CN110023514A - 检测慢病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开基于检测和定量生物样品中慢病毒(人类免疫缺陷病毒,HIV‑1或HIV‑2)DNA和RNA的方法。
Description
相关申请数据
本申请要求2016年9月7日提交的题为“检测慢病毒的方法”的澳大利亚专利申请第2016903599号的优先权。该专利申请的全部内容在此通过引用并入。
序列表
本申请连同电子格式的序列表一起被提交。序列表的全部内容在此通过引用并入。
公开领域
本公开内容基于检测和定量生物样品中慢病毒(人类免疫缺陷病毒,HIV-1或HIV-2)DNA和RNA的方法。
背景
人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种引起HIV感染的慢病毒,随着时间的推移是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体。HIV属于逆转录病毒科病毒,并且有两种类型的HIV已被表征:HIV-1和HIV-2。HIV-1毒性更强,并因此是更具传染性的病毒,是全球大多数感染的原因。
HIV以单链、正义、包膜的RNA病毒(ssRNA)传播。HIV的主要目标是CD4+ T细胞、巨噬细胞和树突细胞。HIV病毒粒子通过其表面的糖蛋白吸附到在靶细胞上的受体,然后病毒包膜与细胞膜融合,并且HIV衣壳释放到细胞中,从而进入靶细胞。一进入靶细胞,含有病毒基因组的核衣壳解离,将病毒的内容物,包括ssRNA,释放到细胞质中。病毒RNA基因组被病毒编码的逆转录酶(RT)逆转录成双链DNA。然后,产生的病毒DNA被导入细胞核,并通过病毒编码的整合酶整合到细胞DNA中。
整合的HIV DNA两侧有相同的5’和3’长末端重复(LTR)序列,HIV可以从这些序列开始整合的HIV基因组的转录。整合的病毒DNA可能处于休眠状态,处于HIV感染的潜伏阶段或者病毒DNA可能被转录,产生新的RNA基因组和病毒蛋白,这些RNA基因组和病毒蛋白被包装并作为新的病毒颗粒从细胞中释放出来。
检测HIV的主要测试是检测HIV-1抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)。如果收到阳性测试结果,通常会进行蛋白质印迹测试来确认诊断。
HIV感染的治疗包括联合抗逆转录病毒疗法(cART),它发挥抑制HIV复制的作用。cART的主要目标是将血浆病毒载量抑制在不可检测的水平(<每毫升50个拷贝),而同时保持免疫系统的功能和预防机会性感染。血浆病毒载量(pVL)监测是目前对cART治疗的响应的最重要预测因素。高于每毫升200个拷贝的水平被认为是病毒学上失败的。虽然cART降低了感染的程度,但是残留病毒形成了一个病毒储库,它存在于长寿命的静息性T细胞和基于组织的巨噬细胞中。在绝大多数患者中,ART停止后,pVL水平通常在几周内迅速反弹。目前还没有可靠的测定来监测和评估用于HIV感染患者的ART的治疗结果。虽然pVL和CD4+细胞数量在患者护理中仍然起着重要作用,但是这些标志物对监测活化的HIV感染不够灵敏。
因此,本领域需要开发可以检测和定量HIV DNA和RNA,特别是潜伏感染的储库中的HIV转录的更灵敏的测定,以指导抗逆转录病毒治疗的改进。
公开概述
本公开内容基于检测和定量生物样品中慢病毒(人类免疫缺陷病毒,HIV-1或HIV-2)DNA和RNA的方法。特别地,本公开内容基于这样的发现,即当进行HIV DNA和HIV RNA两者的检测时,获得了对HIV感染的受试者中慢病毒感染的更灵敏的检测。发明人已经开发了与现有技术方法相比,提供了对HIV-1或HIV-2 DNA和RNA的更灵敏的检测的基于PCR的测定。此外,发明人已经开发了一种基于PCR的方法,其用于检测和定量HIV DNA和RNA,其中现有的测定不能检测HIV DNA或RNA。
目前诊断实验室中检测和定量HIV的方法依赖于检测HIV血浆病毒载量(VL)(血浆中HIV RNA拷贝数)。该测定能够定量患者血浆中的HIV RNA拷贝数,以评估抗逆转录病毒疗法(ART)治疗受感染患者的疗效。这种pVL的经典标志物仍然发挥着重要作用,但是这种测定不够灵敏,不足以充分识别接受最优抗逆转录病毒治疗(ART)的患者,患者因此容易复发。
本公开内容有利地提供了基于慢病毒基因组(例如HIV基因组)的长末端重复(LTR)内R区域扩增的高度特异性和灵敏性的方法。5’LTR和3’LTR区域由三个子区域组成,即U3、R和U5,并且当病毒整合到宿主细胞基因组中时,5’LTR和3’LTR都存在。特别地,发明人已经发现,与R区域检测相比,专注于靶向3’LTR、pol或gag的现有技术策略不太灵敏,因为在病毒基因组中3’LTR、pol或gag仅以单拷贝存在,而R区域在转录的病毒mRNA以及人类基因组中整合的病毒HIV DNA中以两个拷贝存在。因此,本公开内容的方法基于患有或怀疑患有HIV感染的受试者中HIV-1或HIV-2的RNA和DNA两者内的R区域检测。因此,本方法为临床医生提供了受试者中HIV DNA水平以及受试者中潜伏感染的储库细胞(通常是CD4+ T细胞和单核细胞/巨噬细胞)中HIV转录水平(RNA)的知识,以更准确地指导抗逆转录病毒疗法的适当治疗。
本公开内容提供了一种在具有人类免疫缺陷病毒(HIV)的受试者或怀疑患有HIV感染(获得性免疫缺陷综合征,AIDS)的受试者中检测HIV的方法,该方法包括对从受试者获得的生物样品中的R区域核酸进行PCR扩增,其中该扩增包括与HIV的长末端重复(LTR)的R区域内的序列杂交的正向引物和反向引物,和随后检测任何扩增,其中检测到扩增表明在该受试者中存在HIV。
优选地,检测扩增是用被标记的寡核苷酸探针来执行,该被标记的寡核苷酸探针与被扩增的R区域序列内的序列杂交。
在一个实例中,核酸是DNA或逆转录的RNA。
在一个实例中,HIV是HIV-1或HIV-2。
在一个实例中,PCR扩增是实时PCR或终点PCR。在另一个实例中,PCR扩增是实时定量PCR。
在一个实例中,检测方法还包含被标记的寡核苷酸探针。在另一个实例中,寡核苷酸探针与HIV的长末端重复(LTR)的R区域内的序列结合。在另一个实例中,寡核苷酸探针是水解探针。在另一个实例中,探针是探针。在另一个实例中,寡核苷酸探针是被荧光标记的杂交探针。在某些实例中,探针可包含一种或更多种锁核酸。
在一个实例中,该方法还包括:
(i)获得其中已经提取了DNA(或逆转录的RNA)的样品的等分试样;
(ii)将等分试样与被标记的水解寡核苷酸探针接触,该被标记的水解寡核苷酸探针与HIV DNA的长末端重复(LTR)的R区域序列杂交;
(iii)将等分试样与正向引物和反向引物接触,所述正向引物和反向引物与R区域序列内的序列杂交;
(iv)通过PCR扩增R区域序列。
本公开内容还提供了一种定量来自具有HIV的受试者或怀疑患有HIV感染的受试者的生物样品中的HIV DNA拷贝数的方法,该方法包括:
(i)如本文所述扩增和检测HIV-R区域序列;和
(ii)通过参考相应的HIV质粒标准物对被扩增的HIV-R区域序列进行定量,以获得每体积样品中HIV DNA的HIV-R区域拷贝数。
在一个实例中,扩增是实时PCR。在另一个实例中,扩增是终点PCR。
在一个实例中,该方法还包含针对DNA标准物归一化HIV DNA拷贝数,以获得生物样品中每一个或更多个细胞的HIV DNA拷贝数。
本公开内容还提供了一种通过针对标准物归一化来定量来自具有HIV的受试者或怀疑患有HIV感染的受试者的生物样品中的HIV DNA拷贝数的方法,该方法包括:
(i)如本文所述扩增和检测HIV-R区域序列;
(ii)通过参考相应的HIV标准物,经由定量PCR来定量样品中每体积DNA的HIV-R区域拷贝数;
(iii)使用相应的管家标准物通过定量PCR来定量内源性管家基因,以获得内源性基因的拷贝数,该内源性基因的拷贝数表示为样品中存在的每体积DNA的管家基因拷贝数;
(iv)将获得的拷贝数除以细胞中内源性基因的拷贝数,以得出样品中每体积DNA的细胞数;和
(v)通过将(i)中获得的值除以(iii)中获得的值来计算每个细胞的HIV-R区域DNA拷贝数,从而归一化HIV DNA拷贝数,以获得生物样品中的HIV-R区域DNA拷贝数(拷贝数/细胞)。
在一个实例中,DNA标准物是肌动蛋白。
在一个实例中,定量PCR是实时PCR。
在另一个实例中,HIV DNA拷贝数表示为HIV R区域拷贝数/106细胞。
或者,样品中HIV DNA拷贝数的定量可以通过测量样品中DNA的吸光度来获得。
本公开内容还提供了一种用于定量来自具有HIV的受试者或怀疑患有HIV感染的受试者的生物样品中的HIV DNA拷贝数的方法,该方法包括:
(i)如本文所述扩增和检测HIV-R区域序列;
(ii)通过测量样品中DNA的吸光度来定量样品中每体积的DNA质量(w/v);
(iii)基于DNA吸光度计算样品中每体积DNA的细胞数;和
(v)通过将(ii)中获得的值除以(iv)中获得的值来计算每个细胞的HIV-R区域DNA拷贝数,从而归一化HIV DNA拷贝数,以获得生物样品中的HIV-R区域DNA拷贝数(拷贝数/细胞)。
在一个实例中,定量样品中每体积DNA质量的方法可选地包括添加DNA嵌入染料并测量染料发出的荧光。在一个实例中,DNA嵌入染料选自SyBr Green I、Syto-9、Syto-10-14、Syto-16、Syto-21、Syto-24、Syto-29、YoYo-1、YoYo-3和ToTo-1。
在一个实例中,HIV DNA拷贝数表示为HIV R区域拷贝数/106个细胞。
在一个实例中,如在本文描述的方法可能还包括
(i)获得其中已提取了DNA样品的等分试样;
(ii)将等分试样与被标记的水解寡核苷酸探针接触,该探针与HIV DNA的长末端重复(LTR)的R区域序列杂交;
(iii)将等分试样与正向引物和反向引物接触,所述正向引物和反向引物与R区域序列内的序列杂交;
(iv)通过PCR扩增R区域序列;
(v)将从被标记的寡核苷酸获得的信号外推至通过HIV标准物的系列稀释物的相应扩增获得的标准曲线,以得出等分试样中每体积DNA的HIV-R区域DNA拷贝数。
在一个实例中,PCR是实时PCR或终点PCR。
在一个实例中,寡核苷酸是水解寡核苷酸探针(例如探针)。在一个实例中,寡核苷酸是被荧光标记的杂交探针。
在一个实例中,正向引物和反向引物分别与寡核苷酸结合的R区域序列的上游和下游的R区域序列结合。
在某些实例中,PCR扩增通过终点PCR进行。在一个实例中,正向引物或反向引物被标记。在一个实例中,正向引物或反向引物被标记(例如用生物素)。在一个实例中,寡核苷酸探针被用地高辛(Dig)标记。
在一个实例中,正向引物包含根据以下的序列或由根据以下的序列组成:SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35。
在一个实例中,反向引物包含根据以下的序列或由根据以下的序列组成:SEQ IDNO:30,SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36。
在一个实例中,被标记的探针包含根据以下的序列或由根据以下的序列组成:SEQID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQID NO:49,或SEQ ID NO:51。
本文描述的用于定量DNA的方法可用于监测正在向HIV阳性受试者施用的抗逆转录病毒疗法(ART)。因此,本公开内容还提供了一种用于监测正在向HIV阳性受试者施用的抗逆转录病毒疗法(ART)的方法,所述方法包括在至少两个时间点上如本文所述定量HIVDNA拷贝数,并比较至少两个时间点之间的HIV DNA拷贝数差异,其中HIV DNA拷贝数的减少表明受试者正在接受最优/有效的ART。
生物样品可以在受试者生命中的多个时间点上获得,包括但不限于三、四、五、六、八、十、十二、十五、二十、二十五、三十、三十五、四十等次。在另一个实例中,至少两个时间点之间的时间段是天、周或月。在另一个实例中,至少两个时间点之间的时间段是1周、2周、1个月、3个月、4个月、6个月、8个月或12个月。
在另一个实例中,在时间点之间至少50%、至少45%、至少40%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%、至少15%、至少12%、至少10%、至少8%或至少5%的减少表明受试者正在接受最优/有效ART。
在另一个实例中,每106个细胞中大约800个或更少的HIV DNA拷贝数表明受试者正在接受最优/有效的ART。在另一个实例中,生物样品中每106个细胞中约80或更少,或约8或更少拷贝的HIV R区域DNA的HIV DNA拷贝数,表明受试者正在接受最优/有效的ART。
在另一个实例中,该方法包括调节向受试者施用的ART的剂量或类型。例如,调节ART的类型可能包括在联合治疗中用一种抗逆转录病毒药物替代另一种药物,或者将联合治疗替代为另一种联合治疗。
本公开内容还提供了一种用于定量来自具有HIV的受试者或怀疑患有HIV感染的受试者的生物样品中的HIV RNA拷贝数的方法,该方法包括:
(i)如本文所述扩增和检测逆转录的HIV RNA R区域序列上的HIV-R区域序列;和
(ii)通过参考相应的HIV质粒标准物对被扩增的HIV-R区域序列进行定量,以获得每体积样品HIV RNA的拷贝数。
在一个实例中,扩增是实时PCR或终点PCR。
在一个实例中,该方法还包括针对RNA标准物归一化HIV RNA拷贝数,以获得生物样品中每一个或更多个细胞的HIV RNA拷贝数。
本公开内容还提供了一种通过针对标准物归一化来定量来自具有HIV的受试者或怀疑患有HIV感染的受试者的生物样品中的HIV RNA拷贝数(即转录活性)的方法,该方法包括:
(i)如本文所述扩增和检测逆转录的HIV RNA R区域序列上的HIV-R区域序列;
(ii)通过参考相应的HIV标准物,经由定量PCR来定量样品中每体积RNA的HIV-R区域拷贝数;
(iii)使用相应的管家标准物通过定量PCR来定量内源性管家基因,以获得内源性基因的拷贝数,该内源性基因的拷贝数表示为样品中存在的每体积RNA的管家基因拷贝数;
(iv)将获得的拷贝数除以细胞中内源性基因的拷贝数,以得到样品中每体积RNA的细胞数;和
(v)通过将(i)中获得的值除以(iii)中获得的值来计算每个细胞的HIV-R区域RNA拷贝数,从而归一化HIV RNA拷贝数,以获得生物样品中的HIV-R区域RNA拷贝数(拷贝数/细胞)。
在一个实例中,RNA标准物是GAPDH。
在一个实例中,该方法还包含从受试者获得生物样品,并从样品制备RNA。
在一个实例中,HIV RNA拷贝数表示为HIV R区域拷贝数/106个细胞。
在另一个实例中,管家标准物通过实时PCR扩增。在另一个实例中,管家标准物与内源性基因相同。基于扩增标准物的系列稀释物生成标准曲线的方法对本领域技术人员来说是已知的。例如,管家标准物被连续稀释以提供1、20、200、2000、20,000、2x105和2x106拷贝/μl。
可替代地,定量样品中RNA的方法基于测量样品中RNA的吸光度。
本公开内容还提供了一种用于定量来自具有HIV的受试者或怀疑患有HIV感染的受试者的生物样品中的HIV RNA拷贝数的方法,该方法包括:
(i)如本文所述扩增和检测逆转录的HIV RNA R区域序列上的HIV-R区域序列;
(ii)通过测量样品中RNA的吸光度来定量样品中每体积RNA的质量(w/v);
(iii)基于RNA吸光度计算样品中每体积RNA的细胞数;和
(iv)通过将(ii)中获得的值除以(iv)中获得的值来计算每个细胞的HIV-R区域RNA拷贝数,从而归一化HIV RNA拷贝数,以获得生物样品中的HIV-R区域RNA拷贝数(拷贝数/细胞)。
在一个实例中,定量样品中每体积RNA的质量包括RNA嵌入染料,并测量染料发出的荧光。
在一个实例中,RNA拷贝数表示为HIV-R区域拷贝数/106个细胞。
在另一个实例中,定量样品中每体积RNA质量的方法包括添加RNA嵌入染料并测量染料发出的荧光。在一个实例中,RNA嵌入染料选自SyBr Green II,Syto RNA选择绿色荧光(Syto RNA select green-fluorescent)和ToTo-1。
本领域技术人员将理解,定量样品中每体积DNA或RNA质量的方法在本领域是已知的。例如,这种方法包括但不限于Qubit(Thermo Fisher)、Nanodrop(ThermoFisher)和QuantideX(Asuragen)。
在一个实例中,HIV-R区域通过以下方式被定量:
(i)获得样品的等分试样,其中RNA已经被提取;
(ii)将等分试样与被标记的水解寡核苷酸探针接触,该探针与逆转录的HIV RNA(cDNA)的长末端重复(LTR)的R区域序列杂交;
(iii)进一步将等分试样与正向引物和反向引物接触,所述正向引物和反向引物与逆转录的HIV RNA(cDNA)的R区域内的序列杂交;
(iv)通过PCR扩增R区域序列;
(v)将从被标记的寡核苷酸获得的信号外推至通过HIV标准物的系列稀释物的相应扩增获得的标准曲线,以得出等分试样中每体积RNA的HIV-R区域RNA拷贝数。
在一个实例中,正向引物和反向引物分别与寡核苷酸结合的R区域序列的上游和下游的R区域序列结合。
在一个实例中,该方法还包括从受试者获得生物样品,并从样品制备RNA。在一个实例中,管家标准物通过实时PCR扩增。在另一个实例中,管家标准物与内源性基因相同。
本公开内容还提供了一种用于评估向HIV阳性受试者施用的抗逆转录病毒疗法(ART)的有效性的方法,该方法包括:
(i)如本文所述定量HIV-R区域DNA拷贝数;
(ii)如本文所述定量HIV-R区域RNA拷贝数;
(iii)通过将步骤(i)中获得的值除以步骤(ii)中获得的值,确定从受试者获得的样品中归一化的HIV RNA拷贝数;和
(iv)将归一化的HIV RNA拷贝数值与从同一受试者获得的一个或更多个先前的归一化值进行比较;
其中归一化的HIV RNA拷贝数的减少表明受试者正在接受最优/有效的ART。
在一个实例中,定量HIV-R区域DNA或RNA拷贝数是根据本文所述的方法或本领域已知的方法。
在一个实例中,该方法还包括从受试者获得生物样品,并从样品制备DNA和RNA。
这里描述的HIV DNA拷贝数或HIV RNA拷贝数可以表示为每1,000,000个细胞(106个)的拷贝数,即拷贝数/106个细胞。在一个实例中,HIV RNA拷贝数表示为任何固定数量细胞的值,包含但不限于1.5×106、2×106、2.5×106或3×106细胞。
在一个实例中,体积被表示为μl或ml。
上述方法优选在聚合酶链式反应(PCR)管中进行。
生物样品可以是选自血液或组织或其中存在慢病毒感染细胞的任何其他生物流体的细胞群体。生物样品可能是全血、血浆或外周血单核细胞(PBMC),或者富集CD4+ T细胞和单核细胞/巨噬细胞的分选样品,或者使用磁珠富集细胞群体子集(例如CD4+ T细胞和单核细胞/巨噬细胞)的分离样品。生物样品还可能包含源自全血或PBMC的DNA或RNA。PBMC可能被用Ficoll或Ficoll-Paque从全血中分离出来。在一个实例中,生物样品从受试者中获得。在一个实例中,受试者是人类或者灵长类。
本领域技术人员将理解,慢病毒/HIV核酸的5’LTR和3’LTR内的序列的R区域将通过前述方法扩增。在一个实例中,被扩增的R区域序列是被包含在由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2内列出的序列而组成的序列中的序列。在一个实例中,R区域序列由SEQ ID NO:1或SEQID NO:2中列出的序列组成。
在另一个实例中,管家标准物可能选自由甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(beta actin)(β-肌动蛋白(β-actin))、β-2微球蛋白(B2M)、肽基脯氨酰异构酶A(PPIA)、真核翻译延伸因子1γ(EEF1γ)、琥珀酸脱氢酶复合物亚单位A(SDHA)、羟甲基-二烷合酶(HMBS)、18s核糖体RNA(18s rRNA)和磷酸甘油酸激酶1(PGK 1)组成的组。
在一个实例中,HIV DNA的管家基因和管家标准物是β-肌动蛋白。在另一个实例中,HIV RNA的管家基因和管家标准物是GAPDH。
在一个实例中,样品中的细胞数量通过在DNA提取后测量DNA质量来确定。在另一个实例中,DNA质量通过分光光度计在260nm处的吸光度来估测。在一个实例中,样品中的细胞数量通过在RNA提取后测量RNA质量来确定。在另一个实例中,RNA量通过分光光度计在260nm处的吸光度来估测。
在一个实例中,样品中的细胞数量通过在DNA提取后测量DNA质量来确定。在另一个实例中,通过测量DNA嵌入染料发出的荧光来估测DNA质量;在一个实例中,样品中的细胞数量通过在RNA提取后测量RNA质量来确定。在另一个实例中,通过测量RNA嵌入染料发出的荧光来估测RNA量。
在一个实例中,被标记的寡核苷酸或水解寡核苷酸是探针。探针包含共价连接到寡核苷酸探针5’端的荧光团和3’端的猝灭剂,用于实时PCR定量。在一个实例中,荧光团选自由羟基香豆素、甲氧基香豆素、Alexa fluor、氨基香豆素、Cy2、Alexa fluor 488、430、532、546、555、594、633、660、680FITC、TRITC、PE、LCCyan500、FAM、TET、JOE、Yakima Yellow、HEX、Cy3、TAMARA、ROX、Texas Red、LC Red610、LCRed640、Cy5、Cy5.5、Cy7和IRD700组成的组。在一个实例中,猝灭剂选自由BHQ-1、BHQ-2、IBRQ、IBFQ组成的组。在一个实例中,探针是双猝灭剂。在另一个实例中,探针是双猝灭剂,包含与IBRQ、IBFQ猝灭剂组合的ZENTM内部猝灭剂。
在一个实例中,根据本文所述的任何方法,寡核苷酸与以下序列结合:包含位于SEQ ID NO:1列出的HIV-1 R区域序列中的约13至40个连续核苷酸或与所述序列至少70%相同的序列,或由位于SEQ ID NO:1列出的HIV-1 R区域序列中的约13至40个连续核苷酸或与所述序列至少70%相同的序列组成的序列。在另一个实例中,寡核苷酸与SEQ ID NO:1中列出的序列至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同的序列结合。
在一个实例中,根据本文所述的任何方法,寡核苷酸与以下序列结合:包含序列5’TAAGCAGTGGGTTCCCT 3’(SEQ ID NO:3)或与其至少70%相同的序列,或由序列5’TAAGCAGTGGGTTCCCT 3’(SEQ ID NO:3)或与其至少70%相同的序列组成的序列。在另一个实例中,寡核苷酸与和SEQ ID NO:3中列出的序列至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同的序列结合。
