＡを鋳型として、上記同定した１１セットのプライマーで増幅した場合、すべてのプライマーのＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）の差が、１サイクル以内に含まれるように設定されている。なお、ＬＴＲは両端にある（２倍）ため、１サイクル手前になる。

（各プライマーとプローブ）
ＨＴＬＶ−１標的結合配列の検出用に選定された新規のプライマーは、それぞれ、配列番号１〜２０として表１に同定されているオリゴヌクレオチド（ＬＴＲ２１５Ｆ、ＬＴＲ２１５Ｒ、０２１Ｆ、０２１Ｒ、０５６Ｆ、０５６Ｒ、０７１Ｆ、０７１Ｒ、０８４Ｆ、０８４Ｒ、０９２Ｆ、０９２Ｒ、１０１Ｆ、１０１Ｒ、１０９Ｆ、１０９Ｒ、１５３Ｆ、１５３Ｒ、１８４Ｆ、１８４Ｒ）からなる、１０対のプライマーを含む。さらに、配列番号２１、２２の既知のオリゴヌクレオチド（ｐＸ２−Ｓ、ｐＸ２−ＡＳ）からなる、１対のプライマーを含んでもよい。

内部コントロール用プライマーは、それぞれ、配列番号３４〜４１として表１に同定されているオリゴヌクレオチド（Ｓ１９−４０Ｆ、Ｓ１９−４０Ｒ、Ｌ１１−２０Ｆ、Ｌ１１−２０Ｒ、ＲＡＧ１−３２Ｆ、ＲＡＧ１−３２Ｒ、ＨＢＢ−１１Ｆ、ＨＢＢ−１１Ｒ）からなる、４対のプライマーを含む。

ここで、奇数の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９のオリゴヌクレオチドからなるプライマーは、左側（「第一」）Ｆプライマーを示し、偶数の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０のオリゴヌクレオチドからなるプライマーは、右側（「第二」）Ｒプライマーを示す。ＨＴＬＶ−１プロウイルスの検出の目的では、所定の左側プライマーおよび右側プライマーの対が反応液中に存在するようにして使用する。
さらに、同期的に増殖可能なプライマーとして厳密に選別したため、必要に応じて、ｌｏｎｇ−ＰＣＲ用のプライマー対として、他のプライマーと組み合わせて使用することも可能である。

また、今回上記の方法で選択された配列番号２１、２２のオリゴヌクレオチドからなるプライマー対は、既知のｐＸ２プライマーと同様の塩基配列を有することが判明したもので、配列番号２１が左側（「第一」）プライマーのｐＸ２−Ｓ、配列番号２２が右側（「第二」）プライマーのｐＸ２−ＡＳで、ＨＴＬＶ−１のｐＸ領域を増幅標的配列とするものである。

なお、便宜のために、ＨＴＬＶ−１検出用の１１のプライマー対を、ＬＴＲ２１５、０５６、０７１、０８４、０９２、１０１、１０９、１５３、１８４、０２１、及びｐＸ２ともいい、内部コントロール用の４のプライマー対を、Ｓ１９−４０、Ｌ１１−２０、ＲＡＧ１−３２、ＨＢＢ−１１ともいう。

これら新規の１０対のプライマー及び既知の１対プライマーに対応する検出プローブは、例えば、Ｔａｑｍａｎプローブ（登録商標）であって、表１に示す配列のもので、配列番号２３〜３３のオリゴヌクレオチドからなり、また、４対の内部コントロール用プライマーに対応する検出プローブは、配列番号４２〜４５のオリゴヌクレオチドからなる。

本発明の実施形態では、同期的に増幅するプライマー群を選別しているため、最大、上記１０対の新規プライマー、１対のｐＸ２プライマー（２ウェル分）、４対の内部コントロールプライマー、及び、各プライマー対に対応する検出プローブを各ウェルに添加することで、ＨＴＬＶ−１プロウイルス検出のためのＰＣＲ反応を、同時に一回で行うことができる。各ウェルの反応液には、１対のプライマーと検出プローブのセットを含む。

（実施例１）ＨＴＬＶ−１含有ゲノムＤＮＡでの増幅の確認
ＨＴＬＶ−１陽性細胞（ＴＬ−Ｏｍ１）を市販の健常人ＰＢＭＣ（ヒト末梢血単核球）で段階希釈して、ＰＢＭＣ中のＴＬ−Ｏｍ１細胞の濃度で、０．８％、０．０２％に希釈したサンプルを準備した。以下、前者を、「ＴＬ−Ｏｍ１ ０．８％」、「ＴＬ−Ｏｍ１ ０．８％希釈率（又は０．８％濃度）」、後者を「ＴＬ−Ｏｍ１ ０．０２％」、「ＴＬ−Ｏｍ１ ０．０２％希釈率（又は０．０２％濃度）」等という。

各希釈率のサンプルからゲノムＤＮＡを抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ ｍｉｎｉ ｏｒ ｍｉｄｉ（登録商標））で精製したものをポジティブコントロール、ＨＴＬＶ−１非感染の３人の健常者の血液から抽出したゲノムＤＮＡをネガティブコントロールとし、それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型として、新規の１０対のプライマー、ｐＸ２プライマー、及び各プライマーに対応するよう設計された各Ｔａｑｍａｎプローブ（登録商標）を用いて、高精度ＰＣＲ検出法を行い、その反応性を検討した。

