CN111850171A - 一种深海沉积物样品中慢病毒的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种深海沉积物样品中慢病毒的检测方法，涉及深海沉积物样品中病毒的分离以及慢病毒的检测。本发明用全新的强特异性引物通过PCR来对深海沉积物样品中的慢病毒进行检测。本发明还通过对深海沉积物样品进行病毒分离，然后从分离到的病毒中提取病毒的DNA,经全基因组扩增，最终得到深海沉积物样品中的病毒核酸样品。本发明通过此种方法，可以对深海沉积物样品中的慢病毒进行快速检测。相对于传统的生理生化检测方法，该检测方法较为高效和精确，同时这种检测方法也为我们安全合理利用与开发海洋资源提供了参考意义。
Description
技术领域
本发明涉及深海沉积物样品中慢病毒的检测领域，具体涉及一种深海沉积物样品中慢病毒的检测方法。
背景技术
病毒是地球上最丰富的生物体，在地球的生物化学循环中发挥着极其重要的作用。而近些年来有学者发现，海洋环境中也分布着大量的病毒，据报道每ml海水中约含有10^6-10^7个病毒颗粒。并且病毒在海洋环境中发挥着极其重要的作用，可以通过与宿主之间相互作用，推动海洋生化循环。同时也有学者报道，在海洋环境中分布着大量与陆地上人源致病病毒高度同源的病毒，对于海洋病毒的探索，可以帮助我们更好地理解病毒的进化过程，也有助于我们对生物体的生命过程进行更深层次的探索。
近些年来，测序技术发展迅速。与此同时，宏基因组测序技术的成熟更好地帮助我们研究海洋环境中的病毒，发现新的病毒家族，增进我们对病毒这一生物体的认识。但是由于目前对于海洋环境中的病毒组成了解不够充分，缺乏一种快速检测海洋环境中病毒的方法，也缺乏一种安全合理开发与利用海洋资源的评估手段。
发明内容
本发明提供了一种深海沉积物样品中慢病毒的检测方法，使用全新的强特异性引物通过PCR来对深海沉积物样品中的慢病毒进行检测。
一种深海沉积物样品中慢病毒的检测方法，包括以下步骤：
1)通过在深海沉积物样品中加入缓冲液与玻璃珠，通过振荡，将病毒颗粒溶解于缓冲液，收集缓冲液上清，加入聚乙二醇静置，然后通过离心收集病毒，得到病毒悬液；
2)使用特异性的引物通过PCR反应对病毒悬液进行慢病毒的检测，检测是否含有慢病毒。
本发明中，使用全新的强特异性引物通过PCR来对深海沉积物样品中的慢病毒进行检测。通过此种方法，可以对深海沉积物样品中的慢病毒进行快速检测。相对于传统的生理生化检测方法，该检测方法较为高效和精确，同时这种检测方法也为我们安全合理利用与开发海洋资源提供了参考意义。
步骤1)中，所述的缓冲液采用SM buffer缓冲液。所述的聚乙二醇的分子量为4000～8000，进一步优选，为5500～6500，最优选的，采用PEG 6000。
通过离心收集病毒后采用缓冲液重悬得到病毒悬液。
收集缓冲液上清，具体包括：
通过0.1～0.32μm滤器过滤，滤除细菌。进一步优选，通过0.17～0.27μm滤器过滤，滤除细菌。所述的滤器为滤膜。
最优选的，通过0.22μm滤膜过滤，滤除细菌，得到纯净的病毒。
通过对深海沉积物样品进行病毒分离，然后从分离到的病毒中提取病毒的DNA，经全基因组扩增，最终得到深海沉积物样品中的病毒核酸样品，然后。
本发明提供从深海沉积物样品分离到的病毒悬液中通过PCR反应来检测慢病毒的技术方案。
步骤2)中，所述深海沉积物样品中慢病毒的检测，主要是通过使用特异性的引物通过PCR反应进行慢病毒的检测。
所述的特异性的引物为四对用于检测深海沉积物样品慢病毒的特异性引物，具体为：
Lentivirus-F1：
Lentivirus-R1：
Lentivirus-F2：
Lentivirus-R2：
Lentivirus-F3：
Lentivirus-R3：
Lentivirus-F4：
Lentivirus-R4：
即第一对的上游引物为：GGGTGGCAAG TGGTCAAA；
第一对的下游引物为：GAAATGCTAG GCGGCTGT；
第二对的上游引物为：CTTTTGTTTT GCTCTTCCTC；
第二对的下游引物为：TCCCGTATGG CTTTCATT；
第三对的上游引物为：CTTCCTTGGT GTCTTTTATC；
第三对的下游引物为：GTGGTGTGCA CTGTGTTT；
第四对的上游引物为：CGATCTAATT CTCCCCCG；
第四对的下游引物为：GTGGTGTGCA CTGTGTTT；
所述的慢病毒的序列，分子类型为DNA，序列长度为1806bp，如SEQ ID No.1所示：
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明通过对深海沉积物样品进行病毒分离，使用全新的强特异性引物通过PCR来对深海沉积物样品中的慢病毒进行检测。本发明还从分离到的病毒中提取病毒的DNA，经全基因组扩增，最终得到深海沉积物样品中的病毒核酸样品，然后通过此种方法，可以对深海沉积物样品中的慢病毒进行快速检测。相对于传统的生理生化检测方法，该检测方法较为高效和精确，同时这种检测方法也为我们安全合理利用与开发海洋资源提供了参考意义。
附图说明
图1展示为深海沉积物样品中分离到的病毒悬液，经磷钨酸负染后在电镜观察到的病毒照片，在图1中展示的电镜照片放大倍数以此为：10000、20000、20000与20000。
图2中展示的为深海沉积物中分离得到的病毒cDNA全基因组扩增后的电泳结果，M-1:λ-phage Marker；1:阴性对照，2：病毒DNA经全基因组扩增后的结果。