在另一个实例中,寡核苷酸包含序列5’AGGGAACCCACTGCTTA3’(SEQ ID NO:4)或由序列5’AGGGAACCCACTGCTTA 3’(SEQ ID NO:4)组成。在另一个实例中,寡核苷酸包含序列X-AGGGAACCCACTGCTTA-Z(SEQ ID NO:5)或由序列X-AGGGAACCCACTGCTTA-Z(SEQ ID NO:5)组成,其中X是报告分子,Z是猝灭分子,并且该序列任选包含至少一个锁核酸(LNA)。在另一个实例中,X是FAM(羧基荧光素),并且Z是BHQ-1。在另一个实例中,寡核苷酸包含1个和6个之间的LNA、2个和5个之间的LNA或2个和4个之间的LNA。在另一个实例中,寡核苷酸包含序列FAM-AGGLNAGALNAACLNACCACLNATGLNACTTA-BHQ-1(SEQ ID NO:6)或由序列FAM-AGGLNAGALNAACLNACCACLNATGLNACTTA-BHQ-1(SEQ ID NO:6)组成,其中X是报告分子,Z是猝灭分子,和LNA是锁核酸。为了清楚起见,锁核酸在本文中被称为NLNA,其中N是所示的A、T、C或G核碱基。
本领域技术人员将理解LNA修饰不限于上述位置,且LNA修饰的位置数量将被确定为提高特异性并减少实时PCR测定的背景。
在一个实例中,HIV-1正向引物包含序列5’GAGCCTGGGAGCTCTCTG 3’(SEQ ID NO:7)或与其至少75%相同的序列,或由序列5’GAGCCTGGGAGCTCTCTG 3’(SEQ ID NO:7)或与其至少75%相同的序列组成。在另一个实例中,正向引物包含以下序列或由以下序列组成:与SEQ ID NO:7中列出的序列至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同的序列。
在一个实例中,正向引物与以下序列杂交:包含序列5’-CAGAGAGCTCCCAGGCTC-3’(SEQ ID NO:8)或与其至少75%相同的序列,或由序列5’-CAGAGAGCTCCCAGGCTC-3’(SEQ IDNO:8)或与其至少75%相同的序列组成的HIV-1 R区域序列。在另一个实例中,正向引物与包含以下序列或由以下序列组成的序列杂交:包含与SEQ ID NO:8中列出的序列至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同的序列。
在一个实例中,反向引物包含序列5’ACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGC 3’(SEQ ID NO:9)与其至少75%相同的序列,或由序列5’ACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGC 3’(SEQ ID NO:9)与其至少75%相同的序列组成。在另一个实例中,反向引物包含以下序列或由以下序列组成:与SEQ ID NO:9中列出的序列至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同的序列。
在一个实例中,反向引物与HIV-1 R区域序列杂交,该HIV-1 R区域序列包含序列5’GCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGT 3’(SEQ ID NO:10)或与其至少75%相同的序列,或由序列5’GCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGT 3’(SEQ ID NO:10)或与其至少75%相同的序列组成。在另一个实例中,反向引物包含以下序列或由以下序列组成:与SEQ ID NO:10中列出的序列至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。
在另一个实例中,正向引物包含序列5’GAGCCTGGGAGCTCTCTG3’(SEQ ID NO:7)或由其组成,并且反向引物包含序列5’ACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGC 3’(SEQ ID NO:9)或由其组成。
在另一个实例中,寡核苷酸与以下序列结合:包含位于SEQ ID NO:2中列出的HIV-2 R区域序列内的约13至40个连续核苷酸或与该连续核苷酸至少70%相同的序列,或由位于SEQ ID NO:2中列出的HIV-2 R区域序列内的约13至40个连续核苷酸或与该连续核苷酸至少70%相同的序列组成的序列。在另一个实例中,寡核苷酸与和SEQ ID NO:2中列出的序列至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同的序列结合。
在另一个实例中,寡核苷酸与以下序列结合:包含序列5’GCCTGGGTGTTCCCTGCTAGACTCT 3’(SEQ ID NO:11)或与其至少70%相同的序列或由序列5’GCCTGGGTGTTCCCTGCTAGACTCT 3’(SEQ ID NO:11)或与其至少70%相同的序列组成的序列。在另一个实例中,寡核苷酸与和SEQ ID NO:11中列出的序列至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同的序列结合。
在另一个实例中,寡核苷酸包含序列5’AGAGTCTAGCAGGGAACACCCAGGC 3’(SEQ IDNO:12),或由其组成。在另一个实例中,寡核苷酸包含序列X-GCCTGGGTGTTCCCTGCTAGACTCT-Z(SEQ ID NO:13)或由其组成,其中X是报告分子,Z是猝灭分子。在另一个实例中,X是FAM(羧基荧光素),并且Z是BHQ-1。
在一个实例中,HIV-2正向引物包含以下或由其组成或:序列SEQ ID NO:14、SEQID NO:31、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35或与其至少75%相同的序列。在另一个实例中,正向引物包含以下或由其组成:与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35至少75%、至少80%、至少82%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同的序列。
在一个实例中,正向引物与以下序列杂交:包含序列5’-GAGAACCTCCCAGGGCTC-3’(SEQ ID NO:15)或与其至少75%相同的序列,或由序列5’-GAGAACCTCCCAGGGCTC-3’(SEQID NO:15)或与其至少75%相同组成的HIV-2 R区域序列。在另一个实例中,正向引物与包含以下序列或由以下序列组成的序列杂交:与SEQ ID NO:15中列出的序列至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同的序列。
在一个实例中,HIV-2反向引物包含以下序列或由以下序列组成:序列SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36或与其至少75%相同的序列。在另一个实例中,反向引物包含以下序列或由以下序列组成:与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:34或SEQ ID NO:36中列出的序列至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同的序列。
在另一个实例中,正向引物包含以下或由以下组成:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33或SEQ ID No:35,并且反向引物包含以下或由以下组成:SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36。
本公开提供了一种用于扩增HIV-1核酸的组合物,所述组合物包含被标记的寡核苷酸探针,所述被标记的寡核苷酸探针包含探针、正向引物和反向引物的组合或由探针、正向引物和反向引物的组合组成,所述组合选自以下的一种或更多种的组合:
(i)寡核苷酸探针:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:45、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、或SEQ ID NO:48;
(ii)正向引物:SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:29;和
(iii)反向引物:SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:30。
本发明还提供了一种用于扩增HIV-2核酸的组合物,其包含被标记的寡核苷酸,该被标记的寡核苷酸包含探针、正向引物和反向引物的组合或由探针、正向引物和反向引物的组合组成,所述组合选自以下的一种或更多种的组合:
(i)寡核苷酸探针:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID:41、SEQ ID:42、SEQ ID:43、SEQ ID:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53;
(ii)正向引物:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33,或SEQ ID NO:35;
(iii)反向引物:SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36。
本公开内容还提供了一种用于识别需要抗逆转录病毒治疗(ART)和/或需要调整ART剂量的受试者的方法,该方法包括执行本文所述的一种或更多种方法。
本公开内容还提供了治疗HIV阳性受试者的方法,该方法包含根据本文所述的一种或更多种方法检测或定量慢病毒核酸或HIV DNA和/或RNA,并向受试者施用ART。
本文描述的方法可用于确定通过血清学而被怀疑为HIV阳性的受试者是否患有HIV-1或HIV-2。在一个实例中,这可以通过使用不同的被荧光标记的寡核苷酸在一个反应管中进行。然后,从被标记的寡核苷酸发出的可检测信号可以与HIV-1或HIV-2的存在相关联。例如,HIV-1的存在可以通过黄色荧光检测,而HIV-2的存在可以通过红色荧光检测。
在另一个实例中,GAPDH寡核苷酸包含序列X-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-Z(SEQ ID NO:17)或其组成,其中X是报告分子,Z是猝灭剂分子。在一个实例中,X是FAM,并且Z是BHQ-1。
在另一个实例中,正向引物和反向GAPDH引物分别包含以下序列或由以下序列组成:序列5’-GGTCTTTAAGCAAGCAAGCGTGG-3’(SEQ ID NO:18)和5’TCGACAGTCAGCCGCATCTT 3’(SEQ ID NO:19)。
在另一个实例中,β-肌动蛋白寡核苷酸包含序列X-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCG-Z(SEQ ID NO:20),或由–其组成,其中X是报告分子,Z是猝灭分子。在一个实例中,X是FAM,Z是BHQ-1。
在另一个实例中,正向引物和反向β-肌动蛋白引物分别包含以下序列或由以下序列组成:序列5’TCACCCACACTGTGCCCATCTACG 3’(SEQ ID NO:21)和5’CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG 3’(SEQ ID NO:22)。
在另一个实例中,3’LTR寡核苷酸包含序列5’FAM-TTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTC-BHQ-13’(SEQ ID NO:25),或由其组成。
在另一个实例中,正向引物和反向3’LTR引物分别包含序列5’CCAAAGAAGACAAGATATCCTTGA 3’(SEQ ID NO:23)或由其组成。
在另一个实例中,gag寡核苷酸包含序列5′-FAM-ATCLNAALNAATGLNAAGGAAGLNACTGLNAC-BHQ-1 3′(SEQ ID NO:28),或由–其组成。
在另一个实例中,正向引物和反向gag引物分别包含以下序列或由以下序列组成:序列5’AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT3’(SEQ ID NO:26)和5’TACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTTCC 3’(SEQ ID NO:27)。
本公开内容还提供了用于检测HIV-1的试剂盒,该试剂盒包含如本文所述的组合物,以及用于根据本文所述方法检测和定量HIV-1的合适试剂和说明书。在一个实例中,试剂盒还分别包含根据SEQ ID NO:20的β肌动蛋白寡核苷酸和根据SEQ ID NO:21和22的正向引物和反向引物。在另一个实例中,试剂盒还包含组合物,该组合物包含根据SEQ ID No:17的GAPDH寡核苷酸和根据SEQ ID NO:18和19的正向引物和反向引物。
本公开内容还提供了用于检测HIV-2的试剂盒,该试剂盒包含本文所述的组合物,以及用于根据本文所述方法检测和定量HIV-1的合适试剂和说明书。在一个实例中,试剂盒还分别包含根据SEQ ID NO:20的β肌动蛋白寡核苷酸和根据SEQ ID NO:21和22的正向引物和反向引物。在另一个实例中,试剂盒还包含组合物,该组合物包含根据SEQ ID NO:17的GAPDH寡核苷酸和根据SEQ ID NO:18和19的正向引物和反向引物。
在一个实例中,PCR扩增是40个循环。在另一个实例中,PCR扩增是50个循环。
在一个实例中,该方法的步骤按顺序执行。
附图简述
图1显示了HIV-1的基因组结构。
图2显示了HIV-2的基因组结构。
图3显示了针对HIV-1 R区域序列的PCR引物和寡核苷酸探针的位置(A)。HIV-1序列的R区域有95个碱基长。B、C和D示出了本文例举的针对HIV-2 R区域序列的PCR引物和寡核苷酸探针组合的位置。HIV-2序列的R区域有174个碱基长。锁核酸修饰被引入到一些寡核苷酸探针中,以提高探针的退火温度。
图4示出寡核苷酸探针(HIV-1探针1)与HIV-1亚型序列的比对。阴影表示在HIV-1亚型之间序列保守以提供有效PCR的位置。HIV序列从Los Alamos National Laboratory-HIV Sequence Consortium 2013年数据库(HIV Sequence Compendium 2013Foley B,etal.Published by Theoretical Biology and Biophysics Group,Los AlamosLaboratory NM,LA-UR 13-26007)中获得。
图5示出了HIV-2探针1结合的HIV-2亚型中的序列。
图6示出了实时PCR测定(A)和终点PCR测定(B)的示意图。实时PCR测定使用Taqman探针和未被标记的引物组。该实施方案中的终点PCR测定使用被生物素标记的反向引物和未被标记的正向引物以及被地高辛(Dig)标记的探针。加入被过氧化物酶标记的抗Dig抗体,然后进行化学发光反应,从而以相对发光单位(RLU)提供输出。
图7示出血浆病毒载量测定不能区分最优ART受试者和次优ART受试者。所有46名受试者(次优ART和最优ART组)在采血时都显示出受抑制的VL(VL<20拷贝/mL)。
图8示出了根据本方法使用GAPDH标准物的细胞内RNA扩增和定量,区分了“次优ART”(n=18)和“最优ART”(n=29)受试者组,并且差异具有统计学意义(A)。基于HIV-1 DNA水平的进一步分析定义了“改进的最优ART”组,其中HIV-1 DNA水平低于每106个细胞800个HIV-1 DNA(B)。在“改进的最优ART”(n=6)和“最优ART”(n=23)的HIV-1 RNA转录活性上的差异具有统计学意义(B和C)。经历过“短暂性变动(Blip)”和“免疫失败”的患者被归类为次优ART受试者,其中短暂性变动是在6个月内出现至少一次短暂性高pVL(低于200拷贝/mL)。免疫失败被定义为pVL<20拷贝/ml和CD4+ T细胞计数<350计数/μl,而最优ART受试者超过6个月显示受抑制的VL(VL<20拷贝/mL)。
图9示出了治疗成功患者的典型VL数据,并且在停止ART治疗后HIV-1VL反弹。四名初次治疗的患者接受了为期一年的ART治疗。在24周长的治疗期间(A、B和D)和在12周长的治疗期间(C),四名患者中的血浆病毒载量(pVL,带圆圈的黑线)低于检测极限。pVL水平保持在检测水平以下,直到ART治疗的第52周(一年)。尽管在这四名患者中的pVL不可检测,但检测到低水平的细胞内HIV-1转录活性(灰柱)。停止治疗后,4名患者的VL迅速升高,并且VL升高伴随着细胞内HIV-1转录活性升高。ART=抗逆转录病毒疗法。STI=狭窄治疗中断(Stricture Treatment Interruption,STI:停止ART)。
图10在图9中的受试者进入ART治疗的第二阶段。在该第二阶段ART期间,VL被抑制在检测水平以下,然而,即使VL在检测水平以下,存在细胞内HIV-1转录活性的一致检测(灰柱)。停止ART治疗的第二阶段后,在两个患者(A和B)中都观察到快速反弹的VL。ART=抗逆转录病毒疗法。STI=狭窄治疗中断(STI:停止ART)。
图11为了调查转录活性的增加是否来源于潜伏感染的储库中的细胞,在w1(ART)和停止ART后第4周(sw4)的细胞内RNA如水平轴上的灰色圆圈所示。收集在ART后第16周反弹的HIV-1血浆RNA,并通过Sanger测序进行分析。在基于网络的HIV数据库(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/HIVTools.html)上,使用邻接聚类方法分析数据。从同一受试者分离的样品聚类在一起(灰色矩形框),表明潜伏病毒储库具有持续的HIV转录活性,这有助于血浆病毒载量的反弹。
图12示出了对从两个受试者的血浆样品中获得的HIV-2 RNA进行的基于TaqMan探针的PCR分析和定量。(A)示出了样品中HIV-2拷贝数/ml血浆以及HIV-2标准物的分析。HIV-2 RNA拷贝数通过从7种标准物产生的Cp值来估测。(B)示出了HIV-2测定的标准分析。由标准物生成的Cp值用空心圆圈表示。
图13示出了在血浆病毒载量低于检测极限的受试者中进行的细胞内HIV-2转录分析。尽管血浆病毒载量检测呈阴性,但当被针对整合的HIV-2DNA拷贝数归一化时,HIV-2细胞内转录物(HIV-2 RNA)被检测到。
图14示出了对28名受试者进行的血浆病毒载量(A)分析。如(A)中所示,受试者血浆中没有可检测的HIV-1。(B)示出了最优(n=7)和次优(n=21)ART受试者中HIV-1 DNA的定量。(C)示出了HIV-1转录活性(RNA)。
图15示出了改进的最优ART、最优ART和次优ART受试者中的HIV-1转录活性(RNA)。
图16示出了潜伏HIV-1感染细胞中活化的HIV-1的针对GAPDH归一化的HIV转录。
图17显示了HIV-1 DNA标准物的40个循环终点扩增的标准曲线。
序列表
下表总结了本公开中提到的序列。
详细描述
一般说明
在整个说明书中,除非另有具体说明或上下文另有要求,否则对单个步骤、物质的组成、步骤的组或物质的组成的组的引用应被视为包含一个和多于一个(plurality)(即一个或更多个)这些步骤、物质的组成、步骤的组或物质的组成的组。
本领域技术人员将理解,除了具体描述的那些,本文描述的方面和实施方案易于进行变化和修改。应理解,本公开内容包含所有此类变化和修改。本公开内容还包含此说明书中单独地或集合地提到的或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物,以及所述步骤或特征的任何两个或更多个的任何或所有组合。
本公开的范围不受这里描述的具体实例的限制,这些实例仅用于举例说明的目的。功能等同的产品、组合物和方法显然在本公开的范围内。
除非另有特别说明,否则此处的本公开的任何实例应被视为参照适用于本公开的任何其他实例。
除非另有明确定义,否则本文使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义(例如,在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)。
除非另有说明,否则本公开中使用的重组蛋白、细胞培养物和免疫技术是本领域技术人员熟知的标准程序。这些技术在文献中被描述和解释,例如,J.Perbal,A PracticalGuide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook etal.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),T.A.Brown(editor),Essential Molecular Biology:A Practical Approach,Volumes 1and 2,IRL Press(1991),D.M.Glover and B.D.Hames(editors),DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995and 1996),和F.M.Ausubel et al.(editors),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates andWiley-Interscience(1988,包括至今的所有更新),Ed Harlow and David Lane(editors)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988),和J.E.Coligan et al.(editors)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括至今的所有更新)。
术语“和/或”,例如“X和/或Y”应理解为表示“X和Y”或“X或Y”,并应理解为对两种含义或其中一种含义提供明确的支持。
遍及本说明书,词“包含/包括/含有(comprise)”或变形诸如“包含/包括/含有(comprises)”或“包含/包括/含有(comprising)”,将被理解为隐含包含陈述的要素、整数或步骤,或者要素、整数或步骤的组,但不排除任何其他要素、整数或步骤,或者要素、整数或步骤的组。
对单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“一个(the)”的引用也被理解为暗示包含复数形式,除非上下文另有规定。
对已包含在本说明书中的文件、法规、资料、设计、文章或类似物的任何描述不应被视为承认任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分或由于它在本申请的每个权利要求的优先权日期之前存在是本发明相关的技术领域的公知常识。
选定定义
本文使用的术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的病毒属。其基因组包含圆锥形衣壳内的两拷贝正义ssRNA。慢病毒的实例包含人类(HIV)、猿猴(SIV)和猫科动物(FIV)。