（高精度ＰＣＲ反応）
ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ量５００ｎｇ／ｗｅｌｌ、ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ ３０μｌで、ＰＣＲ装置Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ ｆａｓｔ（登録商標）を用いて、機器のＦａｓｔプログラムで９５℃ １０分の後、９５℃ ５秒−６０℃ ３０秒のＰＣＲサーマルサイクルを４０サイクル行った。内部コントロール（Ｉ．Ｃ．）として、Ｓ１９−４０、Ｌ１１−２０、ＲＡＧ１−３２の各プライマー及び各検出プローブを用いた（表１、参照）。

各プライマー及び各プローブは、上記したように、同期的に増幅する、極めて性質の近いプライマーとプローブのセットであり、ＴＬ−Ｏｍ１（１００％〜０．８％濃度）由来ＤＮＡを鋳型として標的配列を増幅した場合、すべてのセットにおいて、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値の差は１サイクル以内に含まれるように設定されている。上記条件下で、本高精度ＰＣＲ検出法により、鋳型ＤＮＡは、きれいに同期的に増幅し、ＰＢＭＣ中のＴＬ−Ｏｍ１濃度を更に１／４０以上に希釈（０．８％から０．０２％以下に希釈）しても同様の結果が得られた（図２ａ〜２ｃ、参照）。

判定結果は、ポジティブコントロール（５００ｎｇ／well）のＴＬ−Ｏｍ１ ０．８％濃度及び０．０２％濃度では、全ての反応ウェルで陽性となり、ネガティブコントロールの３検体では、全ての反応ウェルで陰性であった。

次の実施例２では、 低コピーＨＴＬＶ−１プロウイルスの検出効率と、適切なサイクル数について検討を行った。

後述するが、低コピーＨＴＬＶ−１プロウイルスの検出とは、例えば、１コピーのＨＴＬＶ−１が感染している感染細胞が、正常細胞に対して、０．０００９％〜０．００１８％程度の低濃度で存在する検体（高い希釈率の検体）由来ＤＮＡからの、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの検出をいう。また、コピー数に換算すると、ＨＴＬＶ−１プロウイルスゲノムが、１ウェル（５００ｎｇDNA）当たり、平均約０．６７５〜１．３５コピー程度しか存在しない、ごく低頻度のコピー数の場合を意味する。
なお、本実施例では、正常細胞として健常人の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を使用した。

（実施例２）
＜低コピーＨＴＬＶ−１プロウイルスの検出＞
本発明の各プライマー対による、ヒト細胞内のＨＴＬＶ−１プロウイルスの検出効率、特にヒト細胞内にＨＴＬＶ−１プロウイルスが低コピー存在する場合の検出効率を調べた。
本来のＨＴＬＶ−１プロウイルス陽性細胞の希釈率が高くなれば、つまり、検体細胞中のＨＴＬＶ−１プロウイルス陽性細胞の割合が低くなれば、当該ＨＴＬＶ−１プロウイルスの検出率は低くなるため、本発明のプライマーを用いた同期的ＰＣＲ反応法では、どの程度の希釈率で検出限界になるかを調べることも必要である。

高精度ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ装置Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ ｆａｓｔ（登録商標）を用いて上記と同様の条件で行った。

テスト用試料としては、上記したように、ＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡが平均１．８コピー／細胞でゲノムに挿入されていることが確認されているＴＬ−Ｏｍ１細胞を、市販品のＰＢＭＣ（ヒト末梢血単核球）で段階希釈して、ＰＢＭＣ中のＴＬ−Ｏｍ１細胞の濃度で、０．０５％〜０．０００５％まで希釈した検体を準備し、各希釈率の検体からゲノムＤＮＡを抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ ｍｉｎｉ ｏｒ ｍｉｄｉ（登録商標））で精製し、それぞれ５００ｎｇ／ｒｅａｃｔｉｏｎで、１０ウェルに対して合計で約７．５×１０^５細胞分のＤＮＡを使用した（１μｇのｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡは、正常細胞の１．５×１０^６個分に相当する。）。
なお、ネガティブコントロールとして、上記ＰＢＭＣ由来のＤＮＡを使用した。

（ＴＬ−Ｏｍ１細胞希釈率とＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡのコピー数との関係）
ここで、細胞希釈率（つまり全細胞中のＨＴＬＶ−１陽性細胞の割合）をＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡのコピー数に換算すると、例えば、ＴＬ−Ｏｍ１細胞には、１．８コピーのＨＴＬＶ−１プロウイルスが内在するから、ＴＬ−Ｏｍ１細胞希釈率０．０００５％の場合、合計１０ウェルで用いる約７．５×１０^５ＰＢＭＣ細胞中に、合計約３．７５のＴＬ−Ｏｍ１細胞が存在することとなり、つまり、７．５×１０^５細胞分の抽出ＤＮＡ（１０ウェル分）中には、平均約６．７５コピーのＨＴＬＶ−１プロウイルスが存在（１．８コピー×（７．５×１０^４細胞）×１０ウェル×０．０００５／１００＝６．７５コピー）し、１ウェル当たりに換算すれば、平均約０．６７５コピーしか存在しない計算である。

同様に、希釈率０．００１％の場合は、理論上、１０ウェル全体の、７．５×１０^５細胞中ＴＬ−Ｏｍ１が７．５細胞存在することになるから、７．５×１０^５細胞分の抽出ＤＮＡ中には、約１３．５コピーのＨＴＬＶ−１プロウイルスが存在し、１ウェル当たりに換算すれば、平均約１．３５コピーしか存在しない計算である。

なお、ここでは、一例として、１回のＰＣＲ反応を１０ウェルで行う場合の、検体細胞数やＤＮＡ量を示しているが、これはあくまで目安であって、反応ウェル数は、使用するプライマー対の数等によって適宜調整される。また、１ウェル当たりのＤＮＡ量は、通常、５００ｎｇ〜１０００ｎｇ程度の範囲で設定可能である。これらは、他の実施例等でも同様である。

