CN106119413A - 一种艾滋病病毒多重荧光pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种艾滋病病毒多重荧光pcr检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种艾滋病病毒多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括PCR反应试剂、标签引物Tag、LTR基因特异性引物和探针、GAG基因特异性引物和探针、RNase P内控靶基因引物和探针；本发明试剂盒对艾滋病病病毒HIV前病毒DNA核酸的检测简便快速，具有高度的特异性和灵敏度，检出限可达20拷贝/反应；该方法可直接从全血或外周血淋巴细胞富积液样本中检测HIV病毒核酸，从核酸提取到完成检测少于3.5小时，有利于HIV感染诊断尤其是HIV窗口期患者、HIV抗体不确定者、婴儿感染早期诊断等。

Description

一种艾滋病病毒多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法
(一)技术领域
本发明涉及一种艾滋病病毒多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法。
(二)背景技术
艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的，自1981年首次报道以来，已经成为严重危害公共卫生的重大传染病之一。截止2012年全球共有3530万(3220万～3880万)人感染艾滋病病毒。2012年约230万人新发感染艾滋病病毒，约160万人死于与艾滋病相关疾病。在中国2015年检测发现的艾滋病感染者超过11万例，截止2015年底全国报告现存活病例超过57万。近年来艾滋病感染者人数依然保持较快增加，艾滋病防治形势依然严峻。
检测发现是控制艾滋病蔓延的重要手段，建立快速、敏感、特异的艾滋病病毒检测方法是十分必要的。近年荧光PCR技术在传染病病原体检测方面得到广泛的应用，它利用PCR技术实现对DNA的高效扩增并结合探针技术的高特异性，克服了常规血清学和普通PCR方法的诸多不足，具有广阔的应用价值。多重荧光PCR技术进一步实现多任务检测，更具省时省力的优点。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种艾滋病病毒HIV多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法，克服了常规血清学和普通PCR方法的诸多不足，具有广阔的应用价值。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种艾滋病病毒HIV多重荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应试剂、标签引物Tag、LTR基因特异性引物和探针、GAG基因特异性引物和探针、RNase P内控靶基因引物和探针：
标签引物Tag：5'-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3'；
LTR上游引物：5'-Tag-GCCTCAATAAAGCTTGCC-3’；
LTR下游引物：5'-Tag-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3’；
LTR荧光探针：5'-FAM-AAGTRGTGTGTGCCC-BHQ1-3'；
GAG上游引物：5'-Tag-TTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAG-3’；
GAG下游引物：5'-Tag-CYCTGCTTGCCCATACTATATGTT-3’；
GAG荧光探针：5'-HEX-ATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAG-BHQ1-3’；
RNase P上游引物：5'-Tag-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’；
RNase P下游引物：5'-Tag-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’；
RNase P荧光探针：5'-CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3'；
其中，FAM、HEX和CY5为荧光报告基团，BHQ1和BHQ2为荧光淬灭基团，LTR和GAG是所检测的HIV特异性靶基因，RNase P是人类核糖核酸酶P基因(管家基因)作为内控靶基因。
本发明关键在于特异性加尾引物和探针的设计，试剂盒内的其它组分为本领域常规用于PCR试剂，如dNTP mix、MgCl2、buffer、Taq酶等，本领域普通技术人员可根据常识进行选择，可自行配制，也可选用常见商品化产品。本发明所述PCR反应试剂包括：1×Ex TaqPCR Buffer，Mg2+，dNTP，Ex Taq和DNA模板。
本发明还提供一种所述艾滋病病毒多重荧光PCR检测试剂盒的检测方法，具体所述方法为：
(1)提取待测样品DNA：所述样品DNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。
(2)以待测样品DNA为模板，加入PCR反应试剂、标签引物Tag、LTR基因特异性引物和探针、GAG基因特异性引物和探针、RNase P内控靶基因引物和探针构成PCR反应体系，进行多重荧光PCR扩增反应；
(3)荧光PCR检测以Ct值﹤50并且扩增曲线呈S型为阳性判定原则；其中Ct值<40且扩增曲线呈S型可直接判定为阳性；Ct值在40～50之间需重复实验，两次实验均能得到S型扩增曲线方则判定为阳性；如果没有扩增曲线或无Ct值产生则判定为阴性。
所述多重荧光PCR扩增反应的条件为：94℃3min；94℃15s，52℃20s，72℃30s(检测FAM、HEX和CY5荧光)，共50个循环。