这里使用的术语“HIV”或“人类免疫缺陷病毒”是指HIV-1或HIV-2,包含各种亚型。HIV-1的亚型包含A、B(最主要的形式)、C、D、E、F、G、H、J和K。HIV-2的亚型包含A、B、C、F或G。HIV-1和HIV-2现在被分为与系统发生上相关的组或分支相对应的组(例如HIV-1M、N、O和P组)。图1提供了HIV-1和HIV-2的结构。
这里使用的术语“水解寡核苷酸”或“探针”是指被双标记的寡核苷酸,其中5’端用荧光报告分子标记,而3’端用猝灭剂分子标记。探针的序列对于被扩增的靶分子中的感兴趣区域(即图1中的R区域)是特异性的。通常探针长度在20-30个碱基之间。探针被设计成使得序列的长度将5’荧光团和3’猝灭剂放置得足够近,以抑制荧光。在扩增反应中,当延伸到达结合的水解探针时,Taq聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性降解探针。探针的切割将荧光报告分子与探针的其余部分分离,使报告分子发出荧光。随后的PCR循环中,荧光报告物的释放量累积增加以及由此荧光量累积增加。水解寡核苷酸的一个实例是探针。
术语“同一性”及其语法变体意味着两个或更多个被引用的实体是相同的。因此,当两个序列相同时,至少在被参考的区域或部分内它们具有相同的氨基酸序列。当两个核酸序列相同时,至少在被参考的区域或部分内它们具有相同的多核苷酸序列。同一性可以在序列的定义区域(区域或结构域)上。多核苷酸的%同一性由GAP(Needleman和Wunsch,J.Mol Biol)48:444-453.1970)分析(GCG程序)确定,其中缺口创建罚分=5,并且缺口延伸罚分=0.3。除非另外指明,查询序列长度是至少45个核苷酸,并且GAP分析在至少45个核苷酸的区域内比对两个序列。优选地,查询序列长度是至少100个核苷酸,并且GAP分析在至少100个核苷酸的区域内比对两个序列。最优选地,这两个序列在它们的整个长度上比对。
这里使用的术语“病毒载量或VL”是指生物体中病毒颗粒的数量(即HIV-1或HIV-2)或病毒遗传物质的量的测量,通常是每体积血浆中病毒颗粒的数量。
这里使用的术语“抗逆转录病毒疗法”或“ART”是指用一些抗病毒药物的组合来治疗HIV阳性受试者,这些药物用于降低体内HIV倍增的速率。
这里使用的术语“最优/有效ART”是指血浆病毒载量(pVL)被抑制超过6个月的受试者。“被抑制的病毒载量”是指根据pVL在检测限度之下。
术语“引物”指当被置于某些条件下时能够充当合成的起始点的寡核苷酸,在这些所述条件下与核酸链(模板)互补的引物延伸产物的合成被启动。
这里使用的术语“次优/次有效ART”是指经历过至少一次短暂性变动(blip,BL)或患有免疫失败(IL)的受试者。短暂性变动指的是病毒瞬时增加,其中病毒载量上升到50和100拷贝/ml(或大约<200拷贝/mL)之间。次优ART受试者是那些在6个月内表现出一个或更多个短暂性变动的受试者。免疫失败被定义为pVL<20拷贝/ml,CD4+ T细胞计数<350计数/μl。这里使用的术语“改进的最优ART”是指DNA拷贝数小于每106个细胞800个DNA的受试者,尤其是在最优ART组患者中。
这里使用的术语“实时PCR”是指在PCR过程中实时监测,而不是像常规PCR那样在PCR结束时监测DNA扩增或逆转录的RNA的任何方法。通常,术语“实时PCR”和“定量PCR”可互换使用。用于执行实时PCR的方法在本领域中从这里描述的资源中是已知的。使用TaqMan探针进行实时PCR的试剂盒可从商业供应商获得,例如Thermofisher或Applied Biosystems。
这里使用的术语“Cp”或“交叉点”是指实时PCR期间的循环,在该循环中,来自扩增的荧光超过背景荧光。例如,较低的Cp与样品中较高的目标表达水平相关。
这里使用的术语“RNA”也意向于包含mRNA。
如本文所用,术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”及其语法变体意味着对个体进行程序、方案、过程或疗法,其中希望在该个体中获得生理反应或结果。由于每一个被治疗的受试者可能不会对特定的治疗程序、方案、过程或疗法做出反应,因此治疗不需要在每一个受试者或受试者群体中实现期望的生理反应或结果。因此,给定的受试者或受试者群体可能对治疗没有反应或反应不足。
术语“结合”是指寡核苷酸与特定核酸序列的反应比它对其他核酸序列的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或亲和力更强。
这里使用的术语“杂交”是指由互补的单链核酸形成双链核酸。杂交可能发生在两个完全匹配或有一些错配的基本匹配的核酸之间。杂交的互补性可能取决于杂交条件,特别是温度。杂交的详细条件可以在Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor NY(2001)和MLM Anderson,Nucleic acid hybridisation,Springer-Verlag,New York,NY(1999)中找到。
本文所指的术语“锁核酸”是指被修饰的DNA核苷酸,其中LNA核苷酸的脱氧核糖部分已经用连接2’氧和4’碳的额外桥修饰。
这里使用的术语“PBMC”是指任何具有圆形细胞核的外周血细胞,如T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞。PBMC还含有祖细胞。它们通常用Ficoll或Ficoll-Paque从全血中分离出来。
受试者中HIV-1或HIV-2的检测以及HIV-1和HIV-2的区分
大多数HIV感染者正在接受抗逆转录病毒疗法(ART)。ART治疗能够显著和快速地将血浆病毒载量(pVL)(血浆中HIV RNA拷贝数)降低到低于检测极限的水平。ART治疗显著改善了与HIV感染相关的发病率和死亡率,但是ART并不能治愈。尽管ART治疗时间很长,但HIV仍然作为整合的HIV DNA存在于许多细胞类型中形成长寿细胞储库。ART停止后,pVL水平迅速反弹,大多数受试者通常在几周内反弹。目前还没有可靠的测定来监测和评估HIV(HIV-1或HIV-2)感染者的ART治疗结果。通常,pVL和CD4+ T细胞计数都被用于监测用于HIV感染患者的ART治疗。在大多数成功治疗的受试者中,pVL值低于检测极限,且CD4+细胞数量通常保持在高水平。尽管这些经典标志物仍然发挥着重要作用,但它们对监测活跃的HIV感染不够灵敏。
基于检测HIV活性的测定,包含原病毒DNA、HIV整合的DNA、2LTR环和血浆中的超灵敏病毒载量,导致灵敏性缺乏和/或对大量样品的需求。
目前,受试者中HIV的检测从第一次基于血清学的筛查测定(“HIV-1/2抗原/抗体联合免疫测定”)开始,在该测定中,对生物样品,通常是血液,进行HIV抗体和p24抗原检测。如果样品呈阳性,将使用“HIV-1/HIV-2抗体区分免疫测定法”进行第二次确认测定。此类测试包含蛋白质印迹分析、多元分析或GeeniusTM补充测定。该测试用于区分受试者中的HIV-1和HIV-2。该测试具有良好的灵敏性,但不具有良好的特异性,因此在某些情况下,将使用核酸测试(NAT)对HIV阳性样品和HIV-1/2状态不明的受试者进行进一步测试。
Roche公司开发了一种HIV-1 DNA确认测定(Amplicor HIV-1 DNA PCR Test)。然而,这种测定现已停止,HIV诊断策略(algorithm)正在从HIV-1 DNA检测转变为使用大型自动化机器(Cobas 6800/8800系统、M2000和Panther系统)的HIV-1 RNA检测。该方法基于同时扩增和检测HIV-1基因组的两个独立区域,用于定量HIV-1 RNA。该机器用于处理大量样品,但是大多数HIV参考实验室没有大量样品用于确认测试请求。此外,至少需要八个小时才能获得结果,并且这还没有考虑到将样品运送到具有该机器的设施的相关时间。在许多HIV-1诊断实验室中,血浆病毒载量RNA测定现在被用作HIV-1确认测定的替代方法。然而,使用HIV-1血浆VL RNA测定作为HIV-1确认测定存在一些风险。在早期HIV-1感染阶段,发明人无法检测血浆中的血浆VL RNA,因为HIV-1血浆RNA水平在早期HIV-1感染阶段没有升高。HIV-1感染后2-3周血浆LV升高。因此,血浆VL HIV-1 RNA测定并不完全适合作为HIV-1确认测定。
由于趋势已经转向HIV-1 RNA测定,目前还没有用于确认的HIV-1DNA测定。此外,机器成本和测试成本使得Cobas 6800/8800系统对医院实验室来说过于昂贵。
尽管HIV-1 RNA病毒载量测试是灵敏和可靠的,但是由于HIV-2的流行率不断增加,在本领域中仍然需要HIV-1 DNA检测。此外,需要更灵敏的方法来确认样品的HIV状态,该样品通过第二次基于血清学的补充确认测试被认为是不确定的HIV-1/2和HIV阳性样品。
目前还没有可用的HIV-2 DNA确认测定。本文描述的方法提供了HIV-1和HIV-2DNA的检测和定量,这可以在短得多的时间范围内以低得多的成本进行,并且不需要将样品运送到合适的设施进行检测。
由于HIV诊断策略的当前变化(其中焦点已经转移到HIV血浆病毒载量RNA分析),仍然非常需要能够区分受试者中HIV-1和HIV-2感染的确认测定。当受试者被第二次基于血清学的补充确认检测评估为“不确定的HIV-1/2”和“HIV阳性”时,这种测定尤其重要。
本文描述的检测HIV-1或HIV-2的方法基于靶向慢病毒的长末端重复(LTR)内的R区域。为了开发这种测定,发明人需要克服许多技术困难。首先,R区域的长度较短,大约95-175个碱基长(参见本文中的SEQ ID NO:1和2)。典型地,正向引物和反向引物的PCR引物长度在18-25个碱基之间,探针长度约为20-30个碱基。因此,只有有限的序列可用于寡核苷酸和引物结合。另一个问题是引物二聚体形成的可能性。此外,引物和寡核苷酸探针必须设计成能跨越所有HIV亚型(HIV-1或HIV-2)提供可靠和灵敏的检测。对于HIV-1,这在例如图1A和图2A和B中显示。图2A显示了正向引物和反向引物与HIV-1A、B、C、D、F和G亚型中相对保守区域的比对。图2B显示了寡核苷酸探针在HIV-1亚型A、B、C、D、F和G之间的比对。发明人发现正向引物的3’端和反向引物的5’端的良好比对是实现有效PCR分析所必需的。发明人还发现寡核苷酸探针需要在探针序列的3’和5’端与HIV-1序列完美匹配,以实现有效的PCR。发明人成功地克服了短序列和多亚型序列变化的限制,设计了一种可以检测HIV慢病毒的R区域的定量实时PCR测定。
检测受试者中的HIV
本公开提供了一种检测患有人类免疫缺陷病毒(HIV)的受试者或怀疑患有HIV感染(AIDS)的受试者中的HIV的方法,该方法包括对从受试者获得的生物样品中的核酸进行PCR扩增,其中扩增包含与HIV的长末端重复(LTR)的R区域内的序列杂交的引物,随后检测任何扩增,其中检测到扩增表明受试者中存在HIV。
由于HIV基因组中存在两个拷贝的R区域,扩增将导致5’LTR和3’LTR中存在的两个R区域均被扩增。
PCR扩增可以使用常规PCR或定量PCR(RT-PCR)进行。在一个实例中,步骤(b)利用实时PCR进行。
在一个实例中,该方法还包含探针。探针可以是被标记的水解寡核苷酸。在另一个实例中,探针是探针。探针也可以是被荧光标记的杂交探针。
在一个实例中,该方法还包含:
(i)将样品中的核酸与被标记的水解寡核苷酸接触,该寡核苷酸在HIV的长末端重复(LTR)的R区域序列内结合;
(ii)进一步将核酸与正向引物和反向引物接触,所述正向引物和反向引物与R区域序列内的序列杂交;
(iv)扩增R区域序列;和
(v)检测扩增;
其中扩增由被标记寡核苷酸发出的信号检测,该信号表明受试者中HIV的存在。
优选地,正向引物和反向引物分别与寡核苷酸结合的R区域序列的上游和下游的R区域序列结合。
在一个实例中,该方法还包含从受试者获得生物样品。在另一个实例中,生物样品是全血、血浆或外周血单核细胞(PBMC)。在另一个实例中,从生物样品中提取DNA。
HIV可能是HIV-1或HIV-2。在另一个实例中,HIV核酸是DNA或RNA。在另一个实例中,该方法检测整合的HIV。在另一个实例中,扩增是通过定量PCR进行的。在另一个实例中,扩增是通过实时PCR(RT-PCR)进行的。在另一个实例中,水解寡核苷酸是探针。
定量HIV DNA
本公开还提供了用于定量生物样品中HIV DNA拷贝数的方法。因此,本公开提供了一种用于定量来自患有HIV受试者或怀疑患有HIV感染的受试者的生物样品中的HIV DNA拷贝数的方法,该方法包括:
(i)检测HIV-R区域序列;和
(ii)通过参考HIV标准物定量样品中的HIV-R区域拷贝数,其中HIV-R区域拷贝数表示为样品中存在的每体积DNA的HIV-R区域拷贝数。
在一个实例中,检测HIV-R区域序列是如本文所述或本领域已知的那样进行的。
在一个实例中,该方法还包括:
(iii)使用相应的管家标准物通过定量PCR来定量内源性管家基因,以获得内源性基因的拷贝数,该内源性基因的拷贝数表示为样品中存在的每体积DNA的管家基因拷贝数;
(iv)将获得的拷贝数除以细胞中内源性基因的拷贝数,得出样品中每体积DNA的细胞数;和
(v)通过将(i)中获得的值除以(iii)中获得的值来计算每个细胞的HIV-R区域DNA拷贝数,从而归一化HIV DNA拷贝数,以获得生物样品中的DNA拷贝数(拷贝数/细胞)。
“相应的”的意思是管家标准物与内源性管家基因相同。
优选地,使用从受试者获得的相同样品的等分试样进行HIV-R区域DNA和内源管家基因的定量。在一个特定的实例中,在提取了DNA来自受试者的样品的等分试样上执行。
在一个实例中,HIV-R区域通过以下方式定量:
(i)获取其中已经提取了DNA的样品的等分试样;
(ii)将等分试样与被标记的寡核苷酸接触,该寡核苷酸在HIV DNA的长末端重复(LTR)的R区域序列内结合;
(iii)进一步将等分试样与正向引物和反向引物接触,所述正向引物和反向引物与R区域序列内的序列杂交;
(iv)通过定量PCR扩增R区域序列;
(v)将从被标记的寡核苷酸获得的信号外推至通过HIV标准物的系列稀释物的相应扩增获得的标准曲线,以得出等分试样中每体积DNA的HIV-R区域DNA拷贝数。
在另一个实例中,内源性管家基因通过以下方式被定量:
(i)获得含有被提取的DNA的样品的等分试样;
(ii)将等分试样中的管家基因与被标记的寡核苷酸接触,该被标记的寡核苷酸与管家基因内的序列结合;
(iii)进一步将等分试样与正向引物和反向引物接触,所述正向引物和反向引物分别与管家基因序列的上游和下游序列杂交,该管家基因序列与寡核苷酸结合;
(iv)使用定量PCR扩增管家基因序列;和
(v)将从被标记的寡核苷酸获得的信号外推至是通过相应扩增标准物的系列稀释物获得的标准曲线,以得出等分试样中每体积DNA的内源性管家基因拷贝数。
在一个实例中,用于扩增HIV R区域和内源性基因的等分试样是从同一样品中获得的,优选从同一样品中提取的DNA中获得。在一个实例中,寡核苷酸是水解寡核苷酸。
本领域技术人员将理解,任何已知的管家基因都适合用于本方法。在一个实例中,管家基因是β肌动蛋白。在另一个实例中,管家标准物被系列稀释以提供1、20、200、2000、20,000、2x105和2x106拷贝数/μl。
生物样品中每体积DNA的细胞数是通过实时PCR定量内源性管家基因获得的,该定量使用与内源性管家基因相同的标准物,以获得内源性基因的拷贝数,该内源性基因的拷贝数表示为样品中X拷贝数/μl DNA的数值。然后,可以通过除以200(假设每个细胞有200个β肌动蛋白拷贝)从肌动蛋白拷贝数估计细胞数量,以提供样品中X细胞/μl DNA的数值。本领域技术人员将会理解,取决于所使用的管家基因,β肌动蛋白的数值200可能需要用与细胞中该基因拷贝数相应的不同数值替换。
在一个实例中,HIV是HIV-1或HIV-2。
在另一个实例中,HIV标准物是含有HIV基因组单拷贝数的质粒标准物。
在另一个实例中,HIV标准物被系列稀释以提供0、4、40、400、4×103、4×104、4×105和4×106拷贝/μl。
或者,样品中的HIV DNA拷贝数可以通过用基于DNA吸光度的计算代替管家基因的使用来获得。因此,管家基因标准物的使用可能被测量DNA的吸光度所取代。这种方法对于本领域技术人员来说是熟悉的,并且通常涉及测定260nm处的吸光度。
因此,在一个实例中,用于定量HIV DNA拷贝数的方法还包含:
(iii)通过测量样品中DNA相对于标准物的吸光度来定量样品中每体积的DNA质量(w/v);
(iv)基于DNA吸光度计算样品中每体积DNA的细胞数;和
(v)通过将(ii)中获得的值除以(iv)中获得的值来计算每个细胞的HIV-R区域DNA拷贝数,从而归一化HIV DNA拷贝数,以获得生物样品中的HIV-R区域DNA拷贝数(拷贝数/细胞)。
在另一个实例中,定量样品中每体积DNA质量的方法可选地包含添加DNA嵌入染料并测量染料发出的荧光。在一个实例中,DNA嵌入染料选自SyBr Green I、Syto-9、Syto-10-14、Syto-16、Syto-21、Syto-24、Syto-29、YoYo-1、YoYo-3和ToTo-1。
在一个实例中,HIV是HIV-1或HIV-2。
在另一个实例中,HIV DNA拷贝数表示为每1,000,000个细胞(106个)的HIV-R区域拷贝数,即拷贝数/106个细胞。在另一个实例中,HIV DNA拷贝数表示为任何固定数量细胞的数值,包含但不限于1.5×106、2×106、2.5×106或3×106个细胞。
在一个实例中,体积表示为μl。在另一个实例中,质量是通过260nm处的吸光度定量的DNA量。在另一个实例中,质量表示为ng。
本文描述的方法可用于定量受试者中HIV-1的pVL。下面举例说明了两种方法,可用于计算受试者中HIV-1的pVL(以拷贝数/106个细胞表示)。这些方法被认为是说明性的而非限制性的。
方法1(基于肌动蛋白标准物)
1.在提取了DNA的生物样品中,通过使用HIV-1标准物的实时PCR来定量HIV-1 R区域拷贝数A(例如,每微升提取的DNA中42.5拷贝)
2.肌动蛋白拷贝数也通过使用相同的提取了DNA的样品以肌动蛋白标准物实时PCR来定量(例如,每微升提取的DNA中2,520,000拷贝)
3.然后根据肌动蛋白拷贝数除以200来估测细胞数(肌动蛋白具有每个细胞200的拷贝数)(例如,估测的细胞数为每微升提取的DNA中12,600个细胞)B
4.每个细胞的HIV-1 R区域拷贝数是通过将A值除以B值(A/B)(例如,估测的每个细胞的HIV-1拷贝数为0.003373拷贝/细胞)来计算的C
5.每106个细胞的HIV-1 R区域拷贝数按C×1,000,000计算(例如,每106个细胞的HIV-1拷贝数估计为3373拷贝数/106个细胞)。
HIV-1标准物是用于产生标准曲线的血浆标准物(0、4、40、4x102、4x 103、4x 104、4x 105和4x 106拷贝/μl)。肌动蛋白标准物以0、20、2×102、2×103、2×104、2×105和2×106拷贝/μl使用。
方法2基于吸光度
可以测量HIV-1水平的另一种方法是使用260nm处的吸光度来测定提取了DNA的样品中的DNA质量,如下所示:
1.在提取了DNA的生物样品中,通过使用HIV-1标准物的实时PCR来定量HIV-1 R区域拷贝数(例如,每微升提取的DNA中42.5个拷贝)A。
2.从患者样品中得来的提取了DNA的溶液中的DNA质量通过在260nm处的吸光度来定量(例如,提取的DNA为111.8ng/μl)。
3.然后根据DNA的吸光度来估测细胞数量。在提取150个细胞后估测能获得1ngDNA(例如,每微升提取的DNA中估测的细胞数是16673个细胞)B。
4.每个细胞的HIV-1 R区域拷贝数是通过将A值除以B值(A/B)(例如,估测每个细胞的HIV-1拷贝数为0.002535拷贝数/细胞)来计算的C
5.每106个细胞的HIV-1 R区域拷贝数按C×1,000,000计算(例如,每106个细胞的HIV-1拷贝数估计为2535拷贝/106个细胞)。
因此,通过上述方法测定的HIV-1 DNA水平为临床医生提供了固定数量细胞中的HIV-1 DNA水平。
方法3基于DNA嵌入染料的使用
另一种可以测量HIV-1水平的方法是使用DNA嵌入染料。
1.在提取了DNA的生物样品中,通过使用HIV-1标准物的实时PCR来定量HIV-1 R区域拷贝数(例如,提取的DNA为42.5拷贝/μl)A
2.从患者样品得来的提取了DNA的溶液中的DNA质量通过DNA嵌入染料的荧光发出水平来定量(例如,提取的DNA为111.8ng/μl)
3.然后根据插入DNA的染料的荧光发出来估测细胞数量。在提取150个细胞后估测能获得1ng DNA(例如,每微升提取的DNA中估测的细胞数是16673个细胞)B
4.通过将A值除以B值(A/B)来计算每个细胞的HIV-1 R区域拷贝数(例如,估测每个细胞的HIV-1拷贝数为0.002535拷贝数/细胞)
5.每106个细胞的HIV-1 R区域拷贝数按C×1,000,000计算(例如,每106个细胞的HIV-1拷贝数估计为2535拷贝数/106个细胞)。C
因此,通过上述方法测定的HIV-1 DNA水平为临床医生提供了固定数量细胞中的HIV-1 DNA水平。
定量HIV RNA
本公开还提供了用于定量生物样品中HIV RNA,更具体地,逆转录HIV RNA(cDNA)的方法。因此,本公开还提供了一种定量从具有HIV的受试者或怀疑患有HIV感染的受试者获得的生物样品中HIV RNA拷贝数的方法,该方法包括:
(i)使用正向引物和反向引物对样品中逆转录的HIV RNA(cDNA)进行实时PCR扩增,所述正向引物和反向引物与HIV cDNA的长末端重复(LTR)的R区域内的序列杂交;和
(ii)通过参考HIV标准物,定量样品中每体积RNA的HIV-R区域拷贝数。
在这样的实例中,该方法还包括:
(iii)使用相应的管家标准物,经由定量PCR来定量内源性管家基因,以获得内源性基因的拷贝数,其中该内源性基因的拷贝数表示为样品中存在的每体积RNA的管家基因的拷贝数;
(iv)将获得的拷贝数除以细胞中内源性基因的拷贝数,得到样品中每体积RNA的细胞数;和
(v)通过将(i)中获得的值除以(iii)中获得的值来计算每个细胞的HIV-R区域RNA拷贝数,从而归一化HIV RNA拷贝数,以获得生物样品中的HIV-R区域RNA拷贝数(拷贝数/细胞)。
在一个实例中,该方法还包含从受试者获得生物样品,并从样品中提取RNA。
在一个实例中,管家标准物通过实时PCR扩增。
这里使用的术语“相应的”是指管家标准物与内源性管家基因相同。
在一个实例中,HIV-R区域通过以下方式定量:
(i)获取含有提取了RNA的样品的等分试样;
(ii)将等分试样与被标记的水解寡核苷酸接触,该被标记的水解寡核苷酸在逆转录HIV RNA(cDNA)的长末端重复(LTR)的R区域序列内结合;
(iii)进一步将等分试样与正向引物和反向引物接触,所述正向引物和反向引物与逆转录的HIV RNA的R区域序列内的序列杂交;
(iv)通过定量PCR扩增R区域序列;
(v)将从被标记的寡核苷酸获得的信号外推至通过HIV标准物的系列稀释物的相应扩增获得的标准曲线,以得出等分试样中每体积RNA的HIV-R区域RNA拷贝数。
在一个实例中,内源性管家基因通过以下方式定量:
(i)获取从生物样品制备的RNA样品的等分试样;
(ii)将等分试样中的管家基因与被标记的寡核苷酸接触,该被标记的寡核苷酸结合管家基因内序列;
(iii)进一步使等分试样与逆转录酶以及正向引物和反向引物接触,所述正向引物和反向引物分别与寡核苷酸所结合的管家基因序列的上游和下游序列杂交;