高精度ＰＣＲ反応の条件、プライマーの設定、判定方法等は実施例１に記載したとおりである。

（サイクル数の検討とＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡ陽性の判定方法） 表２
本願発明の実施形態では、精度を高めるために、同期的に増幅することを確認したプライマーを使用してｍｕｌｔｉｐｌｅにＰＣＲを行った結果、３８サイクル以下でＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値が得られたウェルをＰＣＲ陽性ウェルとし、３８サイクルより大きいＣｔ値を示したウェルを陰性とした。そして、ＨＴＬＶ−１プライマーを用いたウェルのうち、複数（２カ所以上）のウェルで陽性が出た場合にＨＴＬＶ−１プロウイルス陽性と判断した。
なお、表中のＵＤは、ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄの略である。
また、これ以後の実施例でも、ＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡ陽性の判断は、同様の方法で行った。

（結果）
表２の実験において、希釈率０．００１％では、ＬＴＲ２１５、０２１、０７１、０８４、０９２、１０９、ｐＸ２の７つのプライマー対で、Ｃｔ値３８サイクル以下で陽性と検出することができた。また、更に希釈した希釈率０．０００５％では、ＬＴＲ２１５、０２１、１０９、１８４の４つのプライマー対で、Ｃｔ値３８サイクル以下で陽性と検出できた。なお、表２で、Ｃｔ値が３８サイクルより大きいものは、陽性判定の対象から除外している。

つまり、上記希釈率と検出率との関連実験から、１０ウェル分の検査すべき検体（約７．５×１０^５細胞）中に、ＨＴＬＶ−１プロウイルスのコピー数が約１０〜１５程度存在すると計算される場合（希釈率０．００１％、１ウェル当たり平均１．３５コピー）、ＬＴＲ２１５、０２１、０７１、０８４、０９２、１０９、ｐＸ２の７つのプライマー対の組合せが、ＨＴＬＶ−１プロウイルス有無の判定に有用であった。
また、さらに低頻度で、１０ウェル分の検査すべき検体（約７．５×１０^５細胞）中に、コピー数が約５〜９程度存在する場合（希釈率０．０００５％、１ウェル当たり平均０．６７５コピー）、ＬＴＲ２１５、１０９、１８４、０２１の４つのプライマー対の組合せが、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの有無の判定に有用であるとの結果を得た。
そして、これら低コピーの場合でも共通して検出可能であったのは、ＬＴＲ２１５、０２１、１０９の３つのプライマー対であった。

上記希釈率０．００１％、０．０００５％の場合のＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡ陽性判定とプライマーとの関係をまとめると、例えば、約７．５×１０^５細胞の検体中のＨＴＬＶ−１プロウイルスが、全体で約６．７５〜１３．５コピー程度しかない場合（つまりウェル当たりの平均コピー数が、０．６７５〜１．３５しかない場合）でも、少なくとも、ＬＴＲ２１５、０２１、１０９の３つのプライマー対を用いて、高精度ＰＣＲ検出法を行うことが、ＨＴＬＶ−１プロウイルス陽性判定のために有用であることが判明した。
この３対のプライマーに、プライマー対１８４を加えても良く、更に、プライマー対０７１、０８４、０９２、ｐＸ２を加えてもよい。また、本願発明の全てのプライマーを用いてもよい。

一方、既知のｐＸ２プライマー対を用いて高精度ＰＣＲ検出法を行うと、希釈率０．００１％（１ウェル当たり１．３５コピー程度）の場合では、２ウェルのうち１ウェルしか陽性とならなかった（１／２ｗｅｌｌ陽性）ため、「判定不能」との結果となってしまい、また、コピー数がさらに少ない希釈率０．０００５％（１ウェル当たり０．６７５コピー程度）の場合では、検出不能との結果であった。

上記のように、本発明の実施形態による高精度ＰＣＲ検出法は、新規の１０対のプライマーのうち、少なくともＬＴＲ２１５、０２１、１０９の３つのプライマー対を用いれば、ＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡが１ウェル当たり平均約０．６７５コピー程度の低コピーしか存在しなくても、異なるプライマー対を用いた複数のウェルで、陽性として検出可能であるという、高感度、高精度のものであることが示された。

（実施例３、４）
上記の低コピーＨＴＬＶ−１プロウイルスに対する高感度ＰＣＲ実験の結果をふまえて、次に、ＪＲＣ（日本赤十字社）血液センターで判定不能とされた検体を用いた、本発明の実施態様について説明する。

（検体）
ＪＲＣ検体において、１次スクリーニング（ＣＬＥＩＡ法）で陽性で、２次スクリーニング（ＷＢ法とＩＦ法）でＷＢ法とＩＦ法の判定結果が異なったもの９７検体（以下、「結果不一致検体」という。）を対象に、３次スクリーニングの核酸確認検査（以下、「３次核酸確認検査」、または、「３次スクリーニング」ともいう。）として従来のＰＣＲ法を行ったところ、４１例が陽性（２／２ｗｅｌｌ陽性：２ウェルとも陽性）、７例が判定不能（１／２ｗｅｌｌ陽性：２ウェル中、１ウェルが陽性）、４９例が陰性（０／２ｗｅｌｌ陽性：２ウェル中、陽性ウェル無し）との結果を得た。

