CN107523648A - 一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒 - Google Patents

一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明揭露一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其包括两套引物探针，两套引物探针分别在LTR区、POL区的保守区域，所述两套引物探针序列分别为不同碱基数的上游引物、下游引物、探针。由于HIV基因组上两个待检的目的片段同时出现变异的几率非常低，从而降低了检测系统出现假阴性的几率。通过检测，两套引物探针同时发挥作用，与待检的目的片段结合并产生荧光，因此检测系统的灵敏度也相应提高。

Description

一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒
【技术领域】
本发明属于核酸检测的分子诊断技术领域，特别是涉及一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒。
【背景技术】
人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)属于反转录病毒科慢病毒属中的人类慢病毒组，是一种变异性很强的病毒，各基因的变异程度不同。HIV发生变异的主要原因包括反转录酶无校对功能导致的随机变异；宿主的免疫选择压力；病毒DNA与宿主DNA之间的基因重组；以及药物选择压力，其中不规范的抗病毒治疗是导致耐药性的重要原因。基因变异的结果直接可导致检测失败，造成假阴性的错误结果，或是定量不准确。本发明采用双靶检测，设计了两套用于检测HIV-1的引物探针，分别与不同的基因结合。由于HIV基因组上两个待检的目的片段同时出现变异的几率非常低，从而降低了检测系统出现假阴性的几率。
艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，其病原体为人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)，亦称艾滋病病毒。病毒载量一般用血浆中每毫升HIV RNA的拷贝数或每毫升国际单位(IU/mL)来表示。病毒载量测定的临床意义包括预测疾病进程、提供开始抗病毒治疗依据、评估治疗效果、指导治疗方案调整，也可作为HIV感染诊断的参考指标。
测定病毒载量的常用方法有反转录PCR(RT-PCR)、核酸序列依赖性扩增(NASBA)技术、分枝DNA信号放大系统(bDNA)和实时荧光定量PCR扩增技术(Real-time PCR)。其中实时荧光定量PCR扩增技术是较常用的方法。
实时荧光定量PCR扩增技术的原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。一般使用TaqMan探针或Sybr Green荧光染料。但Sybr Green染料不能区别目的产物和非目的产物，使结果有偏差，目前广泛使用的是TaqMan探针技术。
HIV有十分高的遗传变异率，它是一个多态性病毒，从不同的AIDS患者体内分离出的病毒结构表现出一定的差异，事实上，独立分离到的HIV-1和HIV-2彼此都不相同，这是由于病毒传播过程中突变、缺失或插入引起的，所以通常选择病毒基因组中高度保守区域作为目的基因进行扩增，才能有效地检测所有HIV。但是目前普通的实时荧光定量PCR扩增技术，仅采用一套引物探针较难扩增出所有的基因亚型，其后果是产生假阴性结果或各亚型间的定量不准确。
专利申请号为第CN201310009032.3号中国发明专利揭露了一种人类免疫缺陷病毒HIV核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括至少两套引物探针，且所述至少两套引物探针分别来自不同的保守区域。所述保守区域包括HIV基因的相对保守区：GAG、POL和LTR区。本发明设计组合两个不同区域的两套引物探针配制反应体系对HIV-1RNA进行联合检测以鉴别阳性反应的存在，有效降低了漏检的几率，能够更全面的覆盖所有亚型(包括HIV-1的M、N、O群的所有亚型)，并进一步提高检测灵敏度和更准确地定量，其检测灵敏度可达50IU/ml，定量线性范围为50～1.0×108IU/ml。本发明另外提供一种HIV核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括一套引物探针序列，所述引物探针序列选自LTR1、LTR2、GAG1、GAG2、POL1和POL2这两套中的任意一套。
【发明内容】
本发明的主要目的在于提供一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，以提高检测灵敏度和定量精准度。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其包括两套引物探针，两套引物探针分别在LTR区、POL区的保守区域，所述两套引物探针序列分别如下：
LTR区：
上游引物：5’-TTCGCCTGTACTGGGTCTCTCT-3’；
下游引物：5’-CACTCAAGGCAAGCTTTATTG-3’；
探针：5’-FAM-AGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCT-BHQ1-3’；
POL区：
上游引物：5’-TCAAAATTTTCGGGTTTATTACAG-3’；
下游引物：5’-GCCCCTTCACCTTTCCA-3’；
探针：5’-FAM-CAGAGACCCAATTTGGAAAGGACCAGC-BHQ1-3’。
具体的，所述检测试剂盒还包括如下溶液：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
具体的，其溶液按照浓度比为0.05-0.4mmol/L dATP、0.05-0.4mmol/L dCTP、0.05-0.4mmol/L dGTP、0.05-0.4mmol/L dTTP、0.05-0.4umol/LLTR区上游引物、0.05-0.4umol/L LTR区下游引物、0.01-0.25umol/LLTR区探针、0.05-0.4umol/L POL区上游引物、0.05-0.4umol/LPOL区下游引物、0.01-0.25umol/LPOL区探针的溶液混合。