(iv)使用定量PCR扩增逆转录的管家基因序列;和
(v)将从被标记的寡核苷酸获得的信号外推至通过相应扩增标准物的系列稀释物获得的标准曲线,以得出等分试样中内源性管家基因的每体积DNA拷贝数。
在一个实例中,寡核苷酸是水解寡核苷酸。
该方法可替代地提供基于RNA吸光度来定量生物样品中的HIV RNA拷贝数。因此,本公开还提供了一种用于定量来自具有HIV的受试者或怀疑患有HIV感染的受试者的生物样品中的HIV RNA拷贝数的方法,该方法包括:
(i)检测HIV-R区域序列;
(ii)通过参考HIV标准物,通过实时PCR定量样品中每体积逆转录RNA(cDNA)的HIV-R区域拷贝数,其中该拷贝数表示为样品中每体积RNA的HIV-R区域拷贝数;
(iii)通过测量样品中RNA的吸光度来定量样品中每体积RNA的质量;
(iv)基于RNA吸光度计算样品中每体积RNA的细胞数;和
(v)通过将(ii)中获得的值除以(iv)中获得的值来计算每个细胞的HIV-R区域RNA拷贝数,以获得生物样品中的HIV-R区域RNA拷贝数(拷贝数/细胞)。
在一个实例中,检测HIV-R区域序列是根据本文所述的方法或本领域已知的方法。
在一个实例中,质量是通过260nm处的吸光度定量的RNA量。在另一个实例中,质量表示为ng。
在一个实例中,管家基因是GAPDH。
在一个实例中,管家RNA标准物是质粒标准物。在另一个实例中,RNA标准物是GAPDH。在另一个实例中,RNA标准物被系列稀释以提供1、20、200、2000、20,000、2x105和2x106拷贝数/μl。
在另一个实例中,细胞数由GAPDH拷贝数除以6.35来确定(假设每个细胞有6.35个GAPDH RNA拷贝数)。本领域技术人员将会理解,取决于所使用的对照RNA标准物,GAPDH的值6.35可能需要用与细胞中该基因拷贝数相应的不同数值替换。
在另一个实例中,用于定量HIV RNA拷贝数的方法还包括:
(iii)通过测量RNA嵌入染料的荧光发出,定量来自患者样品的提取了RNA的溶液中每体积的RNA质量(w/v)。
(iv)基于嵌入染料的荧光发出计算样品中每体积RNA的细胞数;和
(v)通过将(ii)中获得的值除以(iv)中获得的值来计算每个细胞的HIV-R区域RNA拷贝数,从而对HIV-R区域RNA拷贝数进行归一化,以获得生物样品中的HIV-R区域RNA拷贝数(拷贝数/细胞)。
在一个实例中,RNA拷贝数表示为HIV R区域拷贝数/106细胞。
检测潜伏感染的储库细胞中的HIV转录
本文描述的方法提供了对潜伏感染细胞中慢病毒转录的检测和定量。这是通过测定针对HIV-1 DNA水平归一化的HIV-1转录活性来实现的。
上述计算HIV-1 DNA的方法也可以应用于计算HIV-1 RNA。在这种情况下,如实例所示,使用GAPDH标准物。实时PCR用于扩增已经逆转录的RNA。
为了获得针对HIV DNA水平归一化的HIV转录活性的数值,HIV RNA水平除以HIVDNA水平。这种归一化的HIV转录活性(RNA拷贝数的HIV-R区域除以DNA拷贝数的HIV-R区域)提供了一种对发生的转录活性的测量,以识别活化的HIV-1转录。这种方法的优点是,我们能够获得HIV转录活性,而无需分选或分离储库中的细胞(即CD4+ T细胞和巨噬细胞)。这种细胞内转录测定对于获得ART治疗的功效非常有用,尤其是在血浆病毒载量低于检测水平(例如20拷贝/mL)的患者中。发明者能够获得并鉴定潜伏感染的储库细胞中的HIV-1转录活性。这样,申请人能够将接受最优ART的受试者与接受次优ART的受试者分开。
使用这个公式,接受ART治疗的受试者可以随时间被监测。如果治疗有效,受试者整合的HIV-1 DNA水平将在治疗期间下降。此外,如果受试者接受最优ART,HIV-1感染将不会在储库细胞内扩大,并且因此HIV-1 DNA整合的水平将会降低。
因此,HIV-1 RNA拷贝数与HIV-1 DNA拷贝数的比值为临床医生提供了诊断数据,其表明在样品收集时通过HIV-1 DNA水平归一化的当前HIV-1转录活性。这给出了ART治疗如何影响潜在感染细胞群体的一个测量方法。因为整合的HIV DNA水平可能会随着患者的不同而变,并且检测针对HIV DNA的量归一化的精确的HIV转录活性是非常重要的。
评估抗逆转录病毒疗法的有效性
不希望受到理论的束缚,发明人已经发现,HIV DNA拷贝数和归一化的HIV RNA拷贝数提供了一种更灵敏的方法,该方法将接受抗逆转录病毒治疗(ART)的受试者与接受次优/次有效ART的受试者分开。简单地测量HIV RNA拷贝数在受试者之间没有区别,因为当患者第一次被感染或处于较晚的感染阶段时,由于患者体内存在的初始HIV量,整合的HIVDNA水平可能会因患者而异。当HIV RNA拷贝数相对于HIV DNA拷贝数被归一化时,在接受最优和次优ART的受试者之间可以观察到统计上显著的区别。通过在多个时间点上执行该方法,可以监测归一化的HIV RNA拷贝数,并将其与一个或更多个先前确定的数值进行比较,以评估受试者是否正在接受最优ART。因此,检测针对HIV DNA归一化的精确的HIV转录活性是至关重要的。
因此,本公开还提供了一种用于评估向HIV阳性受试者施用的抗逆转录病毒疗法(ART)的有效性的方法,该方法包括:
(i)定量HIV-R区域DNA拷贝数;
(ii)定量HIV-R区域RNA拷贝数;
(iii)通过将步骤(i)中获得的值除以步骤(ii)中获得的值,确定从受试者获得的样品中归一化的HIV RNA拷贝数;和
(iv)将归一化的HIV RNA拷贝数值与从同一受试者获得的一个或更多个先前的归一化的值进行比较;
其中归一化的HIV RNA拷贝数的减少表明受试者正在接受最优/有效的ART。
在一个实例中,HIV-R区域DNA或RNA的定量是使用本文所述或本领域已知的方法进行的。
在一个实例中,该方法还包括从受试者获得生物样品,并从样品制备DNA和RNA。
在另一个实例中,HIV-R区域RNA通过以下方式定量:
(i)获得从生物样品制备的RNA样品的等分试样;
(ii)将等分试样与被标记的水解寡核苷酸接触,该被标记的寡核苷酸在逆转录RNA(cDNA)的长末端重复(LTR)的R区域序列内结合;
(iii)进一步将等分试样与逆转录酶以及正向引物和反向引物接触,所述正向引物和反向引物与寡核苷酸所结合的R区域序列上游和下游的逆转录的R区域序列内的序列杂交;
(iv)通过定量实时DNA PCR扩增逆转录的R区域(cDNA)序列;
(v)将从被标记的寡核苷酸获得的信号外推至通过HIV标准物的系列稀释物的相应扩增获得的标准曲线,以确定第一等分试样中每体积RNA的HIV-R区域RNA拷贝数。
在一个实例中,用于定量HIV DNA和RNA的方法中的HIV标准物是相同的。
RNA拷贝数的定量方法已经在前面描述过了。优选地,用于定量内源性管家基因和定量HIV-R区域RNA(cDNA)的等分试样来自从生物样品制备的相同RNA。优选地,HIV DNA和HIV RNA的定量是在同一生物样品中进行的,从该生物样品中分别制备/提取了DNA和RNA。
在一个实例中,HIV是HIV-1或HIV-2。
在评估受试者是否正在接受最优ART时,临床人员可能会比较通过HIV DNA值归一化的HIV RNA比值和从同一受试者获得的一个或更多个先前值的比值。如果比值随时间降低,这可能向临床医生表明受试者正在接受最优ART。然而,如果比值增加,那么这可能建议临床医生调整ART的剂量或ART的类型。如果受试者正在接受联合治疗,这也可能包含替换联合治疗中的一个组分。
在另一个实例中,该方法包括调节向受试者施用的ART的剂量或类型。
在另一个实例中,受试者的归一化的HIV RNA拷贝数比值的至少两个时间点上确定。在另一个实例中,该比值在受试者一生中的多个时间点上确定,包含但不限于三、四、五、六、八、十、十二、十五、二十、二十五、三十、三十五、四十等。在另一个实例中,至少两个时间点之间的时间段是天、周或月。在另一个实例中,至少两个时间点之间的时间段是1周、2周、1个月、3个月、4个月、6个月、8个月或12个月。
在另一个实例中,比值的降低大于50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、5%、2%,表明受试者正在接受最优ART。
抗逆转录病毒治疗和监测治疗反应
HIV RNA(病毒载量)和CD4T淋巴细胞(CD4)细胞计数是抗逆转录病毒治疗(ART)反应和HIV疾病进展的两个替代标记,几十年来,这两个标记一直用于管理和监测HIV感染。
病毒载量是对ART反应的标志。患者的ART前病毒载量水平和ART开始后病毒载量下降的幅度提供了关于疾病进展概率的预测信息。ART的主要目标是实现并保持持久的病毒抑制。因此,病毒载量最重要的用途是监测ART开始后的治疗效果。
CD4计数的测量在ART开始前特别有用。CD4细胞计数提供了HIV感染患者整体免疫功能的信息。该测量对于确定机会性感染(OI)预防的开始和停止的阈值以及评估开始ART的紧迫性至关重要。
CD4计数监测
CD4计数是HIV感染患者免疫功能最重要的实验室指标。根据临床试验和队列研究的发现,这也是后续疾病进展和存活的最强预测因素。CD4计数是高度可变的;两次测试之间的显著变化(2个标准差)是大约30%的在绝对计数上的变化,或者CD4百分比增加或减少3个百分点。
HIV感染的特点是,在整个疾病过程中,病毒更替率很高,最终导致CD4耗竭和疾病进展。(Wei X,Ghosh S K,Taylor M E,et al.(1995)Nature 343,117–122和Ho D D,Naumann A U,Perelson A S,et al.(1995)Nature 373,123–126)。抗逆转录病毒疗法的目的是实现对病毒复制的实质性和延长性抑制。实现持续的病毒控制可能涉及使用顺序疗法,通常每个疗法包含三种或更多种抗逆转录病毒药物的组合。联合治疗的主要原理涉及协同或相加活性,以实现对病毒复制的更大抑制。然而,药物疗法的耐受性仍然至关重要,因为治疗需要持续多年。
在一名未经治疗的患者中,每天产生大约1010个新的病毒颗粒。再加上HIV逆转录酶(RT)未能通过核酸外切性校对纠正转录错误,这种高水平的病毒更替导致HIV基因组中每个位置每天发生104到105次突变。结果是快速建立了广泛的基因型变异。
抗逆转录病毒疗法的早期发展集中在逆转录酶抑制剂上。该酶的核苷和非核苷抑制剂都显示出显著的抗病毒活性(DeClerq,E.(1992)AIDS Res.Hum.Retrovir.8:119–134)。然而,由于耐药性、有限的效力和宿主细胞因素,这些药物的临床益处有限(Richman,D.(1993)Ann.Rev.Pharm.Tox.32:149–164)。
最近的治疗集中在蛋白酶抑制剂的使用上。这些药物包含Hoffmann-La Roche公司开发的沙奎那韦、Abbott Laboratories开发的利托那韦、Merck&Co.开发的茚地那韦、Agouron Pharmaceuticals开发的奈非那韦以及Vertex Laboratories开发的安普那韦。其他蛋白酶抑制剂包含阿他扎那韦、达鲁纳韦、福沙那韦和替拉那韦。
可用于治疗的其它类型的药物包含如恩夫韦的融合抑制剂,如马拉维若的CCR5共受体拮抗剂,以及如isentress、tivicay和vitekta的HIV整合酶链转移抑制剂。
蛋白酶和逆转录酶抑制剂联合抗病毒疗法已经证明了抗病毒疗法治疗艾滋病的潜在疗效。这种组合包含atripla、complera、evotaz、prezcobix和stribild。
本领域技术人员将理解,可以对上述具体实施方案作出许多变化和/或改变而不脱离本发明的广泛的通常范围。因此,所列出的实施方案在所有方面被认为是说明性的而非限制性的。本公开包含以下非限制性实例。
实施例
材料和方法
引物和探针序列的设计
在图1中示出了HIV-1的基因组结构。在图2中示出了HIV-2的基因组结构。引物组被设计成靶向位于HIV-1或HIV-2基因组的5’LTR和3’LTR内的相同“R”区序列。引物组是根据以下标准设计的:(a)位于所有HIV-1和HIV-2亚型的保守区域,用于可靠检测;(b)引物长度在18-25个碱基长之间;(c)不形成引物二聚体,但保持灵敏检测。正向引物被设计为针对所有HIV亚型在引物的3’端提供良好的比对,并且反向引物被设计为针对所有HIV亚型在引物的5’端提供良好的比对。正向引物和反向引物示于下表1中。
表1用于PCR的正向引物和反向引物的序列
探针设计为结合在所有HIV亚型中的保守区域,以确保有效检测。锁核酸(LNA)修饰被用于允许提高退火温度和使用短TaqMan探针。
HIV-1寡核苷酸探针的序列如下:
5’FAM-AGGLNAGALNAACLNACCACLNATGLNACTTA-BQH-1 3’(SEQ ID NO:6),其中FAM是荧光报告物,BHQ1是猝灭分子,并且NLNA代表锁核酸类似物,其中N是所示的A、T、G或C核碱基。
HIV-2寡核苷酸探针No.1的序列如下:
5’FAM-GCCTGGGTGTTCCCTGCTAGACTCT–BQH-1 3’,其中FAM是荧光报告物,并且BHQ1是猝灭分子。
HIV-2寡核苷酸探针No.2的序列如下:
5’FAM-CTLNAGCLNATALNAGTLNAGLNACTGGLNAA–BQH-1 3’(SEQ ID NO:40),其中FAM是荧光报告物,BHQ1是猝灭分子,并且NLNA代表锁核酸类似物,其中N是所示的A、T、G或C核碱基。
HIV-2寡核苷酸探针No.3的序列如下:
5’FAM TCLNACALNAGCLNAACLNATALNAGCLNAAG–BQH-1 3’(SEQ ID NO:44),其中NLNA代表锁核酸类似物,其中N是所示的A、T、G或C核碱基。
图3A-D示出了在HIV-1和HIV-2的HIV-R区域序列中使用的探针和PCR引物的比对。图3A表示HIV-1上的比对,并且图3B-D表示HIV-2上的比对。
HIV-1亚型的HIV-1寡核苷酸探针的比对如图4所示。
HIV-2探针的HIV-2亚型的寡核苷酸探针的比对如图5A-C所示。
GAPDH探针的序列为5’FAM-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-BQH-1 3’(SEQ IDNO:17),其中FAM对应于荧光报告物,且BHQ1是猝灭分子。
β-肌动蛋白探针的序列为5’FAM-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCG BHQ-1 3’(SEQ IDNO:20)。
引物和探针的标记
所有引物都是通过标准的商业寡DNA合成服务合成的。生物素标记的引物用于终点PCR检测。生物素修饰是在寡DNA引物的5’末端进行的。
细胞系和质粒标准物
本文使用的HIV-1质粒标准物是从pNL4-3(NIH Cat No.114)的基因组HIV-1质粒中获得的。TA克隆的HIV-2质粒标准物通过标准程序产生。起初,用HIV-2CBL-20病毒(NIHCat No 600)感染HUT78细胞。分离基因组DNA,然后进行PCR扩增。从该扩增子中获得T/A克隆的HIV-2,以产生含有HIV-2 R区域的质粒。HIV-2质粒拷贝数使用260nm吸收光谱和每个质粒的分子量来测定。
HUT78细胞(CD4+ T细胞系,Cat No.89)和OM10.1细胞(HIV-1潜伏细胞系,CatNo.1319)也从NIH获得。OM10.1细胞系在单个OM10.1细胞中含有单个拷贝的HIV-1基因组DNA。
HIV受试者数据
受试者的血浆病毒载量数据从St Vincent’s Hospital诊断实验室获取。根据制造商的说明,使用RocheTaqMan HIV-1测定获得了关于受试者HIV状态的数据。受试者为18岁以上的成年受试者,并获得了使用其血样的知情同意。
外周血单核细胞(PBMC)的分离和制备
全血是使用标准采血方案从受试者获得的。不超过4天的新鲜血液从St Vincent’s Hospital的HIV诊断实验室获得。
使用常规Ficoll梯度离心方法从全血中分离外周血单核细胞(PBMC)。简言之,将血液收集在9mL酸性柠檬酸葡萄糖抗凝剂(ACD)管中,并加入9mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)。颠倒混合后,加入15mL Ficoll-plaque培养基,并在18-20℃以400g离心持续40分钟。丢弃含有血浆和血小板的上层,并将单核细胞层转移到干净的管中。加入30mL PBS,混合并在18-20℃于400g离心持续15分钟。除去上清液,将单核细胞在10mL PBS中洗涤,并在18-20℃于400g离心持续10分钟。除去上清液并保留单核细胞以备将来分析。
全血的分离和制备
对于全血实验,向15mL Falcon管中加入4mL红细胞裂解缓冲液(Roche公司)。将全血收集管颠倒10次,然后将2mL全血加入到含有4mL裂解缓冲液的15mL Falcon管中。将管在室温(RT)以慢速旋转方式在旋转平台上孵育持续10分钟。然后用台式离心机在室温将管以500xg离心持续5分钟。离心后,上清液倾入废液瓶中。将细胞重新悬浮在1800μl PBS中。两个O形环管中制成两等份的900μl细胞悬浮液。
然后用微量离心机在室温将管以7800xg(9000rpm)离心3分钟。使用P1000移液管去除上清液而不干扰白细胞沉淀。
从每一名患者制备了两个细胞沉淀管。一个管用于DNA提取,另一个管用于RNA提取。
样品中被提取的DNA浓度通过在260nm(A260)的吸光度测量,利用双链(ds)DNA的平均消光系数(1A260=50μg/ml),根据核酸制备品的吸光度来确定核酸浓度。
PBMC的制备
通过Ficol-Paque分离方法从全血中获得PBMC。患者的血液被收集在9mL ACD(酸性柠檬酸葡萄糖,抗凝剂)管中。将9mL血液转移到50mL Falcon管中,并加入9mL PBS。将管颠倒几次,使血液和缓冲液混合。速度十分缓慢地在50mL Falcon管的底部添加15mLFicoll-Paque培养基,而不干扰Ficoll-Paque培养基和血液相之间的界面。将管在18℃至20℃以400g离心持续40分钟(关闭离心机的制动器)。用无菌移液管从血浆和血小板中吸取上层,留下单核细胞层在界面处不受干扰。然后将单核细胞层转移到50mL Falcon管中。向细胞中加入30mL PBS,并通过将管颠倒几次进行混合。将管在18℃至20℃以400g离心15分钟(打开制动器)。将上清液除去。将单核细胞重悬浮在10ml PBS中。在18℃至20℃,以400×g离心持续10分钟。然后除去上清液。
白细胞亚型的纯化
为了纯化RO+R5+、RO+R5-和RO-R5-细胞群体,通过FACS Aria细胞分选器(BDBiosciences)基于PBMC上的表面标志物分选PBMC细胞。
将PBMC(约2×106细胞)与针对CD4的单抗(PerCP;Becton Dickinson),和针对CD3的单抗(APC;Becton Dickinson),针对CCR5的单抗(克隆2D7,FITC缀合的;PharMingen),和针对CD45 RO的单抗(PE;PharMingen)一起孵育。在室温将细胞与标志物一起孵育持续30min。然后将管以400g离心5分钟,并将细胞重悬于具有10%FCS的1mL PBS中。再重复两次,并将细胞重新悬浮于具有10%FCS的1mL PBS中。细胞被“Aria细胞分选器”分选,以得到以下三个T细胞亚群
CD3+CD4+CD45RO+ccr5+
CD3+CD4+CD45RO+ccr5-
CD3+CD4+CD45RO-ccr5-。
根据制造商的说明,使用磁性标记的颗粒分离具有CD14的PBMC。
DNA提取
根据制造商的说明,使用QIAamp DNA mini kit(Qiagen)提取基因组DNA。
简而言之,向细胞沉淀中加入200μl AL缓冲液(在试剂盒中提供),并且将管进行涡旋,直到沉淀溶解。制备了蛋白酶-K主混合物。
200μl的PBS x管数
20μl的蛋白酶K x管数
加入220μl蛋白酶-K主混合物,并且将管进行涡旋。DNA在56℃消化持续10分钟,然后每2-3分钟进行短暂的涡旋。然后将管短暂离心,并加入200μl EtOH,随后涡旋15秒。然后将管短暂离心,并将所有裂解的溶液加入QIAamp DNA Minicolumn中,并在室温以6,000xg离心1分钟。QIAamp柱的上部被转移到新的液体收集管中(在试剂盒中提供提供)。收集管的使用过的下部被丢弃成废物。加入500μl AW1缓冲液(在试剂盒中提供提供),并在室温以6,000xg离心1分钟。QIAamp柱的上部被转移到新的液体收集管中(在试剂盒中提供提供)。收集管的使用过的下部被丢弃成废物。加入500μl AW2缓冲液,并在室温以13,000xg离心3分钟。
将收集管中的液体清空,并在室温以13,000xg进行1分钟的额外离心。将上部柱移出并放入1.5mL安培管中。加入60μl AE缓冲液(在试剂盒中提供提供)并在室温保持1分钟,然后在6,000xg的离心机中在室温保持1分钟。使用过的收集管的上部被丢弃,并且离心管的下部储存在4℃。
RNA提取
根据制造商的说明,使用ReLiaprepTM RNA cell system(Promega)从血液样品中提取总RNA。
简而言之,将250μl的Bl+TG缓冲液(在试剂盒中提供)添加到每个细胞沉淀中。管被涡旋直到沉淀溶解。加入85μl异丙醇,并涡旋管。将裂解的溶液转移到ReliaPrepMinicolumn(在试剂盒中提供)中,并在室温以14,000xg离心1分钟。来自收集管的液体被清空成废物。
在新管中制备DNA-1主混合物,以获得所有管所需的体积。
24μl Yellow Core缓冲液 x管数
3μl 0.09MnCl2 x管数
3μl DNA酶I酶。 x管数 混合好这个管
将30ul DNA-1主混合物添加到ReliaPrep Minicolumn的过滤器上,并在室温孵育持续15分钟。加入200μl Column Wash Solution(在试剂盒中提供),并在室温以14,000xg离心1分钟。500μl RNA Wash Solution(加入了乙醇),并室温以14,000xg离心1分钟。ReliaPrepTM Minicolumn被放入新的收集管中,并加入300μl RNA Wash Solution(在试剂盒中提供)。管在室温以最大速度离心2分钟,并且随后移至1.5mL的安培管中。加入60μl无核酸酶水,并且将管在室温保持1分钟,然后在室温在离心机中13,000xg1分钟。使用过的收集管的上部被丢弃,离心管的下部储存在4℃。
所有DNA和RNA样品都用分光光度计进行分析,以用Qubit FluorometricQuantitation(ThermoFisher)来确认质量。
DNA扩增实时测定
图6A和B示意性地示出了使用一组PCR引物和TaqManTM探针的在本公开内容中使用的实时PCR方法。使用SensiFAST Probe No-ROX One-step kit(BIO76005),利用两组实时PCR进行DNA分析。40μl最终体积的每个反应混合物包含:2×PCR缓冲液、20μM正向引物、20μM反向引物、6μl DNA、5μM Taqman探针和PCR级水。循环和解链条件如下:使用LightCycle480(Roche),94℃持续30秒,随后是以下的50个循环:95℃7秒,和60℃30秒。HIV-1 DNA标准物被系列稀释以提供0、40、400、4000、40000、4×105和4×106拷贝/μl。