そこで、（１）１次スクリーニング（ＣＬＥＩＡ法）では陽性だが、その後のスクリーニングで結果が不一致となった上記結果不一致検体の中で、従来のＰＣＲ法を用いて３次核酸確認検査を行っても依然として判定不能とされた、検出限界付近の極めて判定の難しい検体７例を「判定不能」検体群（実施例３）とし、また、（２）上記結果不一致検体の中で、従来のＰＣＲ法を用いた３次核酸確認検査で陰性とされた４９例のうち２３例の検体を「陰性」検体群（実施例４）として、それぞれを、本発明の、高精度ＰＣＲ検出法の対象として、検討を行うこととした。

（従来のＰＣＲ法）
上記従来のＰＣＲ法とは、ｐＸ２プライマーを用いた、通常の定量ＰＣＲ法である。
このＰＣＲ反応は、市販キット（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ ｍｉｄｉキット（登録商標）、ＱＩＡＧＥＮ社）で抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ量１０００ｎｇ／ｗｅｌｌ、ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ ２０μｌで、ＰＣＲ装置Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ ｆａｓｔ（登録商標）を用いて、機器のＦａｓｔプログラムで９５℃ １０分の後、９５℃ ５秒−６０℃ ３０秒のＰＣＲサーマルサイクルを４０サイクル行った。
従来のＰＣＲ法での陽性の判定は、ｐＸ２プライマーを用いた２つのウェルのうち、２ウェル共に陽性とされた場合にＨＴＬＶ−１プロウイルス陽性検体と判断した。２ウェル共に陽性とされなかった場合は、ＨＴＬＶ−１プロウイルス陰性検体とし、２ウェル中１ウェルで陽性とされた場合は、判定不能と判断した。

（ＤＮＡ精製）
ＪＲＣ（日本赤十字社）のＨＴＬＶ−１プロウイルスＰＣＲ検査法で判定不能とされた検体群（実施例３）及び陰性とされた検体群（実施例４）の血餅５００μｌ相当の末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）１ｘ１０^６−７細胞と、ＴＬ−Ｏｍ１／ＰＢＭＣ希釈品（陽性コントロール）１ｘ１０^６−７細胞を対象として、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ ｍｉｄｉキット（登録商標）ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、推奨プロトコルに従いゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を精製した。

（ＤＮＡ濃度調整）
精製ｇＤＮＡをスペクトロフォトメーター(機器名：ナノドロップ（登録商標）2000)でＯＤ値測定により定量したのち、容積の１／５の容量の３Ｍ ＮａＯＡｃを加え、１容量のイソプロパノールを加えてボルテックスし、従来のエタノール沈殿法によりｇＤＮＡを濃縮した。
エタノール沈殿により乾燥させたｇＤＮＡに対して、ナノドロップ2000測定値から換算して、２００ｎｇ／μｌになるように注射用水を加え、２００ｎｇ／μｌのｇＤＮＡ溶液とした。

（ＰＣＲ反応液組成 （１５μｌ／ウェル系））
Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （２Ｘ）（登録商標）を７．５μｌ、左側（「第一」）プライマー、右側（「第二」）プライマー（各１０μＭ）をそれぞれ０．６μｌ、Ｔａｑｍａｎプローブ（登録商標）（１０μＭ）を０．３μｌ、ＤＷ（注射用水）を１．０μｌ、ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを１μｇ（２００ｎｇ／μｌの場合は５μｌ）加え、１ウェルあたり全量１５μｌの反応液とした。
１検体あたりプライマーと検出プローブを加えていない反応Ｍｉｘを１８ウェル分調整し、それぞれのウェルへ１３．５μｌずつ分注した。次にプライマーと検出プローブのＭｉｘをそれぞれに相当するウェルに１．５μｌ（０．６＋０．６＋０．３μｌ）分注し、反応液とした。

（プライマー）（表１、参照）
本検出方法では、新規の２０のオリゴヌクレオチドつまり、新規の１０対のプライマーと、そのための１０のＴａｑｍａｎプローブ（登録商標）のセット、及び、４対の内部コントロール用プライマーと４つのＴａｑｍａｎプローブ（登録商標）のセットを含む、キットを提供することができる。
さらに、上記プライマーとＴａｑｍａｎプローブ（登録商標）とのセットに、ｐＸ２プライマーとそのためのＴａｑｍａｎプローブ（登録商標）のセットを、加えても良い。
また、検出用プローブは、他の代替となるものでもよい。
プライマーやプローブと配列番号との関係等は、表１に記載した。

（高精度ＰＣＲ反応）
ＰＣＲ装置Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ ｆａｓｔ（登録商標）を用いて、機器のＦａｓｔプログラムで９５℃ １０分の後、９５℃ ５秒−６０℃ ３０秒のＰＣＲサーマルサイクルを４０サイクル行った。内部コントロール（Ｉ．Ｃ．）として、Ｓ１９−４０、Ｌ１１−２０、ＲＡＧ１−３２の各プライマー及び各検出プローブを用いた（表１、参照）。

今回は、反応系は１μｇ／ｗｅｌｌで、１５μｌの系を用い、ＨＴＬＶ−１用プライマーは、新規の１０対のプライマー（計１０ウェル：各ウェル毎に１対のプライマー）、及び、１対のｐＸ２プライマー対（計２ウェル）で、ＨＴＬＶ−１検出用ウェルは合計１２ウェル（合計１２μｇＤＮＡ）、内部コントロール（Ｉ．Ｃ．）用は３ウェル、ＤＷのみは１ウェルとした。

上記検体から得たＤＮＡに関し、実際に、ＨＴＬＶ−１検出用ＰＣＲ反応を、１検体について最大１０対の新規プライマー及び１対の既知のｐＸ２プライマー（計２ウェル）を用いて、反応を一度に同期的に行うことができることは、図２ａ〜図２ｃの場合と同様に、確認済みである。