图3中展示的为深海沉积物样品中慢病毒检测的琼脂糖胶电泳结果。Marker:250bp-I Marker；1:阴性对照，2-5：病毒DNA使用特异性引物PCR反应扩增后的电泳结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册(15、萨姆布鲁克，拉塞尔(著)，黄培堂(译)，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年，第三版)中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。
为实现上述目的，本发明采用以下技术措施，其具体步骤是：
1.深海沉积物样品中病毒的分离
沉积物样品取自于全球范围内的不同深海环境(2000-8000m),样品采集后，马上置于-80℃环境保存。回实验室后，在超净台中取出10g沉积物样品，分为两份装入2个50ml的RNA-free的离心管中。在超净台中，分别加入20颗无菌的玻璃珠和5ml SM Buffer,将装有沉积物的离心管置于振荡仪上剧烈震荡30min。4℃5000g离心10min，小心吸取2ml上清，收集在一个新的50ml离心管中。在离心后的离心管中加入重新加入4ml SM Buffer,继续振荡以及离心，重复以上步骤5次，最终得到体积约为30nl的上清液。4℃5000g离心30min。将离心后的上清通过0.22μm的滤膜过滤。在最终得到的上清液中加入终浓度为10％(m/v)的PEG6000，置于4℃环境中，静置过夜。4℃200000g离心2h,离心后小心弃去上清，加入400μLSM Buffer重悬，得到深海沉积物病毒悬液。取200μL病毒悬液，置于无菌的1.5ml EP tube中，用于病毒DNA提取，其余病毒悬液保存在液氮中。
2.病毒DNA的提取
向200μL病毒悬液中加入终浓度为5μg/μL的DNase I与RNase A,37℃条件下处理1h。加入EDTA 0.1mol,65摄氏度条件下处理10min。在上述悬液中加入终浓度为1μg/μ的蛋白酶K以及终浓度为1％的SDS，56摄氏度条件下处理1h。加入等体积的酚氯仿抽提试剂，振荡混匀后，4摄氏度条件下12000g离心10min。离心后吸取上清，在上清中加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的醋酸钠(3M)，4摄氏度静置过夜。4摄氏度条件下，12000g离心30min，离心后弃上清，加入1mL70％无水乙醇，重悬后在4摄氏度条件下，12000g离心10min。小心倾倒出乙醇，开盖静置，使乙醇挥发。静置30min后，加入10μL ddH2O重悬后得到病毒DNA。将得到的病毒DNA置于-80℃冰箱中保存。
3.病毒DNA扩增
取2μL病毒DNA样品于PCR管中，在上述PCR管中加入9μL Sample buffer,混匀后置于PCR仪中95℃3min。在上一步得到的混合液中加入9μL Reaction buffer和1μL EnzymeMix,置于PCR仪中，按以下条件进行反应：30℃3h,65℃10min。取病毒cDNA扩增产物2μL，进行电泳检测。(illustra Ready-To-Go GenomiPhi V2 DNA Amplification kit,GE)
4.深海沉积物样品中慢病毒的检测
取1μL病毒DNA扩增后的样品作为模板，加入以下反应体系中：上下游引物引物各1μL(10μM)；Vazyme 2X Phanta hs Mix 25μL；ddH2O22μL；模板1μL。按以下表1条件进行PCR反应：
表1
| 步骤 | 温度(摄氏度) | 时间(min:s) |
| 1 | 95℃ | 3:00 |
| 2 | 95℃ | 00:10 |
| 3 | 55℃ | 00:20 |
| 4 | 72℃ | 01:00 |
| 5 | 返回步骤2 | 循环30次 |
| 6 | 72℃ | 10：00 |
| 7 | End |
PCR反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。若电泳结果显示有特异性条带被扩增到，则证明该样品中存在慢病毒。
图1展示为深海沉积物样品中分离到的病毒悬液，经磷钨酸负染后在电镜观察到的病毒照片，在图1中展示的电镜照片放大倍数以此为：10000、20000、20000与20000。
图2中展示的为深海沉积物中分离得到的病毒cDNA全基因组扩增后的电泳结果，M-1:λ-phage Marker；1:阴性对照，2：病毒DNA经全基因组扩增后的结果。
图3中展示的为深海沉积物样品中慢病毒检测的琼脂糖胶电泳结果。Marker:250bp-I Marker；1:阴性对照，2-5：病毒DNA使用特异性引物PCR反应扩增后的电泳结果。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种深海沉积物样品中慢病毒的检测方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1806
<212> DNA
<213> virus
<400> 1
gcccgcgtgg ttcctggcca ccgtcggcgt ctcgcccgac caccagggca agggtctggg 60
cagcgccgtc gtgctccccg gagtggaggc ggccgagcgc gccggggtgc ccgccttcct 120
ggagacctcc gcgccccgca acctcccctt ctacgagcgg ctcggcttca ccgtcaccgc 180