对于β-肌动蛋白分析,40μl最终体积的反应混合物包含:2×PCR缓冲液、20μM正向引物、20μM反向引物、6μl DNA、5μM Taqman探针和PCR级水。循环和解链条件如下:使用LightCycle 480(Roche),94℃持续30秒,随后是以下的50个循环:95℃7秒,和60℃30秒。β肌动蛋白标准物被系列稀释以提供0、20、200、2000、20000、2×105和2×106拷贝/μl。β肌动蛋白标准物是含有单拷贝β肌动蛋白基因的质粒。使用PCR扩增的β肌动蛋白DNA和标准克隆方法通过TA克隆制备β肌动蛋白质粒标准物。β-肌动蛋白引物和探针序列如上所述。
HIV-1克隆质粒是从NIH获得的,单个质粒包含单个拷贝的HIV-1基因组。
RNA扩增实时测定
使用SensiFAST Probe No-ROX One-step kit(BIO76005),利用两组实时PCR进行RNA分析。对于RNA分析,40μl最终体积的反应混合物包含:2×PCR缓冲液、20μM正向引物、20μM反向引物、6μl RNA、5μM Taqman探针、0.45μl逆转录酶、0.8μl RNA酶抑制剂和PCR级水。循环和解链条件如下:使用LightCycle 480(Roche),45℃持续20分钟,94℃持续2分钟,随后是以下的50个循环:95℃7秒,和60℃30秒。除非另有说明,否则每次PCR扩增重复三次进行。
对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)分析,40μl最终体积的反应混合物包含:2×PCR缓冲液、20μM正向引物、20μM反向引物、6μl RNA、5μM Taqman探针、0.45μl逆转录酶、0.8μlRNA酶抑制剂和PCR级水。循环和解链条件如下:使用LightCycle 480(Roche),45℃持续20分钟,94℃持续2分钟,随后是以下的50个循环:95℃ 7秒,和60℃ 30秒。
GAPDH标准物被连续稀释以提供0、20、200、2,000、20,000、2×105和2×106拷贝/μl。GAPDH标准物是含有单个拷贝的β肌动蛋白基因的质粒。GAPDH质粒对照是通过使用PCR扩增的GAPDH DNA通过标准克隆方法进行TA克隆来实现的。
GAPDH引物和探针序列如上所述。
终点PCR测定
发明人开发了一种终点PCR测定,在此称为链霉亲和素(SA)平板终点测定(Streptavidin(SA)-plate end-point assay)。图6B示意性地示出了该测定,并且其使用生物素标记的引物执行。PCR后,PCR产物与被地高辛(Dig)标记的探针杂交。新杂交的产物被捕获在链霉亲和素包被的96孔板的表面上。洗去未结合的Dig探针后,加入过氧化物酶(POD)标记的抗Dig抗体,然后进行化学发光反应。释放的光然后由发光板读取器检测。
所有PCR反应以与基于TaqMan的实时PCR方法相同的方式进行(见上文“DNA扩增实时测定”和“RNA扩增实时测定”),除了以下两个条件:i)不使用TaqMan探针,在该反应中该探针被水替代;和ii)一组引物中的一个引物在寡DNA的5’端被生物素标记。PCR完成后,将10μl PCR扩增子转移到含有40μl杂交缓冲液的PCR管中,该杂交缓冲液具有20pmol的被Dig标记的探针和3.85×SSC缓冲液(例如,20×SSC含有3.0M NaCl和0.3M柠檬酸钠pH7.0),。为了使PCR扩增子和被Dig标记的探针杂交,将该PCR管的溶液的温度升高到95℃持续2分钟,然后在40℃持续2分钟,然后在4℃。将总体积为50μl的杂交产物转移到链霉亲和素包被的96孔板中,该96孔板包含50μl的稀释缓冲液,该稀释缓冲液具有10mM Tris-HCl pH 7.6、150mM NaCl、1mM EDTA和0.0002%Tween20。将96孔板在37℃孵育持续30分钟。生物素标记的PCR扩增子和Dig探针的杂交产物在孵育期间结合到链霉亲和素板上。在用洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5,0.15M NaCl,1mM EDTA,0.01%Tween20)进行3×洗涤期间,未结合的产物从板上洗出。随后,加入100μl过氧化物酶缀合的抗Dig抗体(1/5000稀释),使用5%BSA、10mM Tris-HCl pH7.5、0.15M NaCl的稀释缓冲液。然后将96孔板在37℃孵育持续30分钟,随后使用洗涤缓冲液进行6×洗涤。然后加入100μl化学发光过氧化物酶底物(CPS260,Sigma)。然后将板在室温孵育5分钟。用发光板读取器检测从底物产生的光,以获得相对光单位(RLU)。发光平板读取器的增益(调整值)为1200。
实施例1通过HIV-1 DNA拷贝数归一化的HIV-1 RNA拷贝数(pVL)
如上所详述的,从正进行ART的四十七(47)名HIV-1受试者中获得样品,并从全血细胞裂解物中提取DNA和RNA。在收集时,所有患者的血浆病毒载量(pVL)都被抑制,且为>20拷贝/mL(图7)。
根据过去6个月中血浆病毒载量,HIV-1患者被分配接受“最优ART”或“次优ART”。过去6个月pVL<20拷贝/mL的患者被认为接受“最优ART”,而在过去的6个月里pVL偶尔升高(即>20至<200拷贝/mL;被称为短暂性变动(BL))的患者被指定为接受“次优ART”。
基于HIV-1 R区域序列扩增的HIV-1 RNA和DNA的定量通过实时PCR分析如根据上述方案所述的进行,针对DNA的定量使用β肌动蛋白标准物,且针对RNA的定量使用GAPDH标准物。对从SVH诊断实验室获得的47份样品进行了分析。
在收集时,这47个样品的RNA血浆病毒载量(pVL)完全被抑制(<20拷贝数/mL)。从图7中可以看出,使用标准pVL测定的最优和次优ART受试者没有差异。
如图8所示,当HIV-1 RNA拷贝数被针对HIV-1 DNA拷贝数归一化时,由于在“最优ART”(n=29)和“次优ART”(n=18)受试者之间发现了细胞内病毒活性的统计上显著差异(p=0.0016),该测定可以区分接受最优ART的受试者和接受次优ART的受试者(图8A)。先前经历过病毒载量短暂性变动(BL)的受试者,即至少一次短暂性的高HIV-1 DNA水平发作,以及四名具有免疫失败(IF)的受试者,在次优ART类别中被识别为具有显著更高的归一化的HIV-1 RNA的平均比值(图8B)。pVL被抑制超过6个月的受试者具有较低的归一化的HIV-1RNA的平均比。
因此,尽管pVL RNA测定显示两组受试者之间没有差异,但发明人的测定能够基于归一化来区分接受最优或次优ART的受试者。
如图8C所示,根据发明人的测定,在HIV-1 DNA拷贝数小于每106个细胞中800个HIV-1 DNA的受试者中发现了另一个类别,命名为“改进的最优ART”,与最优ART组的其余成员相比,该类别具有统计显著性(p=0.012)。
该数据表明,可以使用位于5’和3’LTR R区域的引物检测潜伏感染的储库中的HIV活性,并且如本文所示地确定细胞内HIV-1拷贝数提供了比标准pVL更灵敏的治疗响应指标。此外,随着RNA转录水平针对整合的DNA水平被归一化,细胞内HIV载量的增加表明潜在的病毒储库是在转录上活化的。
结果还表明,受试者中归一化的HIV-1 RNA的比值低(即转录活性低)以及低HIV-1DNA的比值低都表明了改进的最优ART。因此,临床医生在确定受试者是否接受适当的(即最优的)ART时,可能会参考这两种测量方法,即归一化的HIV-1 RNA的比值(小于0.05)和HIV-1 DNA拷贝数小于每106个细胞中800HIV-1 DNA。
实施例3评价HIV-1 R区域DNA检测
本研究评估了已知感染HIV-1的两个受试者(在表3中为A和B)。基于标志物CD3+、CD4+、CD45RO+、CD45RO-和CCR5+的表达,通过流式细胞术对来自受试者的HIV-1感染的外周血单核细胞(PBMC)进行分选,外周血单核细胞先前已被证明包含富集的受感染细胞群体。
简言之,根据制造商的说明,基于细胞表面标志物,使用FACS ARIA细胞分选器(BDBiosciences)对PBMC进行分选。简言之,2x106细胞与针对CD4的单抗(PerCP,BectonDickinson),针对CD3的单抗(APC,Becton Dickinson),针对CCR5的单抗(克隆2D7,FITC缀合的;PharMingen)和针对CD45 RO的单抗(PE;PharMingen)一起孵育。CD45 RO+细胞通常辨别记忆T细胞,而CD45 RO-细胞通常区分幼稚T细胞。CD3是一种泛T细胞标志物,用于分离T细胞和非T细胞。CD4通常被发现存在于T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞上。CCR5是一种在白细胞上发现的趋化因子受体,并通常被HIV用来感染白细胞。
细胞在室温孵育持续30分钟,并在400g离心持续5分钟。细胞在1mL PBS/10%FCS中洗涤3次。洗涤的细胞被分选以分离以下T细胞亚群:
·CD3+CD4+CD45 RO+CCR5+
·CD3+CD4+CD45 RO+CCR5-
·CD3+CD4+CD45 RO-CCR5-
使用针对HIV-1 DNA内三个不同细胞内位置的引物组分析样品:
(1)5’和3’LTR R区域,
(2)3’LTR区域
(3)gag区域。
5’和3’LTR R区域引物如本文前面所述。
3’LTR扩增正向引物和反向引物分别是5′-CCAAAGAAGACAAGATATCCTTGA-3′(SEQID NO:23)和5′-TTGAGGCTTAAGCAGTGG-3′(SEQ ID NO:24)。寡核苷酸探针的序列为5′-FAM-TTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTC-BHQ1-3′(SEQ ID NO:25),其中FAM是荧光标记染料,并且BQ1是该荧光染料的猝灭剂。该引物组扩增跨越3’LTR的U3和R区域的区域。
gag正向引物和反向引物分别是5’AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT 3’(SEQ IDNO:26)和5’TACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTTCC 3’(SEQ ID NO:27)。寡核苷酸探针的序列为5′-FAM-ATCLNAALNAATGLNAAGGAAGLNACTGLNAC-BHQ1-3′(SEQ ID NO:28),其中FAM对应于荧光报告物,并且BHQ1是猝灭分子。锁核酸由NLNA表示,其中N是表示的A、T、G或C核碱基。
结果示于下表3中。R区域引物在来自两个受试者的未分选样品中检测到细胞内HIV-1 DNA。在细胞分选后,在受试者A中,使用3’LTR和gag引物的HIV-1 DNA检测是可变的,而在受试者B中,两种引物组都未能检测到HIV-1 DNA。相反,R区域引物在受试者A的所有样品中检测到HIV-1 DNA,并且在受试者B中在CD3+CD4+CD45RO-CCR5-中以低水平检测到HIV-1 DNA。
这些结果表明,与基于非R区域扩增的检测相比,使用针对R区域的引物检测HIV-1DNA更加灵敏。
表3:HIV-1 R区域DNA检测的评价
实施例4:HIV-1 R区域RNA检测灵敏度的评价
为了评估患者样品中的HIV-1 RNA,选择了八(8)名已知HIV-1阳性的受试者,并使用针对三个不同细胞内位置的引物组进行分析:(1)5’和3’LTR R区域,(2)3’LTR区域和(3)gag区域,类似于实施例3中的HIV-1DNA分析。
如前所述,使用5’和3’LTR R区域、3’LTR区域和gag区域的引物。
与上述实施例3相反,如前所述,对在从全血中分离的细胞进行分析。如前所述进行RNA提取和PCR扩增。
如下表4所示,位于5’和3’LTR的R区域的引物能够在所有8名受试者中检测到细胞内HIV转录物,而位于3’LTR和gag区的引物仅分别在4名和3名受试者中检测到HIV载量。
该数据表明,当与位于3’LTR和gag区的引物相比时,位于5’和3’LTR的R区域中的引物对细胞内DNA拷贝数的检测更加灵敏。尽管这些受试者的VL低于检测水平,但基于R区域的细胞内HIV-1转录活性的一致性检测被检测到。
表4:HIV-1 R区域RNA检测的评价
实施例5:细胞内HIV载量表明持续的HIV转录活性,并有助于血浆病毒载量反弹
为了调查低但持续的细胞内HIV载量水平是否表明HIV转录活性,在抗逆转录病毒治疗(ART)和结构化治疗中断(STI)期间(即没有ART治疗)对受试者进行取样。
在ART期间,每隔12周分析受试者血浆病毒载量和病毒RNA。停止治疗后,受试者每隔多达16周取样一次。细胞内转录活性使用如前所述的R区域测定检测。
四名初治的患者进行了为期一年的ART治疗。在24周长的治疗期间(图9A、B和D)以及在12周长的治疗期间(图9C)四名患者中血浆病毒载量(pVL,圆圈线)水平处于检测极限之下。pVL水平保持在检测水平之下,直到ART治疗的第52周(一年)。尽管在这四名患者中pVL不可检测,但检测到低水平的细胞内HIV-1转录活性(灰柱)。停止治疗后,4名患者的VL迅速升高,并且伴随VL升高的是细胞内HIV-1转录活性升高。
ART治疗期间显示在灰色水平栏中,并且狭窄治疗中断(STI:停止ART)周期显示在白色水平栏中(图9)。
图9中的受试者进入ART治疗的第二阶段(图10)。在第二阶段ART期间,VL被抑制在检测水平下,然而,即使VL在检测水平下,细胞内HIV-1转录活性的一致检测(灰柱)被检测到。停止第二阶段ART治疗后,在两个受试者中观察到快速反弹的VL(图10A和B)。
为了研究转录活性的增加是否来源于潜伏感染的储库中的细胞,基线(ART前)和停止ART后第2周(水平轴上的灰色圆圈)的细胞内RNA,以及ART后第16周(由上灰色圆圈表示)的反弹HIV-1血浆RNA被收集并通过Sanger测序进行分析。
使用邻接聚类方法在基于网络的HIV数据库(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/HIVTools.html)上分析数据。从同一受试者中分离的样品聚类在一起(灰色矩形框),表明潜在的病毒储库具有持续的HIV转录活性,这促使了血浆病毒载量的反弹(图11)。
实施例6评估血浆中HIV-2拷贝数
分析了两个含有HIV-2 RNA的血浆样品。自动提取仪(NucliSENSE easyMAG系统,BioMedirux)被用于从血浆中提取RNA,以用于分析HIV-2RNA。结果示于图12中。
该测定在患者B中检测到2.4拷贝/ml的HIV-2 RNA,在患者A中检测到0.1拷贝/ml的HIV-2 RNA。
实施例7评价HIV-2转录
用于HIV-1转录分析的相同策略被应用于HIV-2转录分析。可获得单一的受试者样品。HIV-2分析的方法如本文前面所述。
结果示于图13中。受试者的HIV-2血浆病毒载量低于检测水平(图13A)。然而,当检测到HIV-2细胞内RNA转录物并且该RNA拷贝数被针对HIV-2 DNA拷贝数归一化时(图13B),观察到细胞内HIV-2 RNA水平相对较高。
实施例8用于HIV-1
DNA检测的PCR测定灵敏度的比较
发明人开发了两种不同的用于检测HIV-1 DNA的PCR测定形式,下面进行比较。
如方法和表1(SEQ ID NO:6)所述,使用HIV-1正向引物和反向引物以及Taqman探针,在提取自PBMC的DNA上进行实时PCR测定。使用被生物素标记的HIV-1正向引物、未被标记的反向引物和被地高辛标记的探针(SEQ ID NO:45)进行终点测定。用于终点测定的探针序列是用于实时PCR的同一探针的较短版本。
PCR分析的样品如下:
地高辛探针:Dig/-TTTTTTTTTTTTTTTGGAACCCACTGCTTA(SEQ ID.NO:45)
HIV-1质粒标准物:0、4、40、400、4,000、40,000个拷贝的HIV-1质粒。
HUT-78和OM10.1混合样品:0、4、40、400、4000、40,000个HIV-1细胞/百万(1×106个未感染细胞)
HUT-78细胞是CD4+ T细胞系(未感染HIV-1)。OM10.1细胞是CD4+HIV-1潜伏感染的细胞系,其中每个细胞包含一个整合的HIV-1原病毒。为了制备“HIV-1掺加的”样品,将HUT-78和OM10.1细胞混合在一起,使得0、4、40、400、4000、40,000个OM10.1细胞与1×106个HUT-78细胞混合。这是为了模仿来自受试者的实际HIV-1感染临床样品而设计的。
如上所示地制备质粒标准物的系列稀释液,并在50μl PCR反应中使用8μl标准物。
对照HIV-1质粒标准物,用50个PCR循环对从HUT-78/OM10.1细胞混合物中提取的DNA进行实时PCR分析和终点PCR分析。结果示于下表5中。10μl PCR产物用于终点测定分析。
表5:实时PCR和终点PCR测定的比较
显示的结果是两次重复测定的平均值。
使用实时PCR,用产生的线性标准曲线(未显示)检测了4至40,000个拷贝的HIV-1质粒标准物。如表5所示,HUT-78/OM10.1细胞混合物的最小检测限为1×106个HUT-78细胞中的40个OM10.1细胞。
使用40个循环的终点PCR,清楚地检测到4和40,000个之间的拷贝的HIV-1质粒标准物。如表5所示,HUT-78/OM10.1细胞混合物的最小检测限为1×106个HUT-78细胞中的4个OM10.1细胞。>1,000RLU的发光读数被认为是阳性检测。
结果表明,两种PCR测定都提供了非常灵敏的HIV-1检测。
实施例9 PCR测定特异性的比较
使用HIV-2质粒标准物测量HIV-2 DNA的检测,并将结果与HIV-1质粒标准物进行比较,以显示特异性。包含0、4、40、400、4000和40,000个拷贝的HIV-1和HIV-2质粒标准物通过实时PCR和终点PCR测定两者,用50次PCR循环扩增。
对于实时PCR,用正向引物(SEQ ID NO:7)和反向引物(SEQ ID NO:9)扩增HIV-1DNA。用Taqman探针(SEQ ID NO:6)探测扩增子,并测定拷贝数。
如下表6所示,HIV-1探针能够检测到4至40000个拷贝的HIV-1 DNA,并且对HIV-1具有特异性,因为只有HIV-1 DNA被扩增。此外,用正向引物(SEQ ID NO:35)和反向引物(SEQ ID NO:36)扩增HIV-2 DNA。如表6所示,HIV-2Taqman探针(SEQ ID NO:44)能够检测到4至40000个拷贝的HIV-2,并且对HIV-2具有特异性,因为用HIV-2探针没有检测到HIV-1扩增子。
表6 HIV-1和HIV-2标准物的实时测定
对于终点PCR,用被生物素标记的正向引物(SEQ ID NO:7)和未被标记的反向引物(SEQ ID NO:9)扩增HIV-1 DNA。用被地高辛(Dig)标记的HIV-1探针(SEQ ID NO:45)探测扩增子。结果示于下表7中。
用未被标记的正向引物(SEQ ID NO:35)和被生物素标记的反向引物(SEQ ID NO:36)扩增HIV-2 DNA。用被地高辛(Dig)标记的HIV-2探针(SEQ ID NO:49)探测扩增子。
Dig HIV-1:Dig/-TTTTTTTTTTTTTTTGGAACCCACTGCTTA(SEQ ID NO:45)
Dig HIV-2:Dig/-TTTTTTTTTTTTTTTCCAGCAGTAGCAGGT(SEQ ID NO:49)
如表7所示,HIV-1探针能够检测到4至40000个拷贝的HIV-1,并且对HIV-1具有特异性。HIV-2探针也能够检测出4至40000个拷贝的HIV-2,并且对HIV-2具有特异性。
表7 HIV-1和HIV-2标准物的终点PCR测定
显示的结果是两次重复测定的平均值。
这些结果表明,实时PCR和终点PCR测定都提供了无交叉反应性的HIV-1或HIV-2的特异性检测。
实施例10 CD14+分离细胞的实时和终点PCR测定的比较
重复实施例8中描述的测定。然而,在实验中,HIV-1血浆标准物被进一步稀释,以提供0.2拷贝/μl和0.4拷贝/μl。终点PCR的PCR循环个数也从50个减少到40个。
从HIV-1感染的受试者中获取血样,并将他们的白细胞分离成CD14阳性(CD14+)和CD14阴性(CD14-)细胞。CD14+细胞构成白细胞的约三分之一,且主要是单核细胞群体。这些细胞在外周血液中分化成巨噬细胞,并在脑中分化成小胶质细胞。CD14-细胞构成白细胞的约三分之二,且包含CD4+T细胞。
从受试者获得6ml血样,用于分离成CD14+和CD14-细胞群体。受试者分为两类,抗病毒治疗成功的受试者和治疗失败的受试者。治疗成功的受试者被定义为那些HIV-1血浆水平受到抗逆转录病毒疗法(ART)控制的受试者。他们的HIV-1病毒载量连续两年低于检测水平。治疗失败的受试者被定义为在2年内HIV-1血浆病毒载量可检测(即血浆中20-400拷贝/ml)的受试者。
使用正向引物(SEQ ID NO:7)和反向引物(SEQ ID NO:9),通过终点PCR扩增HIV-1DNA 40个循环。使用正向引物(SEQ ID NO:7)和反向引物(SEQ ID NO:9),通过实时PCR扩增HIV-1 DNA 50个循环。
如上所示地制备质粒标准物的系列稀释液,在50μl PCR反应中使用8μl标准物。
结果在表8中示出。
表8从血液中分离的CD14+和CD14-细胞的实时和终点PCR测定
治疗成功的受试者由∧表示。治疗失败的受试者由#表示。
显示的结果是两次重复测定的平均值。
如表8所示,实时PCR的检测极限为4拷贝/μl的HIV-1 DNA标准物。终点测定能够检测0.4拷贝/μl的HIV-1 DNA,并因此比实时PCR测定更加灵敏。
实时PCR分析显示来自受试者的大多数CD14细胞群体中检测到HIV-1。然而,该测定在来自治疗失败的受试者的CD14+细胞群体中没有检测到HIV-1。相反,终点测定能够在所有CD14-细胞群体(无论是治疗阳性还是治疗阴性)和来自治疗失败受试者的CD14+细胞群体中检测到HIV-1 DNA,这表明终点测定提供了更灵敏的检测方法。
实施例11
HIV-2临床样品的分析
在这个实施例中,发明人想要确定停止ART后血浆HIV-2水平是否会升高(即反弹)。本实施例显示了在ART治疗下的潜伏HIV-2感染的受试者。
本实施例涉及一个受试者,她的HIV-2血浆病毒载量(pVL,即血浆中的HIV-2拷贝数)由于她的ART治疗持续受到抑制。两年来,该受试者一直受到监测,她的pVL低于检测极限。该受试者,违背了医生的建议,于2017年6月中旬停止服用她的ART。停止ART一个月后,从该受试者获得血样。
从受试者样品中提取血浆,并使用正向引物(SEQ ID NO:35)和反向引物(SEQ IDNO:36)以及探针(SEQ ID NO:37)确定HIV-2 RNA的存在。用50个PCR循环进行终点和实时PCR扩增。
将受试者的样品与(i)HIV-2质粒标准物(2至20,000个拷贝的HIV-2质粒DNA)、(ii)HIV-2阳性对照样品、(iii)两种HIV-2 RNA掺加的对照,这两种对照是通过将两种不同浓度(一种高浓度和一种低浓度)的HIV-2RNA(释放到HIV-2感染的CD4+细胞的培养上清液中)掺加到正常血浆中而制备的,和(iv)阴性对照(阴性血浆样品)进行比较。
实时PCR分析和终点PCR分析的结果显示在下表9中。
表9 HIV-2临床样品的PCR测定