所述PCR反应体系为25μl，各成分终浓度为：1×Ex Taq PCR Buffer，2.5mmol/LMg2+，0.25mmol/L dNTP，0.04μmol/L LTR上游引物、0.04μmol/L LTR下游引物、0.04μmol/LGAG上游引物、0.04μmol/L GAG下游引物，0.01μmol/L RNaseP上游引物、0.01μmol/LRNaseP下游引物，0.4μmol/L标签引物Tag，0.16μmol/L LTR荧光探针，0.40μmol/L GAG荧光探针，0.32μmol/L RNase P荧光探针，1.5U Ex Taq，5.0μl DNA模板。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明试剂盒对艾滋病病病毒HIV前病毒DNA核酸的检测简便快速，具有高度的特异性和灵敏度，检出限可达20拷贝/反应；设计了内控基因的检测有利于监测PCR体系的正常运行，双色荧光探针设计能同时对HIV病毒的LTR基因和GAG基因进行检测避免漏检。针对多重PCR体系，特别设计同源加尾的序列，有利于显著抑制引物二聚体产生而提高检测灵敏度；该方法可直接从全血或外周血淋巴细胞富积液样本中检测HIV病毒核酸，从核酸提取到完成检测少于3.5小时，有利于HIV感染诊断尤其是HIV窗口期患者、HIV抗体不确定者、婴儿感染早期诊断等。
(四)附图说明
图1多重荧光PCR原理图，A为本发明所述多重荧光PCR检测流程图：加尾的特异性引物扩增目标片段，标签引物进一步扩增目标产物，特异性探针与目标片段结合产生荧光信号；B为加尾引物抑制引物二聚体产生的原理：加尾引物虽可形成二聚体，但其可形成“锅柄”状结构抑制下一步引物二聚体的进一步生成。
图2为多重荧光PCR检测LTR基因的灵敏度结果(FAM信号)。
图3为多重荧光PCR检测GAG基因的灵敏度结果(HEX信号)。
图4为多重荧光PCR检测HIV阳性感染者的典型结果。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
1材料与方法
1.1临床标本：
HIV感染者全血样本来自浙江省疾病预防控制中心所建立的艾滋病阳性样本库。
1.2引物与探针
从美国GenBank下载不同亚型的HIV参考株基因序列，用生物学软件进行同源性比较，基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针，序列为：
标签引物Tag：5'-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3'
LTR上游引物：5'-Tag-GCCTCAATAAAGCTTGCC-3’
LTR下游引物：5'-Tag-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3’
LTR荧光探针：5'-FAM-AAGTRGTGTGTGCCC-BHQ1-3'；
GAG上游引物：5'-Tag-TTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAG-3’
GAG下游引物：5'-Tag-CYCTGCTTGCCCATACTATATGTT-3’
GAG荧光探针：5'-HEX-ATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAG-BHQ1-3’
RNase P上游引物：5'-Tag-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’
RNase P下游引物：5'-Tag-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’
RNase P荧光探针：5'-CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3'
引物和探针委托上海生工生物工程有限公司合成。
1.3荧光PCR反应体系和条件的优化：
选用大连Takara公司的EX Taq酶及配套的dNTP、10×PCR buffer等组分，按说明书操作配置反应体系。针对荧光PCR反应体系主要对包括MgCl2浓度、各引物和探针的浓度、Taq酶用量等进行优化，针对反应程序主要对退火温度和时间、循环数等进行优化。
结果判断：荧光PCR检测以Ct值﹤50并且扩增曲线呈S型为阳性判定原则；其中Ct值<40且扩增曲线呈S型可直接判定为阳性；Ct值在40～50之间需重复实验，两次实验均能得到S型扩增曲线方则判定为阳性；如果没有扩增曲线或无Ct值产生则判定为阴性。
1.4荧光PCR特异性试验
用11例已知健康人的血样和98例已知HIV感染者血样，经提取DNA核酸后进行检测，以考察所建立新方法的特异性。由于HIV具有高度变异性，产生了许多具有独特基因序列特征的组、亚型和流行重组型(Circulating Recombinant Forms，CRFs)。为了考察本方法对于不同型别HIV的检测能力，用已定型的HIV核酸进行实验，包括56例CRF01_AE，13例CRF07_BC，11例CRF08_BC，15例B亚型，2例C亚型和1例G亚型。考察的已定型的HIV核酸涵盖绝大多数浙江省已检测发现的HIV毒株类型。
1.5荧光PCR敏感性试验
利用pTG19-T载体构建重组质粒作为检测模板，并经计算准确定量其拷贝数。分别在反应体系(同1.3)中加入对应拷贝数的检测模板1×107cps(copies，拷贝数)、1×106cps、1×105cps、1×104cps、1×103cps、500cps、100cps、50cps、10cps和1cps，以此考察(检测体系和程序采用1.3最终优化后的结果)检测体系的灵敏度。
根据检测需要在每个反应体系(同1.3，是在前面灵敏度的基础进一步考察精确的灵敏度(10-100cps/反应))加入10cps、20cps、40cps、50cps、60cps、80cps和100cps检测模板进一步考察(检测体系和程序采用1.3最终优化后的结果，结果发现最终检测灵敏度是20cps/反应)精确的灵敏度。所有的灵敏度实验均设置重复管以考察检测体系的重复性。