（判定法）
本願発明の実施態様では、上記のように、精度を高めるために、同期的に増幅することを確認したプライマーを使用してｍｕｌｔｉｐｌｅにＰＣＲを行うことで、簡便に高感度を達成することができ、下記の試験を行った結果、３８サイクル以下でＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値が得られたウェルをＰＣＲ陽性ウェルとし、３８サイクルより大きいＣｔ値は陰性とした。
そして、１０対の新規プライマー（１０ウェル）及び１対のｐＸ２プライマー（２ウェル）の反応ウェル全体（合計１２ウェル）の中で、少なくとも複数（２ウェル以上）で陽性が出た場合に、ＨＴＬＶ−１核酸陽性と判断した。一方、従来法の、ｐＸ２プライマーによるＰＣＲについての判定は、従来通り、２ウェルとも陽性となった場合に、ＨＴＬＶ−１核酸陽性と判断した。

（実施例３） 表３
＜ＪＲＣ（日本赤十字社）判定不能検体（検出限界付近検体）を用いた検討＞
（検体）
１次スクリーニング（ＣＬＥＩＡ法）では陽性だが、その後のスクリーニングで結果が不一致となった上記結果不一致検体の中で、従来のＰＣＲ法を用いて３次核酸確認検査を行っても依然として判定不能とされた、検出限界付近の極めて判定の難しい検体（判定不能検体）７例（＃２１０、＃２２６、＃２４０、＃２５４、＃２６１、＃２６３、＃３０８）を対象とした。
なお、陽性コントロールとして、ＰＢＭＣ細胞（ヒト末梢血単核球（市販品））中に０．８％濃度または０．０２％濃度のＴＬ−Ｏｍ１細胞を含むサンプル由来ＤＮＡを使用し、陰性コントロールとしてＰＢＭＣ由来のＤＮＡを用いた。

本願発明に係る新規プライマー１０対とｐＸ２プライマーとを用いて、上記の条件で高精度ＰＣＲ検出法行い、その結果を得た。

表３は、本願発明に係る１０の新規プライマー対を各ウェルで反応させた場合、及び、既知のｐＸ２プライマー対を２つのウェルで反応させた場合（従来ＰＣＲ法の高精度ＰＣＲ適用例）で、検出プローブを用いて同時に高精度ＰＣＲ検出法を行った結果得られたＣｔ値を示す。
なお、前記したように、３８サイクル以下でＣｔ値が得られたウェルをＰＣＲ陽性ウェルとし、３８サイクルより大きいＣｔ値は陰性ウェルとして、２以上のウェルが陽性の場合、陽性検体と判定した。また、表中のＵＤは、ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄを意味する。

表３に示したように 依然としてとして判定不能の７検体において、まず、既知のｐＸ２プライマーで高精度ＰＣＲ検出法を行った場合、＃２５４、の１検体が唯一陽性と判定され、陽性判定率は１／７＝１４．３％であった。
なお、このｐＸ２プライマーは、従来のＰＣＲ法で使用されている既知のプライマーと同じであるが、上記したように、本願発明の初期のプライマースクリーニングで、同期的に増幅可能な１１対のプライマー群の１つとして、他の新規のプライマーと共に選別されたものでもある。

一方、本発明の新規プライマーを用いた場合は、＃２１０、＃２２６、＃２６１、＃３０８、の４検体で陽性と判定され、陽性判定率は４／７＝５７．１％と高値であった。更に、本発明の新規プライマーとｐＸ２プライマーを組合せた場合、＃２１０、＃２２６、＃２５４、＃２６１、＃３０８、の５検体で陽性と判定され、陽性判定率は５／７＝７１．４％と一層高い値となった。

詳しく検討すると、今回用いた、ＪＲＣの、陽性判定された１次スクリーニング後のスクリーニング結果が不一致な検体中、３次確認検査である従来ＰＣＲ法では陽性・陰性の判定ができずに判定不能等とされた、判定不能検体において、高精度ＰＣＲ検出法によれば、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの有無の判定に関しては、新規のプライマーのうち、ＬＴＲ２１５、０２１、１０９、の３対のプライマーで、２件の検体を陽性と判定することができた。その陽性判定率は２８．６％であった。
また、ＬＴＲ２１５、０２１、０５６、１０９、１５３、１８４の６対のプライマーでは、陽性判定率４２．６％、ＬＴＲ２１５、０２１、０５６、１０９、１５３、１８４、ｐＸ２の７対のプライマー、あるいは、ＬＴＲ２１５、０２１、０５６、１０１、１０９、１５３、１８４の７対のプライマーでは、陽性判定率５７．１％であり、更に、ＬＴＲ２１５、０２１、０５６、１０９、１５３、１８４、ｐＸ２、ｐＸ２の８対のプライマーでは、陽性判定率７１．４％との非常に高い陽性判定率を得ることができた。

以上の結果から、ＪＲＣが用いるスクリーニング法では判定不能、判定保留等とされてしまう検体でも、本願発明に係る複数のプライマー対を用いた高精度ＰＣＲ検出法を用いることによって、明確に陽性判定結果を得ることができ、迅速に、高精度にＨＴＬＶ−１プロウイルスキャリアを判断できるという、格別な有用性が、実際の検体を用いて実証することができた。

（実施例４） 表４
＜ＪＲＣ（日本赤十字社）従来ＰＣＲ法での陰性検体を用いた検討＞
（検体）
上記ＪＲＣの、陽性判定された１次スクリーニング後のスクリーニング結果が不一致な検体中、従来ＰＣＲ法では陰性（陽性なし）とされた、陰性検体、２３例に関して検討を行った。