如表9所示,实时PCR能够检测受试者样品以及掺加的对照和阳性对照中HIV-2的存在。因此,测定证实该受试者在她的血液中仍含有HIV-2。
此外,终点PCR检测到受试者的样品以及掺加的对照和阳性对照中HIV-2的存在。因此,测定也证实了该受试者在她的血液仍然含有HIV-2中。
实施例12 HIV-1临床样品的分析
本实施例中展示了两个受试者案例研究。第一个受试者(受试者320)具有高HIV-1抗体滴度。蛋白质印迹分析显示,受试者血浆中存在针对所有HIV-1(env、gag、pol)的HIV-1抗体。基于血清学,受试者具有确定的HIV-1感染,但是她的pVL是阴性的。她没有接受任何ART。
关于第二个受试者(受试者321),蛋白质印迹分析没有结论,且已经持续了几年。受试者的pVL为阴性,且他没有接受任何ART。基于血清学,受试者被认为可能是HIV-1阴性,但是需要更灵敏的测定来确定受试者是否最终是HIV-1阴性。
如方法和DNA提取中所述,从全血中分离出PBMC。为了进行测定验证,与以下对照一起运行样品:(i)含有0、0.2、0.4、4、40和400拷贝/μl的HIV-1质粒标准物,(ii)在1×106个HUT78细胞中含有40个OM10.1细胞的阳性对照;(iii)另一阳性对照是来自已知HIV-1阳性受试者(受试者291)的样品,和(iv)作为阴性对照的HUT-78细胞系。当测定检测到40个OM10.1细胞时,该测定被认为是有效的。
使用正向引物(SEQ ID NO:7)和反向引物(SEQ ID NO:9)以及HIV-1探针(SEQ IDNO:6)以两次重复进行实时PCR。使用被生物素标记的反向引物(SEQ ID NO:9)、未被标记的正向引物(SEQ ID NO:7)和被双加氧素标记的HIV-1探针(SEQ ID NO:45),也以两次重复进行了终点PCR。实时PCR和终点PCR两者都以50个循环在相同运行中进行。
受试者的分析显示于下表10中。
表10 HIV-1临床样品的PCR测定
关于实时测定,受试者320显示出一个阳性结果和一个阴性结果,这表明HIV-1水平刚好在该测定的检测极限上。该受试者的估测HIV-1拷贝数为每106个PBMC有27个HIV-1感染细胞(0.0027%)。受试者321对HIV-1明显呈阴性。
关于终点测定,受试者320明显为阳性,并且受试者321明显为阴性。
实施例13母亲和新生儿中HIV-1的分析
这个实施例描述了对母亲(受试者118)和她的2个月婴儿(受试者142)的分析。这位母亲以前被诊断为HIV-1阳性,但是当用试验测定(Cepheid)和标准病毒载量测定测试时,HIV-1不能被检测到。需要更灵敏的测定来确定母亲和婴儿的HIV状况。
根据本公开中描述的方法,通过实时PCR进行HIV-1 DNA和RNA的定量。DNA和RNA分别从2ml全血(总共4ml全血)中提取,其中使用标准ficoll-hypaque密度梯度离心分离了PBMC。从受试者118获得的样品以两次重复运行。从受试者142获得的样品运行四次。
每个测定确定的拷贝数如下所示:
表11 HIV-1拷贝数
受试者 | HIV-1拷贝数/10<sup>6</sup>个细胞 | HIV状态 |
HIV-1 DNA测定 | ||
受试者118(母亲) | 1.82 | 阳性 |
受试者142(婴儿) | 0 | 阴性 |
阴性对照 | 0 | 阴性 |
阳性对照(受试者95) | 34 | 阳性 |
阳性对照(受试者97) | 1410 | 阳性 |
HIV-1 RNA转录测定 | ||
受试者118(母亲) | 51 | 阳性 |
阴性对照 | 0 | 阴性 |
阳性对照(受试者95) | 598 | 阳性 |
受试者95是HIV-1阳性个体,其pVL低于20拷贝数/ml,CD4+计数为588。
受试者97是HIV-1阳性的免疫失败个体;VL被抑制在20拷贝数/ml以下,且CD4计数低。
因此,该测定可以明确诊断母亲为HIV-1阳性,且婴儿为HIV-1阴性。T/A克隆证实了扩增的序列是HIV-1的R区域序列。序列数据表明,HIV-1Taqman探针测定检测到从样品中提取的HIV-1 R区域序列。
实施例14由GeneXpart和病毒载量确定为阴性的样品的分析。
本实施例描述了先前通过GeneXpart测定和病毒载量测定被发现是HIV-1阴性的受试者(受试者197)中HIV-1 DNA的定量。
根据本公开内容中描述的方法,通过实时PCR进行HIV-1 DNA的定量(三次重复)。结果总结在表12中。
表12 HIV-1拷贝数
受试者 | HIV-1拷贝数/10<sup>6</sup>个细胞 | HIV状态 |
受试者197 | 108 | 阳性 |
阴性对照(受试者94) | 0 | 阴性 |
阳性对照(受试者124) | 983 | 阳性 |
受试者124是具有免疫失败的HIV-1阳性对照;VL被抑制在低于20拷贝数/ml,且CD4计数低。用裂解缓冲液从样品中提取DNA。
因此,该测定可以明确诊断该受试者为HIV-1阳性。T/A克隆证实了被扩增的序列是HIV-1的R区域序列。序列数据表明,HIV-1 Taqman探针测定检测到了从样品中提取的HIV-1 R区域序列。
实施例15 HIV-1转录测定
从St Vincent’s Hospital获得的26份受试者样品中DNA和RNA的自动提取是使用Maxwell提取仪(Promega)进行准备的。DNA和RNA的定量是根据本文描述的方案确定的。检查了28名受试者的病历,并将受试者分为两组:第一组是“最优ART”组(n=7),且第二组是“次优ART”组(n=21)。最优ART组是那些pVL持续受抑制至少6个月,且CD4+ T细胞计数超过500个的受试者。“次优ART”组(n=21)经历了短暂性变动(6个月的时间段内pVL偶尔和短暂升高)和免疫失败(CD4+ T细胞计数低于500计数/μl)。
如图14A所示,两组受试者(即,最优ART和次优ART组)之间血浆VL没有差异,且它们的水平低于测定的检测极限。
当检查HIV-1 DNA水平时(图14B),观察到两组之间存在一些差异。当检查RNA水平(转录活性)时,这一点更加明显(图14C)。如本文所述,定量被确定和被归一化。
如图15所示,“最优ART”组中的另一组被识别出来,其被称为“改进的最优ART”。这个组被定义为HIV-1 DNA少于每1×106个细胞400拷贝的受试者。这一组,很少显示正在进行的RNA表达,这很可能是由于转录抑制所致。因此,HIV-1整合进基因组减少了。理想情况下,ART的目标是让受试者进入改进的最优ART类别。
因此,示出的数据提供了一种评估受试者中,特别是当受试者接受ART时,HIV RNA转录活性的方法。
实施例16 HIV-1潜伏感染细胞中HIV-1活化的证据
众所周知,当暴露于HIV-1刺激物时,HIV-1可以从潜伏感染的细胞储库被活化。如果潜伏感染的细胞储库被活化,预计转录水平会增加。本实施例通过测量暴露于各种刺激物后的RNA转录来检验这一假设。
检验了十四(14)名被ART成功治疗的受试者。这些受试者的pVL水平低于检测极限,并且CD4+ T细胞计数超过500个细胞/μl。
从每个受试者获得PBMC(3-6ml之间),并分成四个相等的部分(优选每个部分含有>1×106个细胞)。如果细胞数量对于给定的受试者来说不够,那么PBMC被分成三部分。
这些组按如下指定:
组1:BI(BI-2536);Polo样激酶(PLK)抑制剂
组2:JQ1;Barmodomain抑制剂
组3:PMA;佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(HIV活化剂)
组4:对照组(无刺激物)
PBMC在CO2培养箱中,在24孔板中在存在指定试剂的具有20%FBC的RPMI培养基中,培养14小时。14小时后,从培养的PBMC中提取总RNA。根据本文描述的方法进行HIV-RNA的分析。
如图16所示,在活化刺激物存在的情况下,HIV-1转录受到活化,并且这种增加的转录可以被检测到,尽管活化程度因受试者而异,这表明HIV-1潜伏的机制是多种多样的,并且可能需要一种以上的机制来从潜伏状态转变为活化状态。因此,该测定允许检测潜伏感染细胞中的HIV,这些潜伏感染细胞的pVL通常在患者血浆VL的检测极限之下。数据证实了已开发的测定检测到的转录活性是真实的信号,因为与对照培养物(不存在刺激物)相比,在培养基中存在HIV-1刺激物的情况下,转录活性的水平提高了。
实施例16通过终点测定定量HIV
该实施例示出了通过终点PCR对HIV-1的定量。PCR循环次数减少到40次循环,而不是进行50次扩增循环。对来自八(8)名受试者的样品进行了检查。简而言之,用MaxwellExtraction System(Promega)提取来自从每个受试者获得的PBMC的DNA,然后进行40个循环的PCR扩增。使用正向引物(SEQ ID NO:7)和反向引物(SEQ ID NO:9)以及探针(SEQ IDNO:6)进行扩增。从质粒标准物产生的PCR曲线如图17所示,并且根据该标准曲线确定估测的拷贝数。
结果总结在下表13中。
表13终点PCR扩增产物的定量
实施例17干血斑测试(DBS)生物采样的PCR测定
对干血斑(DBS)样品进行实时PCR和终点PCR分析。对于该分析,通过实时PCR和终点PCR扩增了8个具有不同HIV-1 RNA拷贝数(pVL)的样品。从这些样品中,70μl全血被点样在DBS纸上,并且RNA从这些被点样的样品中提取出来。
如表14所示,可以使用实时PCR和终点PCR测定方法检测样品中的HIV-1 RNA。对于实时PCR,使用正向引物(SEQ ID NO:7)和反向引物(SEQ ID NO:9)以及探针(SEQ ID NO:6)进行扩增。对于终点PCR,使用未标记的正向引物(SEQ ID NO:7)和被生物素标记的反向引物(SEQ ID NO:9)以及被Dig标记的探针(SEQ ID NO:45)进行扩增。
这些结果表明,可以从偏远地区或开发不足或资源不足的地区收集样品,并转移到可以进行分析的地点。
表14 DBS的PCR分析
序列表
<110> 圣文森特医院悉尼有限公司
<120> 检测慢病毒的方法
<130> 526207
<141> 2017年09月07日
<160> 53
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 95
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒类型 1
<400> 1
gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact 60
gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttc 95
<210> 2
<211> 124
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒类型 2
<400> 2
ttgagccctg ggaggttctc tccagcacta gcaggtagag cctgggtgtt ccctgctaga 60
ctctcaccag cacttggccg gtgctgggca gacggcccca cgcttgcttg cttaaaaacc 120
tcct 124
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒类型 1
<400> 3
taagcagtgg gttccct 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-1 R区域探针寡核苷酸序列
<400> 4
agggaaccca ctgctta 17
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有报告物和猝灭剂的HIV-1 R区域探针寡核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 腺嘌呤与X连接,其中X是报告分子
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 腺嘌呤与Z连接,其中Z是猝灭分子。
<400> 5
agggaaccca ctgctta 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有锁核酸的HIV-1 R区域探针寡核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 腺嘌呤与FAM(羧基荧光素)连接
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 锁核酸鸟嘌呤
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(5)
<223> 锁核酸腺嘌呤
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(7)
<223> 锁核酸胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (11)..(11)
<223> 锁核酸胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(13)
<223> 锁核酸鸟嘌呤
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 腺嘌呤与BHQ-1连接
<400> 6
agggaaccca ctgctta 17
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒类型 1
<400> 7
gagcctggga gctctctg 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒类型 1
<400> 8
cagagagctc ccaggctc 18
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-1反向R区域引物
<400> 9
actcaaggca agctttattg aggc 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒类型 1
<400> 10
gcctcaataa agcttgcctt gagt 24
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒类型 2
<400> 11
gcctgggtgt tccctgctag actct 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-2 R区域探针寡核苷酸序列
<400> 12
agagtctagc agggaacacc caggc 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有报告物和猝灭剂的HIV-2 R区域探针寡核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 腺嘌呤与X连接,其中X是报告分子
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 胞嘧啶与Z连接,其中Z是猝灭分子
<400> 13
agagtctagc agggaacacc caggc 25
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-2正向R区域引物
<400> 14
gagccctgag aggttctc 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒类型 2
<400> 15
gagaacctcc cagggctc 18
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-2反向R区域引物
<400> 16
ggtctttaag caagcaagcg tgg 23
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH探针寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 腺嘌呤与FAM(羧基荧光素)连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> 胸腺嘧啶与猝灭分子BHQ-1连接
<400> 17
aaggtcggag tcaacggatt tggtcgt 27
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH 正向引物
<400> 18
ggcaacaata tccactttac cag 23
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH 反向引物
<400> 19
tcgacagtca gccgcatctt 20
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B-肌动蛋白探针寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 腺嘌呤与FAM(羧基荧光素)连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 鸟嘌呤与猝灭分子BHQ-1连接
<400> 20
atgccctccc ccatgccatc ctgcg 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B-肌动蛋白正向引物
<400> 21
tcacccacac tgtgcccatc tacga 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B-肌动蛋白反向引物
<400> 22
cagcggaacc gctcattgcc aatgg 25
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' LTR 正向引物
<400> 23
ccaaagaaga caagatatcc ttga 24
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' LTR 反向引物
<400> 24
ttgaggctta agcagtgg 18
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' LTR 探针寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 胸腺嘧啶与FAM(羧基荧光素)连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> 胞嘧啶与猝灭分子BHQ-1连接
<400> 25
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctc 29
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gag 正向引物
<400> 26
agtgggggga catcaagcag ccatgcaaat 30
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gag 反向引物
<400> 27
tactagtagt tcctgctatg tcacttcc 28
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gag 探针寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 腺嘌呤与FAM(羧基荧光素)连接
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 锁核酸胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (4)..(4)
<223> 锁核酸腺嘌呤
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(7)
<223> 锁核酸鸟嘌呤
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(13)
<223> 锁核酸鸟嘌呤
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(16)
<223> 锁核酸鸟嘌呤
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 胞嘧啶与猝灭分子BHQ-1连接
<400> 28
atcaatgagg aagctgc 17
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-1正向R区域引物 (HIV-1 For 2)
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> T 或 C
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> T 或 C
<400> 29
gagccnggga gctcnctg 18
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-1反向R区域引物 (HIV-1 Rev 2)
<400> 30
actcaaggca agctttattg ag 22
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-2正向R区域引物 (HIV-2 For 1)
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> G 或 A
<400> 31
gagccctgng aggttctc 18
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-2 反向R区域引物 (HIV-2 Rev 1)
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T 或 C
<400> 32
ggtntttaag caagcaagcg tgg 23
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-2 正向R区域引物 (HIV-2 For 2)
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> G 或 A
<400> 33
gagccctgng aggttctc 18
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-2 反向R区域引物 (HIV-2 Rev 2)
<400> 34
agggaacacc caggctct 18
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-2 正向R区域引物 (HIV 2 For 3)