具体的，其溶液按照终浓度为0.2mmol/L dATP、0.2mmol/L dCTP、0.2mmol/LdGTP、0.2mmol/L dTTP 0.2umol/LLTR区上游引物、0.2umol/L LTR区下游引物、0.05umol/LLTR区探针、0.2umol/L POL区上游引物、0.2umol/LPOL区下游引物、0.05umol/LPOL区探针的溶液混合。
相比现有技术，本发明人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒的有益效果在于：由于HIV基因组上两个待检的目的片段同时出现变异的几率非常低，从而降低了检测系统出现假阴性的几率。通过检测，两套引物探针同时发挥作用，与待检的目的片段结合并产生荧光，因此检测系统的灵敏度也相应提高。
【具体实施方式】
实施例一：
本发明为一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其具有两套引物探针，其引物探针设计方法如下：下载NCBI、HIV database公布的HIV-1序列，通过序列比对，在LTR区、POL区分别选取了保守区域，进行引物探针设计，两套引物探针序列分别如下：
LTR区：
上游引物02-F-27：5’-TTCGCCTGTACTGGGTCTCTCT-3’；
下游引物02-R-26：5’-CACTCAAGGCAAGCTTTATTG-3’；
探针02-P-12：5’-FAM-AGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCT-BHQ1-3’；
POL区：
上游引物02-F-11：5’-TCAAAATTTTCGGGTTTATTACAG-3’；
下游引物02-R-10：5’-GCCCCTTCACCTTTCCA-3’；
探针02-P-14：5’-FAM-CAGAGACCCAATTTGGAAAGGACCAGC-BHQ1-3’。
以上设计了两套用于检测HIV-1的引物探针，分别与不同的基因结合。由于HIV基因组上两个待检的目的片段同时出现变异的几率非常低，从而降低了检测系统出现假阴性的几率。
通过检测，两套引物探针同时发挥作用，与待检的目的片段结合并产生荧光，因此检测系统的灵敏度也相应提高。
通过荧光定量PCR方法实时检测，改变了传统的电泳终点检测，得到相应的S型扩增曲线，其不但可以进行定性检测，更重要的是可以进行定量检测。与常规相比，具有特异性强、自动化程度高、有效解决污染问题等特点，能够检测血浆中的病毒载量及血液中单个核细胞的前病毒载量。
实施例二：
本发明为一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其包括：dATP(三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸)，dCTP(三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸)，dGTP(三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸)及实施例一中的两套引物探针。
具体为如下方案(浓度)：
其中：
LTR区：
上游引物02-F-27：5’-TTCGCCTGTACTGGGTCTCTCT-3’；
下游引物02-R-26：5’-CACTCAAGGCAAGCTTTATTG-3’；
探针02-P-12：5’-FAM-AGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCT-BHQ1-3’；
POL区：
上游引物02-F-11：5’-TCAAAATTTTCGGGTTTATTACAG-3’；
下游引物02-R-10：5’-GCCCCTTCACCTTTCCA-3’；
探针02-P-14：5’-FAM-CAGAGACCCAATTTGGAAAGGACCAGC-BHQ1-3’。
如下为通过实验对上述检测试剂盒进行确认：
实验一：
第一步骤：提供含有HIV病毒的待测样本，并使用凯杰生物工程(深圳)有限公司生产的“核酸提取或纯化试剂”，进行自动化核酸提取和分液上样。
第二步骤：提供检测试剂，其包括终浓度(以加入催化酶和待测样本后的50uL体系计算)为1×RT-PCR Buffer溶液、0.2mmol/LdATP(三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸)、0.2mmol/LdCTP(三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸)、0.2mmol/LdGTP(三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸)、0.2mmol/LdTTP(三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸)、0.2umol/LLTR区上游引物、0.2umol/L LTR区下游引物、0.05umol/LLTR区探针、0.2umol/L POL区上游引物、0.2umol/LPOL区下游引物、0.05umol/LPOL区探针的溶液混合；
第三步骤：将催化酶(One Step Enzyme Mix)、含有HIV病毒的待测样本与第二步骤的溶液混合，形成50uL的混合溶液，其中待测样本30uL，含催化酶2uL。
第四步骤：将WHO标准品(NIBSC的HIV-1RNA 2nd International Standard,NIBSCcode:97/650)用阴性血浆或血清稀释为8个浓度梯度，分别为20IU/ml、40IU/ml、60IU/ml、80IU/ml、100IU/ml、200IU/ml、300IU/ml和400IU/ml，使用上述实验方法，每个浓度梯度样本各重复检测25次。
统计各浓度样本检出为阳性的数量，使用SPSS软件进行probit分析，计算出该系统的95％检出限为55IU/mL。其说明通过该含量的检测试剂盒能够精准的检测出阳性样本。
实验二：
收集临床确诊为艾滋病的病人血浆样本若干例，其中新鲜样本50例，冻存样本50例，使用上述实验一的实验方法进行检测。检测到其中病毒载量的结果为1.18e+0IU/mL----9.89e+7IU/mL，结果全部为阳性，无一漏检，证明本体系发生假阴性结果的几率较低。详细结果见下表。
实验三：
第一步骤：提供含有HIV病毒的待测样本，并使用凯杰生物工程(深圳)有限公司生产的“核酸提取或纯化试剂”，进行自动化核酸提取和分液上样。