本願発明に係る新規プライマー１０対とｐＸ２プライマーとを用いて、上記の条件で高精度ＰＣＲ検出法行い、その結果を得た。

表４は、本願発明に係る１０の新規プライマー対を各ウェルで反応させた場合、及び、既知のｐＸ２プライマー対を２つのウェルで反応させた場合（従来ＰＣＲ法の高精度ＰＣＲ適用例ともいえる）で、検出プローブを用いて同時に高精度ＰＣＲ検出法を行った結果得られたＣｔ値の一部を示す。
なお、表３と同様、前記したように、３８サイクル以下でＣｔ値が得られたウェルをＰＣＲ陽性ウェルとし、３８サイクルより大きいＣｔ値は陰性ウェルとして、２以上のウェルが陽性の場合、陽性検体と判定した。

表４に一部示したように ３次核酸確認検査の従来ＰＣＲ法で陰性とされた２３検体において、既知のｐＸ２プライマーを用いた場合は、定量性に優れた高精度ＰＣＲ検出法を行っても、ＨＴＬＶ−１プロウイルス陽性であるとの結果を得ることはできなかった（陽性検出率＝０／２３＝０％）。
なお、ｐＸ２プライマーは、上記したように、本願発明の初期のプライマースクリーニングで、同期的に増幅可能な１１対のプライマー群の１つとして、他の新規のプライマーと共に選別されたものでもある。

以上の様に、ｐＸ２プライマーを用いた高精度ＰＣＲ検出法でも陽性と判定できなかったにもかかわらず、本発明の新規プライマーを用いた場合は、３検体（＃１６２、＃１７７、＃１８７）で陽性と判定され、さらにｐＸ２プライマーも組合せた場合は、４検体（＃１６１、＃１６２、＃１７７、＃１８７）で陽性と判定された。
つまり、やはり、従来のｐＸ２プライマーによるＰＣＲ法では、例え、本願発明で用いる高精度ＰＣＲ検出法を適用したとしても、潜在するＨＴＬＶ−１プロウイルスのゲノムを検出することに限界があることが判明し、他方、本願発明に係るプライマーを用いることの有用性が明確になった。

本実施例では、新規プライマーの、０２１、０５６、１０９、１５３、１８４、あるいは、ｐＸ２プライマーが判定に有用であった。

以上のことから、１次スクリーニング（ＣＬＥＩＡ法）では陽性だが、その後のスクリーニングで結果が不一致となり、３次核酸確認検査で陰性（異常なし）とされた検体、つまり、ＨＴＬＶ−１キャリアでないと判定されかねない検体の中で、少なくとも１７．４％（４／２３）の検体は、本願発明に係る高精度ＰＣＲ検出法を用いれば、陽性、つまり、ＨＴＬＶ−１プロウイルスのキャリアであると判定可能であるという極めて重要な知見を得た。
潜在するキャリアの発見、及びキャリアによるＨＴＬＶ−１感染の拡大の防止のためにも、本願発明の高精度ＰＣＲ検出法が大変有用であることが実際の検体を用いて実証された。

以上、実施例３の、ＪＲＣの各種スクリーニングの後、従来ＰＣＲ法による３次核酸確認検査後でも判定不能とされた判定不能検体での結果、及び、実施例４の、ＪＲＣの各種スクリーニングの後、従来ＰＣＲ法による３次核酸確認検査で陰性（異常なし）と判定された陰性検体での結果から、本願発明に係る１０対の新規プライマーのうち、例えば、０２１、０５６、１０９、１５３、１８４の５つの組合せ、あるいは、さらに、ｐＸ２を加えた組合せが、ＨＴＬＶ−１プロウイルスのキャリア検出に有用であった。

（実施例５）
＜欠失型プロウイルス検体（＃２２３）の検出＞
前記したように、ＡＴＬの発症とＨＴＬＶ−１ウイルスの欠失型変異との関連性が強く指摘されており、欠失型プロウイルスの検出ができれば大変有用であることから、この様な可能性のある検体を対象として、本発明の各プライマー対を用いた高精度ＰＣＲ検出法による検出能について検討した。
なお、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの欠失型変異は、ＡＴＬ発症患者の４０−６０％で検出され、欠失がＡＴＬ発症に大きく関わっていること、また、欠失にはタイプ１（５’末端側の一部欠失、５’末端側ＬＴＲは残存）とタイプ２（５’末端側ＬＴＲを含め一部欠失）が知られている（非特許文献３）。

（検体）
ＪＲＣ検体中で、１次スクリーニングで陽性、２次スクリーニングのＷＢ法で陽性、ＩＦ法で判定保留となり、ＪＲＣ基準で判定保留とされた１１例の検体を対象とし、上記と同様の方法でＤＮＡの精製、濃度調整等を行った。

本願発明に係る新規プライマー１０対とｐＸ２プライマーとを用いて、上記と同様の条件で高精度ＰＣＲ検出法を行い、その結果を得た。

図３に示されている様に、上記のＷＢ法で陽性となった１１検体は、すべてＨＴＬＶ−１プロウイルスの存在が確認され、さらにその中の１例（＃２２３）では、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの一部において、プライマー対０２１、０５６、０７１、０８４、０９２、１０１、１０９の増幅標的領域に欠失（タイプ１）の存在を示す結果を得た。
なお、図３において、縦軸はＣｔ値（Ｃｙｃｌｅｓ）、横軸は各プライマー対を示す。