<400> 35
ttgagccctg ggaggttct 19
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-2 反向R区域引物 (HIV-2 Rev 3)
<400> 36
ggaacaccca ggctctac 18
<210> 37
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-2 R区域探针寡核苷酸序列 (HIV-2 Pro 2)
<400> 37
ctgctagtgc tgga 14
<210> 38
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有报告物和猝灭剂的HIV-2 R区域探针寡核苷酸序列 (HIV-2 Pro 2)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 胞嘧啶与X连接,其中X是报告分子
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 腺嘌呤与Z连接,其中Z是猝灭分子
<400> 38
ctgctagtgc tgga 14
<210> 39
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FAM和BHQ-1的HIV-2 R区域探针寡核苷酸序列 (HIV-2 Pro 2)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 胞嘧啶与FAM(羧基荧光素)连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 腺嘌呤与猝灭分子BHQ-1连接
<400> 39
ctgctagtgc tgga 14
<210> 40
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有锁核酸、FAM 和BHQ-1的HIV-2 R区域探针寡核苷酸序列 (HIV-2 Pro 2)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 胞嘧啶与FAM(羧基荧光素)连接
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(2)
<223> 锁核酸胸腺嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (4)..(4)
<223> 锁核酸胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(6)
<223> 锁核酸腺嘌呤
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(8)
<223> 锁核酸胸腺嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(9)
<223> 锁核酸鸟嘌呤
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(13)
<223> 锁核酸鸟嘌呤
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 腺嘌呤与猝灭分子BHQ-1连接
<400> 40
ctgctagtgc tgga 14
<210> 41
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-2 R区域探针寡核苷酸序列 (HIV-2 Pro 3)
<400> 41
tccagcacta gcag 14
<210> 42
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有报告物和猝灭剂的HIV-2 R区域探针寡核苷酸 (HIV-2 Pro 3)序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 胸腺嘧啶与X连接,其中X是报告分子
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 鸟嘌呤与Z连接,其中Z是猝灭分子
<400> 42
tccagcacta gcag 14
<210> 43
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FAM和BHQ-1的HIV-2 R区域探针寡核苷酸序列 (HIV-2 Pro 3)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 胸腺嘧啶与FAM(羧基荧光素)连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 鸟嘌呤与猝灭分子BHQ-1连接
<400> 43
tccagcacta gcag 14
<210> 44
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有锁核酸、FAM和BHQ-1的HIV-2 R区域探针寡核苷酸序列 (HIV-2 Pro 3)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 胸腺嘧啶与FAM(羧基荧光素)连接
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(2)
<223> 锁核酸胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (4)..(4)
<223> 锁核酸腺嘌呤
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(6)
<223> 锁核酸胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(8)
<223> 锁核酸胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (10)..(10)
<223> 锁核酸腺嘌呤
<220>
<221> modified_base
<222> (12)..(12)
<223> 锁核酸胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 鸟嘌呤与猝灭分子BHQ-1连接
<400> 44
tccagcacta gcag 14
<210> 45
<211> 16
<212> DNA
<213> HIV-1 R区域探针寡核苷酸序列 (HIV-1 Pro 2)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5-20个T核苷酸
<400> 45
nggaacccac tgctta 16
<210> 46
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有报告物和猝灭剂的HIV-1 R区域探针寡核苷酸序列 (HIV-1 Pro 2)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 鸟嘌呤X连接,其中X是报告分子
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 腺嘌呤与Z连接,其中Z是猝灭分子
<400> 46
ggaacccact gctta 15
<210> 47
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-1 R区域探针寡核苷酸序列 (HIV-1 Pro 3)
<400> 47
agggaaccca ctgct 15
<210> 48
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有报告物和猝灭剂的HIV-1 R区域探针寡核苷酸序列 (HIV-1 Pro 3)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 腺嘌呤与X连接,其中X是报告分子
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 胸腺嘧啶Z连接,其中Z是猝灭分子
<400> 48
agggaaccca ctgct 15
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-2 R区域探针寡核苷酸序列(HIV-2 Pro 4)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5-20个T核苷酸
<400> 49
ntccagcact agcaggt 17
<210> 50
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有报告物和猝灭剂的HIV-2 R区域探针寡核苷酸序列(HIV-2 Pro 4)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 胸腺嘧啶与X连接,其中X是报告分子
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 胸腺嘧啶与Z连接,其中Z是猝灭分子
<400> 50
tccagcacta gcaggt 16
<210> 51
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-2 R区域探针寡核苷酸序列(HIV-2 Pro 5)
<400> 51
ctccagcact agcag 15
<210> 52
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有报告物和猝灭剂的HIV-2 R区域探针寡核苷酸序列(HIV-2 Pro 5)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 胞嘧啶与X连接,其中X是报告分子
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 鸟嘌呤与Z连接,其中Z是猝灭分子
<400> 52
ctccagcact agcag 15
<210> 53
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有锁核酸的HIV-2 R区域探针寡核苷酸序列 (HIV-2 Pro-5)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 锁核酸胸腺嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> 锁核酸腺嘌呤
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> 锁核酸鸟嘌呤
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 锁核酸 腺嘌呤
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 锁核酸腺嘌呤
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 锁核酸胞嘧啶
<400> 53
ctccagcact agcag 15
Claims (53)
1.一种在具有人类免疫缺陷病毒(HIV)的受试者或怀疑患有HIV感染(AIDS)的受试者中检测HIV的方法,所述方法包括对从所述受试者获得的生物样品中的R区域核酸进行PCR扩增,其中所述扩增包括与位于HIV的长末端重复(LTR)的R区域内的序列杂交的正向引物和反向引物,和随后检测任何扩增,其中检测到扩增表明所述受试者中存在HIV。
2.根据权利要求1所述的方法,其中检测扩增用被标记的寡核苷酸探针来执行,所述被标记的寡核苷酸探针与被扩增的R区域序列内的序列杂交。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中所述核酸是DNA或逆转录RNA(cDNA)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述HIV是HIV-1或HIV-2。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述PCR是实时PCR。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述PCR是终点PCR。
7.一种用于定量来自具有HIV的受试者或怀疑患有HIV感染的受试者的生物样品中的HIV DNA拷贝数的方法,所述方法包括:
(i)根据权利要求1所述扩增和检测HIV-R区域序列;和
(ii)通过参考相应的HIV质粒标准物对被扩增的HIV-R区域序列进行定量,以获得每体积样品的HIV DNA拷贝数。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述扩增是实时PCR或终点PCR。
9.根据权利要求7或8所述的方法,还包括针对DNA标准物来归一化HIV DNA拷贝数,以获得生物样品中每一个或更多个细胞的HIV DNA拷贝数。
10.一种通过针对标准物归一化来定量来自具有HIV的受试者或怀疑患有HIV感染的受试者的生物样品中的HIV DNA拷贝数的方法,所述方法包括:
(i)根据权利要求1至6中任一项所述扩增和检测HIV-R区域序列;
(ii)通过参考相应的HIV标准物,经由定量PCR来定量所述样品中每体积DNA的HIV-R区域的拷贝数;
(iii)使用相应的管家标准物通过定量PCR来定量内源性管家基因,以获得所述内源性基因的拷贝数,所述内源性基因的拷贝数表示为样品中存在的每体积DNA的管家基因拷贝数;
(iv)将获得的拷贝数除以细胞中内源性基因的拷贝数,以得出所述样品中每体积DNA的细胞数;和
(v)通过将(i)中获得的值除以(iii)中获得的值来计算每个细胞的HIV-R区域DNA拷贝数,从而归一化HIV DNA拷贝数,以获得所述生物样品中的HIV-R区域DNA拷贝数(拷贝数/细胞)。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述DNA标准物是肌动蛋白。
12.一种用于定量来自具有HIV的受试者或怀疑患有HIV感染的受试者的生物样品中的HIV DNA拷贝数的方法,所述方法包括:
(i)根据权利要求1-6中任一项所述扩增和检测HIV-R区域序列;
(ii)通过测量所述样品中DNA的吸光度来定量所述样品中每体积的DNA质量(w/v);
(iii)基于DNA吸光度计算所述样品中每体积DNA的细胞数;和
(v)通过将(ii)中获得的值除以(iv)中获得的值来计算每个细胞的HIV-R区域DNA拷贝数,从而归一化HIV DNA拷贝数,以获得所述生物样品中的HIV-R区域DNA拷贝数(拷贝数/细胞)。
13.根据权利要求12所述的方法,其中定量所述样品中每体积的DNA质量包括DNA嵌入染料和测量所述染料发出的荧光。
14.根据权利要求7至13中任一项所述的方法,包括:
(i)获得其中提取了DNA的所述样品的等分试样;
(ii)将所述等分试样与被标记的水解寡核苷酸探针接触,所述水解寡核苷酸探针与HIV DNA的长末端重复(LTR)的R区域序列杂交;
(iii)将所述等分试样与正向引物和反向引物接触,所述正向引物和反向引物与所述R区域序列内的序列杂交;
(iv)通过PCR扩增所述R区域序列;
(v)将从被标记的寡核苷酸获得的信号外推至通过HIV标准物的系列稀释物的相应扩增而获得的标准曲线,以得出所述等分试样中每体积DNA的HIV-R区域DNA拷贝数。
15.根据权利要求1-4或7-8中任一项所述的方法,其中所述正向引物或反向引物被用生物素标记,并且所述探针被用地高辛(Dig)标记。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述正向引物包含根据以下的序列或由根据以下的序列组成:SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35。
17.根据权利要求15或16所述的方法,其中反向引物包含根据以下的序列或由根据以下的序列组成:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法,其中所述被标记的探针包含根据以下的序列或由根据以下的序列组成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49,或SEQ ID NO:51。
19.一种用于监测正在向HIV阳性受试者施用的抗逆转录病毒疗法(ART)的方法,包括在至少两个时间点上根据权利要求7至18中任一项所述定量HIV DNA拷贝数,并比较所述至少两个时间点之间的HIV R区域DNA拷贝数的差异,其中所述HIV R区域DNA拷贝数的减少表明所述受试者正在接受最优/有效的ART。
20.根据权利要求19所述的方法,还包括调节向所述受试者施用的ART的剂量或类型。
21.一种用于定量来自具有HIV的受试者或怀疑患有HIV感染的受试者的生物样品中的HIV RNA拷贝数的方法,所述方法包括:
(i)根据权利要求1至6中任一项所述扩增和检测逆转录的HIV RNA R区域序列上的HIV-R区域序列;和
(ii)通过参考相应的HIV质粒标准物对被扩增的HIV-R区域序列进行定量,以获得每体积样品的HIV RNA的拷贝数。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述扩增是实时PCR或终点PCR。
23.根据权利要求21或22的方法,还包括针对RNA标准物对HIV RNA拷贝数进行归一化,以获得所述生物样品中每一个或更多个细胞的HIV RNA拷贝数。
24.一种通过针对标准物归一化来定量来自具有HIV的受试者或怀疑患有HIV感染的受试者的生物样品中的HIV RNA拷贝数的方法,所述方法包括:
(i)根据权利要求1至6中任一项所述扩增和检测逆转录的HIV RNA R区域序列上的HIV-R区域序列;
(ii)通过参考相应的HIV标准物,经由定量PCR来定量所述样品中每体积RNA的HIV-R区域拷贝数;
(iii)使用相应的管家标准物通过定量PCR来定量内源性管家基因,以获得内源性基因的拷贝数,所述内源性基因的拷贝数表示为样品中存在的每体积RNA的管家基因拷贝数;
(iv)将获得的拷贝数除以细胞中内源性基因的拷贝数,以得到所述样品中每体积RNA的细胞数;和
(v)通过将(i)中获得的值除以(iii)中获得的值来计算每个细胞的HIV-R区域RNA拷贝数,从而归一化HIV RNA拷贝数,以获得所述生物样品中的HIV-R区域RNA拷贝数(拷贝数/细胞)。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述RNA标准物是GAPDH。
26.一种用于定量来自具有HIV的受试者或怀疑患有HIV感染的受试者的生物样品中的HIV RNA拷贝数的方法,所述方法包括:
(i)根据权利要求1至6中任一项所述扩增和检测逆转录的HIV RNA R区域序列上的HIV-R区域序列;
(ii)通过测量所述样品中RNA的吸光度来定量所述样品中每体积RNA的质量(w/v);
(iii)基于RNA吸光度计算所述样品中每体积RNA的细胞数;和
(iv)通过将(ii)中获得的值除以(iv)中获得的值来计算每个细胞的HIV-R区域RNA拷贝数,从而归一化HIV RNA拷贝数,以获得所述生物样品中的HIV-R区域RNA拷贝数(拷贝数/细胞)。
27.根据权利要求25所述的方法,其中定量所述样品中每体积的RNA质量包括RNA嵌入染料和测量所述染料发出的荧光。
28.根据权利要求21至27的任一项所述的方法,其中所述HIV-R区域通过以下被定量:
(i)获得其中已经提取了DNA的所述样品的等分试样;
(ii)将所述等分试样与被标记的水解寡核苷酸探针接触,该探针与逆转录的HIV RNA(cDNA)的长末端重复(LTR)的R区域序列杂交;
(iii)进一步将所述等分试样与正向引物和反向引物接触,所述正向引物和反向引物与逆转录的HIV RNA(cDNA)的R区域内的序列杂交;
(iv)通过PCR扩增所述R区域序列;
(v)将从被标记的寡核苷酸获得的信号外推至通过HIV标准物的系列稀释物的相应扩增获得的标准曲线,以得出所述等分试样中每体积RNA的HIV-R区域RNA拷贝数。
29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法,还包括从所述受试者获得生物样品,和从所述样品制备RNA。
30.一种用于评估向HIV阳性受试者施用的抗逆转录病毒疗法(ART)的有效性的方法,所述方法包括:
(i)根据权利要求7至14中任一项所述定量HIV-R区域DNA拷贝数;
(ii)根据权利要求21至29中任一项所述定量HIV-R区域RNA拷贝数;
(iii)通过将步骤(i)中获得的值除以步骤(ii)中获得的值来确定样品中归一化的HIVRNA拷贝数;和
(iv)将所述归一化的HIV RNA拷贝数的值与从同一受试者获得的一个或更多个先前的归一化值进行比较;
其中所述归一化的HIV RNA拷贝数的减少表明所述受试者正在接受最优/有效的ART。
31.根据权利要求30所述的方法,还包括从所述受试者获得生物样品,和从所述样品制备DNA和RNA。
32.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述生物样品是选自血液或组织或其中存在HIV感染细胞的任何其他生物流体的细胞群体。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述生物样品是PBMC。
34.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述R区域序列由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2中列出的序列组成。
35.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述水解寡核苷酸是探针。
36.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述寡核苷酸探针与以下序列结合:包含SEQ ID NO:1中列出的HIV-1 R区域序列内的约13至40个连续核苷酸或与该连续核苷酸至少70%相同的序列,或由SEQ ID NO:1中列出的HIV-1 R区域序列内的约13至40个连续核苷酸或与该连续核苷酸至少70%相同的序列组成的序列。
37.根据权利要求32所述的方法,其中所述寡核苷酸探针与以下序列结合:包含序列5’TAAGCAGTGGGTTCCCT3’(SEQ ID NO:3)或与其至少70%相同的序列,或由序列5’TAAGCAGTGGGTTCCCT3’(SEQ ID NO:3)或与其至少70%相同的序列组成的序列。
38.根据权利要求36或37所述的方法,其中所述寡核苷酸探针包含以下序列或由以下序列组成:序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、或SEQ ID NO:48。