第二步骤：提供检测试剂，其包括终浓度(以加入催化酶和待测样本后的50uL体系计算)为1×RT-PCR Buffer溶液、0.05mmol/L dATP(三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸)，0.05mmol/L dCTP(三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸)，0.05mmol/L dGTP(三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸)、0.05mmol/L dTTP(三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸)、0.05umol/L LTR区上游引物，0.05umol/LLTR区下游引物，0.01umol/LLTR区探针，0.05umol/L POL区上游引物，0.05umol/LPOL区下游引物，0.01umol/LPOL区探针的溶液混合；
第三步骤：催化酶(One Step Enzyme Mix)、含有HIV病毒的待测样本与第二步骤的溶液混合，形成50uL的混合溶液，其中待测样本30uL，含催化酶2uL。
第四步骤：将WHO标准品(NIBSC的HIV-1RNA 2nd International Standard,NIBSCcode:97/650)用阴性血浆或血清稀释为8个浓度梯度，分别为20IU/ml、40IU/ml、60IU/ml、80IU/ml、100IU/ml、200IU/ml、300IU/ml和400IU/ml，使用上述实验方法，每个浓度梯度样本各重复检测25次。
统计各浓度样本检出为阳性的数量，使用SPSS软件进行probit分析，计算出该系统的95％检出限为103.6IU/mL。其说明通过该含量的检测试剂能够精准的检测出阳性样本。
实验四：
第一步骤：提供含有HIV病毒的待测样本，并使用凯杰生物工程(深圳)有限公司生产的“核酸提取或纯化试剂”，进行自动化核酸提取和分液上样。
第二步骤：提供检测试剂盒，其包括终浓度(以加入催化酶和待测样本后的50uL体系计算)为1×RT-PCR Buffer溶液、0.4mmol/L dATP(三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸)，0.4mmol/L dCTP(三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸)，0.4mmol/L dGTP(三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸)、0.4mmol/L dTTP(三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸)、0.4umol/LLTR区上游引物，0.4umol/L LTR区下游引物，0.25umol/LLTR区探针，0.4umol/L POL区上游引物，0.4umol/LPOL区下游引物，0.25umol/LPOL区探针的溶液混合；
第三步骤：催化酶(One Step Enzyme Mix)、含有HIV病毒的待测样本与第二步骤的溶液混合，形成50uL的混合溶液，其中待测样本30uL，含催化酶2uL L。
第四步骤：将WHO标准品(NIBSC的HIV-1RNA 2nd International Standard,NIBSCcode:97/650)用阴性血浆或血清稀释为8个浓度梯度，分别为20IU/ml、40IU/ml、60IU/ml、80IU/ml、100IU/ml、200IU/ml、300IU/ml和400IU/ml，使用上述实验方法，每个浓度梯度样本各重复检测25次。
统计各浓度样本检出为阳性的数量，使用SPSS软件进行probit分析，计算出该系统的95％检出限为162IU/mL。其说明通过该含量的检测试剂能够精准的检测出阳性样本。
由上述两个实验可以表明，通过本发明的检测试剂盒检测HIV病毒非常精准，其检测的准确性相比现有的检测方法更高。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其包括两套引物探针，其特征在于：所述两套引物探针分别在LTR区、POL区的保守区域，所述两套引物探针序列分别如下：
LTR区：
上游引物：5’-TTCGCCTGTACTGGGTCTCTCT-3’；
下游引物：5’-CACTCAAGGCAAGCTTTATTG-3’；
探针：5’-FAM-AGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCT-BHQ1-3’；
POL区：
上游引物：5’-TCAAAATTTTCGGGTTTATTACAG-3’；
下游引物：5’-GCCCCTTCACCTTTCCA-3’；
探针：5’-FAM-CAGAGACCCAATTTGGAAAGGACCAGC-BHQ1-3’。
2.如权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括如下溶液：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
3.如权利要求2所述的人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于：其溶液按照浓度比为0.05-0.4mmol/L dATP、0.05-0.4mmol/L dCTP、0.05-0.4mmol/L dGTP、0.05-0.4mmol/L dTTP、0.05-0.4umol/LLTR区上游引物、0.05-0.4umol/L LTR区下游引物、0.01-0.25umol/LLTR区探针、0.05-0.4umol/L POL区上游引物、0.05-0.4umol/LPOL区下游引物、0.01-0.25umol/LPOL区探针的溶液混合。
4.如权利要求3所述的人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于：其溶液按照终浓度为0.2mmol/L dATP、0.2mmol/L dCTP、0.2mmol/L dGTP、0.2mmol/L dTTP、0.2umol/LLTR区上游引物、0.2umol/L LTR区下游引物、0.05umol/LLTR区探针、0.2umol/LPOL区上游引物、0.2umol/LPOL区下游引物、0.05umol/LPOL区探针的溶液混合。
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