（Ｌｏｎｇ−ＰＣＲおよびダイレクトシーケンス法によるＨＴＬＶ−１プロウイルス欠失型の検証）
上記高精度ＰＣＲ検出法による判定結果の有効性を検証するために、本願発明のプライマーセットの中から、上記欠失領域を挟むプライマー（ＬＴＲ２１５Ｆ、１５３Ｒ）を選択し、これらをプライマー対として、ＫＯＤ ＦＸ（登録商標）（ＰＣＲ酵素：東洋紡株式会社）で、全長約６．３ｋｂをカバーするｌｏｎｇ−ＰＣＲを行ったところ、ＨＴＬＶ−１プロウイルス欠失タイプ１が存在することが明確になった。また、高精度ＰＣＲ検出法での結果と同様、別途、完全長型のＨＴＬＶ−１プロウイルスも存在していた。
また、このＰＣＲ増幅産物に関して、ダイレクトシーケンス法により塩基配列を決定した結果、この欠失は、ＡＫＴ−１（ＡＴＬから分離されたＨＴＬＶ−１ウイルス）配列の、ｎｔ１４０６−６０７４（４６６９塩基）に相当する領域の欠失であることが判明した。

以上のことから、本願発明の高精度ＰＣＲ検出法により検体中に認められた、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの欠失タイプ１との結果は、ｌｏｎｇ−ＰＣＲおよびダイレクトシーケンス法による実験結果からも確証が得られ、本願発明のプライマーを用いた高精度ＰＣＲ検出法は、欠失タイプ検出においてもその有用性が実証された。

このＨＴＬＶ−１プロウイルスの欠失には、タイプ１（５’末端側の一部欠失、５’末端側ＬＴＲは残存）の他、タイプ２（５’末端側ＬＴＲを含め一部欠失）もあることが知られており、欠失タイプ２は、検体が入手不能のため実際に検討はできなかったが、タイプ１の欠失領域からさらに５’末端側ＬＴＲを含めて欠失しているタイプであるから、当然、本願発明のプライマーを用いた高精度ＰＣＲ検出法で、タイプ１と同様に検出可能であると判断され得る。

つまり、本願発明のプライマーを用いた高精度ＰＣＲ検出法は、ＡＴＬ発症と深い関連性のあるＨＴＬＶ−１プロウイルスの欠失型の検出が可能であることから、ＨＴＬＶ−１プロウイルスキャリアの検出だけでなく、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの欠失型の診断に用いることができる。引いては、欠失型によるＡＴＬ発症の発見にも利用できる可能性がある。

上記したように、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの欠失型変異は、ＡＴＬ発症患者の４０−６０％で検出され、欠失がＡＴＬ発症に大きく関わっていることが考えられるため、この欠失型変異が、本願発明による、ＨＴＬＶ−１キャリア検出のためのスクリーニング中で発見できたことによって、本願発明は、ＨＴＬＶ−１キャリア検出だけでなく、同時に、ＡＴＬ発症者の早期発見にも寄与し得る、大変有意義なものであるといえる。

このように、本願発明のプライマーを用いた高精度ＰＣＲ検出法は、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの検出に関して、１感染細胞に１コピーのＨＴＬＶ−１プロウイルスが存在するとした場合、感染細胞を０．００１８％程度しか含まない様な、低コピーの検体（１ウェル当たり１．３５コピー程度）であっても、さらに、感染細胞を０．０００９％程度しか含まない様な、超低コピーの検体（１ウェル当たり０．６７５コピー程度）であっても、検出可能であるだけではなく、ＪＲＣ１〜３次スクリーニングで判定保留、判定不能又は陰性の、検討が困難な検体であっても、あるいは、ＤＮＡ欠失型変異であっても、高感度かつ高精度に検出可能であることが示された。
なお、当該感染細胞濃度とコピー数の関係は、上記実施例２の、細胞当たり１．８コピーのＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡを有するＴＬ−Ｏｍ１の細胞濃度と検出効率に関する結果から算出したものである。

（プライマーと検出頻度との関係）
以上の結果から、表５にも示したように、従来のｐＸ２プライマーに比べ、本願発明の高精度ＰＣＲ検出法において、
（１）少なくとも、０２１、１０９の２対のプライマーを用いることによって、１コピーのＨＴＬＶ−１プロウイルス内在細胞が正常細胞中に０．００１８％、０．０００９％という低頻度で存在しても、陽性と判定することが可能であること、及び、ＪＲＣで３次核酸確認検査でも判定不能であった検体中の一部を陽性と判定可能であること、
（２）少なくとも、ＬＴＲ２１５、０２１、１０９の３対のプライマーを用いることによって、ＨＴＬＶ−１プロウイルス内在細胞が低頻度で存在しても、陽性と判定することが可能であること、ＪＲＣで３次核酸確認検査でも判定不能であった検体でも、３割程度は陽性と判定可能であること、さらに、ＨＴＬＶ−１プロウイルスが欠失型であっても、陽性と判定可能で、かつ欠失タイプ１も判別可能であること、
（３）少なくとも、ＬＴＲ２１５、０２１、０５６、１０９、１５３、１８４の６対のプライマーを用いることによって、ＨＴＬＶ−１プロウイルス内在細胞が低頻度で存在しても、陽性と判定可能であること、ＪＲＣで３次核酸確認検査でも判定不能の検体でも、４割程度は陽性と判定可能であること、３次核酸確認検査で陰性とされた検体でも陽性であることを突き止められること、さらに、ＨＴＬＶ−１プロウイルスが欠失型であっても、陽性と判定可能で、かつ異なる欠失タイプも判別可能であること等、がわかった。