2结果
2.1荧光PCR反应体系及条件
通过对荧光PCR反应体系及程序的系列优化，最后构建的多重荧光PCR体系为25μl，各成分终浓度为：1×Ex Taq PCR Buffer，2.5mmol/L Mg2+，0.25mmol/L dNTP，0.04μmol/L LTR上下游引物和GAG上下游引物，0.01μmol/L RNaseP上下游引物，0.4μmol/L标签引物，0.16μmol/L LTR探针，0.40μmol/L GAG探针，0.32μmol/L RNase P探针，1.5U Ex Taq，5.0μl DNA模板。用ABI 7500 FAST荧光PCR仪按下列参数进行：94℃3min；94℃15s，52℃20s，72℃30s(检测荧光FAM、HEX和CY5)，50个循环。
2.2特异性试验
用98例已知HIV感染者(涵盖不同亚型)和11例已知健康人全血样本进行检测结果显示98例已知HIV感染者检测为阳性，11例已知健康人检测为阴性，说明本方法能准确区分HIV感染者和健康人，而且能检测不同亚型的HIV核酸，未出现假阴性现象。
2.3敏感性试验
通过对1cps～1×107cps的梯度浓度的质粒模板考查，结果本方法的检测灵敏度为10-50cps/反应，进一步细化的质粒模板梯度(10cps～100cps)检测下限为20cps/反应，典型结果如图2和图3。
2.4临床样本的检测
对HIV感染者的临床全血样本提取核酸后进行检测，结果能得到S型扩增曲线，典型结果见图3。

Claims (6)

1.一种艾滋病病毒多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括PCR反应试剂、标签引物Tag、LTR基因特异性引物和探针、GAG基因特异性引物和探针、RNase P内控靶基因引物和探针：
标签引物Tag：5'-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3'；
LTR上游引物：5'-Tag-GCCTCAATAAAGCTTGCC-3’；
LTR下游引物：5'-Tag-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3’；
LTR荧光探针：5'-FAM-AAGTRGTGTGTGCCC-BHQ1-3'；
GAG上游引物：5'-Tag-TTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAG-3’；
GAG下游引物：5'-Tag-CYCTGCTTGCCCATACTATATGTT-3’；
GAG荧光探针：5'-HEX-ATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAG-BHQ1-3’；RNase P上游引物：5'-Tag-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’；
RNase P下游引物：5'-Tag-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’；
RNase P荧光探针：5'-CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3'；
其中，FAM、HEX和CY5为荧光报告基团，BHQ1和BHQ2为荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述艾滋病病毒多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述PCR反应试剂包括：1×Ex Taq PCR Buffer，Mg2+，dNTP，Ex Taq和DNA模板。
3.如权利要求1所述艾滋病病毒多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述PCR反应试剂组成：1×Ex Taq PCR Buffer，2.5mmol/L Mg2+，0.25mmol/LdNTP，1.5U Ex Taq，5.0μlDNA模板。
4.一种权利要求1所述艾滋病病毒多重荧光PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述方法为：
(1)提取待测样品DNA；
(2)以待测样品DNA为模板，加入PCR反应试剂、标签引物Tag、LTR基因特异性引物和探针、GAG基因特异性引物和探针、RNase P内控靶基因引物和探针构成PCR反应体系，进行多重荧光PCR扩增反应；
(3)荧光PCR检测以Ct值﹤50并且扩增曲线呈S型为阳性判定原则；其中Ct值<40且扩增曲线呈S型可直接判定为阳性；Ct值在40～50之间需重复实验，两次实验均能得到S型扩增曲线方则判定为阳性；如果没有扩增曲线或无Ct值产生则判定为阴性。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述多重荧光PCR扩增反应的条件为：94℃3min；94℃15s，52℃20s，72℃30s，共50个循环。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述PCR反应体系为25μl，各成分终浓度为：1×Ex Taq PCR Buffer，2.5mmol/L Mg2+，0.25mmol/L dNTP，0.04μmol/L LTR上游引物、0.04μmol/L LTR下游引物、0.04μmol/L GAG上游引物、0.04μmol/L GAG下游引物，0.01μmol/LRNaseP上游引物、0.01μmol/L RNaseP下游引物，0.4μmol/L标签引物Tag，0.16μmol/L LTR荧光探针，0.40μmol/L GAG荧光探针，0.32μmol/L RNase P荧光探针，1.5U Ex Taq，5.0μlDNA模板。
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