39.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述正向引物是HIV-1引物,所述HIV-1引物包含序列SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:29或与其至少75%相同的序列,或由序列SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:29或与其至少75%相同的序列组成。
40.根据任一前述权利要求所述的方法,其中,所述正向引物与HIV-1R区域序列杂交,所述HIV-1 R区域序列包含序列5’-CAGAGAGCTCCCAGGCTC-3’(SEQ ID NO:8)或与其至少75%相同的序列,或由序列5’-CAGAGAGCTCCCAGGCTC-3’(SEQ ID NO:8)或与其至少75%相同的序列组成。
41.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述反向引物是HIV-1引物,所述HIV-1引物包含序列SEQ ID NO:9或序列SEQ ID NO:30或与其至少75%相同的序列,或由序列SEQID NO:9或序列SEQ ID NO:30或与其至少75%相同的序列组成。
42.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述反向引物与HIV-1 R区域序列杂交,所述HIV-1 R区域序列包含序列5’GCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGT3’(SEQ ID NO:10)或与其至少75%相同的序列,或由序列5’GCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGT3’(SEQ ID NO:10)或与其至少75%相同的序列组成。
43.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述寡核苷酸探针与以下序列结合:包含SEQ ID NO:2中列出的HIV-2 R区域序列中的约17至30个连续核苷酸或与该连续核苷酸至少70%相同的序列,或由SEQ ID NO:2中列出的HIV-2 R区域序列中的约17至30个连续核苷酸或与该连续核苷酸至少70%相同的序列组成的序列。
44.根据权利要求43所述的方法,其中所述寡核苷酸与以下序列结合:包含序列5’GCCTGGGTGTTCCCTGCTAGACTCT3’(SEQ ID NO:11)或与其至少70%相同的序列,或由序列5’GCCTGGGTGTTCCCTGCTAGACTCT3’(SEQ ID NO:11)或与其至少70%相同的序列组成的序列。
45.根据权利要求43或44所述的方法,其中所述寡核苷酸探针包含以下序列或由以下序列组成:序列SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39,或SEQ ID NO:40、SEQ ID:41、SEQ ID:42、SEQ ID:43、SEQ ID:44、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53。
46.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述HIV-2正向引物包含根据SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35的序列或与其至少75%相同的序列,或由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35的序列或与其至少75%相同的序列组成。
47.根据任一前述权利要求中的方法,其中所述正向引物与HIV-2 R区域序列杂交,所述HIV-2 R区域序列包含序列5’-GAGAACCTCCCAGGGCTC-3’(SEQ ID NO:15)或与其至少75%相同的序列,或由序列5’-GAGAACCTCCCAGGGCTC-3’(SEQ ID NO:15)或与其至少75%相同的序列组成。
48.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述HIV-2反向引物包含序列SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36或与其至少75%相同的序列或由序列SEQID NO:16、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36或与其至少75%相同的序列组成。
49.一种用于扩增HIV-1核酸的组合物,包含被标记的寡核苷酸探针,所述被标记的寡核苷酸探针包含探针、正向引物和反向引物的组合或由探针、正向引物和反向引物的组合组成,所述探针、正向引物和反向引物的组合选自以下的一种或更多种的组合:
(i)寡核苷酸探针:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47,或SEQ ID NO:48;
(ii)正向引物:SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:29;和
(iii)反向引物:SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:30。
50.一种用于扩增HIV-2核酸的组合物,包含被标记的寡核苷酸,所述被标记的寡核苷酸包含探针、正向引物和反向引物的组合或由探针、正向引物和反向引物的组合组成,所述探针、正向引物和反向引物的组合选自以下的一种或更多种的组合:
(i)寡核苷酸探针:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID:41、SEQ ID:42、SEQ ID:43、SEQ ID:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53;
(iii)正向引物:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、或SEQ ID NO:35;
(iii)反向引物:SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36。
51.一种治疗HIV阳性受试者的方法,包括根据权利要求1至48中任一项所述检测或定量慢病毒核酸或HIV DNA和/或RNA,和向所述受试者施用ART。
52.一种试剂盒,所述试剂盒用于检测HIV-1或当用于检测HIV-1时,包含根据权利要求49所述的组合物,以及用于根据权利要求1至48中任一项所述检测和定量HIV-1的合适试剂和说明书。
53.一种试剂盒,所述试剂盒用于检测HIV-2,或当用于检测HIV-2时,包含根据权利要求50所述的组合物,以及用于根据权利要求1至48中任一项所述检测和定量HIV-2的合适试剂和说明书。
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WO (1) | WO2018045425A1 (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110945146A (zh) * | 2017-10-03 | 2020-03-31 | 雅培分子公司 | 检测人类免疫缺陷病毒(hiv)的测定法 |
CN111665351A (zh) * | 2020-06-20 | 2020-09-15 | 江南大学 | 一种快速、特异性测定rna含量的方法 |
CN111850171A (zh) * | 2020-08-03 | 2020-10-30 | 浙江大学 | 一种深海沉积物样品中慢病毒的检测方法 |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10688600B2 (en) | 2016-12-13 | 2020-06-23 | Caterpillar Inc. | Structure having stress protected groove weld and structural members forming the same |
CA3115524A1 (en) * | 2018-10-15 | 2020-04-23 | Win Den Cheung | Methods for measuring the infectivity of replication defective viral vectors and viruses |
CN113817809A (zh) * | 2020-06-18 | 2021-12-21 | 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 | 一种用于检测慢病毒载体拷贝数的方法及其应用 |
KR102564236B1 (ko) * | 2020-11-20 | 2023-08-16 | 대한민국(질병관리청장) | 인간 면역결핍 바이러스 타입 2를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 인간 면역결핍 바이러스 타입 2의 검출방법 |
WO2023126629A1 (en) * | 2021-12-31 | 2023-07-06 | Imperial College Innovations Limited | Method for detecting and/or quantifying a virus |
WO2024043322A1 (ja) * | 2022-08-25 | 2024-02-29 | 富士フイルム株式会社 | 目的ウイルスの製造方法、および培養組成物 |
Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6025124A (en) * | 1994-03-03 | 2000-02-15 | The Regents Of The University Of California | Marker, method and an assay for detection and monitoring of latency and activation of human immunodeficiency virus |
CN1268575A (zh) * | 1999-02-03 | 2000-10-04 | 奥索临床诊断有限公司 | 有效的多重检测丙型肝炎病毒(hcv)和人免疫缺损病毒(hiv)的寡核苷酸引物及其使用方法 |
CN1271020A (zh) * | 1999-02-02 | 2000-10-25 | 奥索临床诊断有限公司 | 有效检测hiv-1和hiv-2的寡核苷酸逆转录引物及其应用方法 |
US6429306B1 (en) * | 1986-01-22 | 2002-08-06 | Institut Pasteur | Nucleic acids of a human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) |
CN1429917A (zh) * | 2002-10-11 | 2003-07-16 | 薛永新 | 艾滋病毒原位核酸芯片及其制备方法 |
JP2003230387A (ja) * | 2002-02-07 | 2003-08-19 | Japan Science & Technology Corp | Hiv感染性クローンの樹立法 |
CN1446265A (zh) * | 2000-06-12 | 2003-10-01 | 病毒科学公司 | 检测抗反转录病毒治疗的方式与方法和在hiv/aids治疗中的指导治疗方案 |
US20090226886A1 (en) * | 2004-01-07 | 2009-09-10 | Masato Mitsuhashi | Primers and probes for the detection of hiv |
CN103045756A (zh) * | 2012-01-16 | 2013-04-17 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种荧光定量rt-pcr检测人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒 |
US20140370496A1 (en) * | 2012-01-25 | 2014-12-18 | Japan Science And Technology Agency | Oligonucleotide for hiv detection, hiv detection kit, and hiv detection method |
CN105624153A (zh) * | 2016-01-21 | 2016-06-01 | 中国医学科学院医学实验动物研究所 | 一种引物组及其在扩增siv/shiv基因组中的应用与试剂盒 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2082044C (en) * | 1990-05-04 | 1999-08-24 | David J. Ecker | Modulation of gene expression through interference with rna secondary structure |
US5576176A (en) * | 1994-03-03 | 1996-11-19 | The Regents Of The University Of California | Marker and an assay for detection and monitoring of human immunodeficiency virus latency and activation |
AU5856100A (en) | 1999-07-02 | 2001-01-22 | Universitair Medisch Centrum Utrecht | Antiviral therapy |
CA2433680A1 (en) * | 2000-12-28 | 2002-08-01 | Gregory M Arndt | Double-stranded rna-mediated gene suppression |
EP1508624A1 (en) * | 2003-08-22 | 2005-02-23 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | A quantification method for integrated viruses |
EP2044110A2 (en) * | 2006-07-11 | 2009-04-08 | Urban Scheuring | Compositions and methods for inhibiting hiv infections by inhibiting lerepo4 and glipr |
JP5972265B2 (ja) * | 2010-07-29 | 2016-08-17 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | ジェネリックpcr |
GB201015305D0 (en) * | 2010-09-14 | 2010-10-27 | Ucl Business Plc | Methods, compounds and compositions relating to activating a latent virus |
JP2017523166A (ja) | 2014-07-11 | 2017-08-17 | ビオノール イミュノ エーエスBionor Immuno As | ヒト免疫不全ウイルスi(hiv)の病理学的影響を減少及び/若しくは遅延させるか又は後天性免疫不全症候群(aids)を発症するリスクを低減させる方法 |
-
2017
- 2017-09-07 JP JP2019512898A patent/JP7203017B2/ja active Active
- 2017-09-07 EP EP17847818.6A patent/EP3510172B1/en active Active
- 2017-09-07 CN CN201780068868.7A patent/CN110023514A/zh active Pending
- 2017-09-07 US US16/331,444 patent/US20200002776A1/en active Pending
- 2017-09-07 WO PCT/AU2017/050974 patent/WO2018045425A1/en unknown
- 2017-09-07 CA CA3035808A patent/CA3035808A1/en active Pending
- 2017-09-07 EP EP23211323.3A patent/EP4365311A2/en active Pending
- 2017-09-07 AU AU2017325110A patent/AU2017325110C1/en active Active
-
2022
- 2022-12-26 JP JP2022208080A patent/JP2023036847A/ja active Pending
-
2023
- 2023-04-11 AU AU2023202203A patent/AU2023202203A1/en active Pending
Patent Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6429306B1 (en) * | 1986-01-22 | 2002-08-06 | Institut Pasteur | Nucleic acids of a human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) |
US6025124A (en) * | 1994-03-03 | 2000-02-15 | The Regents Of The University Of California | Marker, method and an assay for detection and monitoring of latency and activation of human immunodeficiency virus |
CN1271020A (zh) * | 1999-02-02 | 2000-10-25 | 奥索临床诊断有限公司 | 有效检测hiv-1和hiv-2的寡核苷酸逆转录引物及其应用方法 |
CN1268575A (zh) * | 1999-02-03 | 2000-10-04 | 奥索临床诊断有限公司 | 有效的多重检测丙型肝炎病毒(hcv)和人免疫缺损病毒(hiv)的寡核苷酸引物及其使用方法 |
CN1446265A (zh) * | 2000-06-12 | 2003-10-01 | 病毒科学公司 | 检测抗反转录病毒治疗的方式与方法和在hiv/aids治疗中的指导治疗方案 |
JP2003230387A (ja) * | 2002-02-07 | 2003-08-19 | Japan Science & Technology Corp | Hiv感染性クローンの樹立法 |
CN1429917A (zh) * | 2002-10-11 | 2003-07-16 | 薛永新 | 艾滋病毒原位核酸芯片及其制备方法 |
US20090226886A1 (en) * | 2004-01-07 | 2009-09-10 | Masato Mitsuhashi | Primers and probes for the detection of hiv |
CN103045756A (zh) * | 2012-01-16 | 2013-04-17 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种荧光定量rt-pcr检测人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒 |
US20140370496A1 (en) * | 2012-01-25 | 2014-12-18 | Japan Science And Technology Agency | Oligonucleotide for hiv detection, hiv detection kit, and hiv detection method |
CN105624153A (zh) * | 2016-01-21 | 2016-06-01 | 中国医学科学院医学实验动物研究所 | 一种引物组及其在扩增siv/shiv基因组中的应用与试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ALEXANDER O PASTERNAK 等: "Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence", 《RETROVIROLOGY》 * |
殷倩倩 等: "HIV-1感染者血浆病毒RNA与全血前病毒DNA的比较", 《中国艾滋病性病》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110945146A (zh) * | 2017-10-03 | 2020-03-31 | 雅培分子公司 | 检测人类免疫缺陷病毒(hiv)的测定法 |
CN110945146B (zh) * | 2017-10-03 | 2023-12-26 | 雅培分子公司 | 检测人类免疫缺陷病毒(hiv)的测定法 |
CN111665351A (zh) * | 2020-06-20 | 2020-09-15 | 江南大学 | 一种快速、特异性测定rna含量的方法 |
CN111850171A (zh) * | 2020-08-03 | 2020-10-30 | 浙江大学 | 一种深海沉积物样品中慢病毒的检测方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2023202203A1 (en) | 2023-05-04 |
WO2018045425A1 (en) | 2018-03-15 |
JP7203017B2 (ja) | 2023-01-12 |
US20200002776A1 (en) | 2020-01-02 |
AU2017325110C1 (en) | 2023-04-06 |
EP3510172A1 (en) | 2019-07-17 |
CA3035808A1 (en) | 2018-03-15 |
AU2017325110B2 (en) | 2023-01-12 |
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