また、少なくとも、ＬＴＲ２１５、０２１、０５６、１０９、１５３、１８４、ｐＸ２、ｐＸ２の８対のプライマーを用いることによって、ＨＴＬＶ−１プロウイルス内在細胞が低頻度で存在しても陽性と判定可能であること、ＪＲＣで３次核酸確認検査でも判定不能の検体でも、７割程度は陽性と判定可能であること、３次核酸確認検査で陰性とされた検体でも陽性であることを突き止められること、さらに、ＨＴＬＶ−１プロウイルスが欠失型であっても、陽性と判定可能で、かつ異なる欠失タイプも判別可能であること等、がわかった。
また、必要に応じて上記プライマーの組合せを変えて、ｌｏｎｇ−ＰＣＲ用プライマーを設定して、欠失領域の確認のためのｌｏｎｇ−ＰＣＲを実行することも可能である。

以上のことから、本願発明は、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの検出に関して、他に代え難いほど有用で、顕著な効果を有する。

本願発明は、上記プライマーの組合せを、セットとすることができ、また、これらプライマーや検出プローブを含むＨＴＬＶ−１プロウイルス検出のためのキットとすることも可能である。
また、本願発明は、上記の様なプライマーを用いたＨＴＬＶ−１プロウイルスの検出方法を実行する、システムや装置についても、その技術的範囲に含むものである。

このように、本願発明は、従前の１次〜３次スクリーニング検査では、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの存在が判定不能な検体や、陰性とされた検体でも、また、欠失型ＨＴＬＶ−１プロウイルス含有検体でも、単独で、迅速かつ高感度・高精度な検出・判定が可能な、利便性の高いものである。

上記実施例を鑑みれば、当業者であれば、本願発明の高精度ＰＣＲ検出法を用いた、ＨＴＬＶ−１検出方法に特化して、プログラミングすることもできるし、そのためのシステムとすることも可能である。

本明細書で引用した、すべての特許文献、非特許文献および物品、参照文献、参照マニュアル等は、本発明が関係する分野の状態をより完全に説明するためにその全体を参照により本明細書に取り込む。

本発明の範囲および精神から逸脱することなく、上記の主題に種々の変更を行うことができるので、上記説明に含まれるかまたは添付の特許請求の範囲で定義されるすべての主題は本発明の記述および例示として解釈されることが意図される。本発明の多くの修飾および変更が上記教示に照らして可能である。

本明細書の実施例は、本発明を実施する種々の側面を例示することを意味し、本発明の範囲をいずれの方法においても制限することを意図せず、種々の変形及び応用が可能である。実施例には、使用される従来法の詳細な説明は含まれない。このような方法は、当業者に周知であり、多くの刊行物、例えばJ. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd Edition, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001（非特許文献４）に説明されている。

Claims (15)

1. 配列番号３、４、１５、１６の各標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を有する配列を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
2. 配列番号１、２の各標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を含有する配列をさらに含む、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
3. 配列番号５、６、１７〜２０の各標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を含有する配列をさらに含む、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
4. 配列番号２１、２２の各標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を含有する配列をさらに含む、請求項３記載のオリゴヌクレオチド。
5. 配列番号７〜１４の各標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を含有する配列をさらに含む、請求項４記載のオリゴヌクレオチド。
6. 配列番号３、４、１５、１６の各標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を有する配列を含むプライマーを含有することを特徴とする、ＨＴＬＶ−１プロウイルスを検出するためのキット。
7. 配列番号１、２の各標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を含有する配列を有するプライマーをさらに含有する、請求項６記載のキット。
8. 配列番号５、６、１７〜２０の各標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を含有する配列を有するプライマーをさらに含有する、請求項７記載のキット。
9. 配列番号２１、２２の各標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を含有する配列を有するプライマーをさらに含有する、請求項８記載のキット。
10. 配列番号７〜１４の各標的結合配列からなるＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列を含有する配列を有するプライマーをさらに含有する、請求項９記載のキット。
11. 配列番号２３〜３３の配列からなる検出プローブのうち、請求項６〜１０のいずれかに記載のプライマーのための検出プローブをさらに含有する、請求項１０記載のキット。
12. 内部コントロールプライマーとその検出プローブをさらに含有する、請求項１１記載のキット。
13. 臨床サンプル中のＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列の存在を検出する方法であって、前記方法が、
    （ａ）請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドからなるプライマー対入りの各ウェル内に前記臨床サンプル由来ＤＮＡを添加して、増幅されたＨＴＬＶ−１プロウイルス核酸生成物を産生する工程、
    （ｂ）前記増幅されたＨＴＬＶ−１プロウイルス核酸生成物とＣｔ値を検出する工程、および、
    （ｃ）前記Ｃｔ値が基準値内の時に、２ウェル以上の、前記増幅されたＨＴＬＶ−１プロウイルス核酸生成物の検出を指標として、サンプル中のＨＴＬＶ−１プロウイルスの存在の有無を確認する工程、
    を含むことを特徴とする、方法。
14. 臨床サンプル中のＨＴＬＶ−１プロウイルス標的結合配列の存在を検出するためのシステムであって、
    請求項１〜５いずれかに記載のオリゴヌクレオチドからなるプライマー対入りの各ウェル内に前記臨床サンプル由来ＤＮＡを添加して、増幅されたＨＴＬＶ−１プロウイルス核酸生成物を産生する手段と、
    前記増幅されたＨＴＬＶ−１プロウイルス核酸生成物とＣｔ値を検出する手段と、
    前記Ｃｔ値が基準値内の時に、２ウェル以上の、前記増幅されたＨＴＬＶ−１プロウイルス核酸生成物の検出を指標として、サンプル中のＨＴＬＶ−１プロウイルスの存在の有無を確認する手段と、
    を有する、システム。
15. 請求項１３記載の方法の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を実行するように適合されたコンピュータプログラム。

Images