cgacgtcgag gtgcccgaag gaccgcgcac ctggtgcatg acccgcaagc ccggtgcctg 240
acgggcgcgt ctggaacaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta 300
ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc 360
atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt 420
ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg 480
ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt 540
tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct 600
ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aagctgacgt 660
cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct 720
acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc 780
ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct 840
ccccgcctgg aattaattct gcagtcgaga cctagaaaaa catggagcaa tcacaagtag 900
caatacagca gctaccaatg ctgattgtgc ctggctagaa gcacaagagg aggaggaggt 960
gggttttcca gtcacacctc aggtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga 1020
tcttagccac tttttaaaag aaaagagggg actggaaggg ctaattcact cccaacgaag 1080
acaagatatc cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc tacttccctg attagcagaa 1140
ctacacacca gggccagggg tcagatatcc actgaccttt ggatggtgct acaagctagt 1200
accagttgag ccagataagg tagaagaggc caataaagga gagaacacca gcttgttaca 1260
ccctgtgagc ctgcatggga tggatgaccc ggagagagaa gtgttagagt ggaggtttga 1320
cagccgccta gcatttcatc acgtggcccg agagctgcat ccggagtact tcaagaactg 1380
ctgatatcga gcttgctaca agggactttc cgctggggac tttccaggga ggcgtggcct 1440
gggcgggact ggggagtggc gagccctcag atcctgcata taagcagctg ctttttgcct 1500
gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga 1560
acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc 1620
tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct 1680
ctagcagtgg cgcccgaaca gggacttgaa agcgaaaggg aaaccagagg agctctctcg 1740
acgcaggact cggcttgctg aagcgcgcac ggcaagaggc gcggggcggc gactggtgag 1800
tacgcc 1806
Claims (10)
1.一种深海沉积物样品中慢病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)通过在深海沉积物样品中加入缓冲液与玻璃珠，通过振荡，将病毒颗粒溶解于缓冲液，收集缓冲液上清，加入聚乙二醇静置，然后通过离心收集病毒，得到病毒悬液；
2)使用特异性的引物通过PCR反应对病毒悬液进行慢病毒的检测，检测是否含有慢病毒。
2.根据权利要求1所述的深海沉积物样品中慢病毒的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述的缓冲液采用SM buffer缓冲液。
3.根据权利要求1所述的深海沉积物样品中慢病毒的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述的聚乙二醇的分子量为4000～8000。
4.根据权利要求3所述的深海沉积物样品中慢病毒的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述的聚乙二醇的分子量为5500～6500。
5.根据权利要求1所述的深海沉积物样品中慢病毒的检测方法，其特征在于，步骤1)中，通过离心收集病毒后采用缓冲液重悬得到病毒悬液。
6.根据权利要求1所述的深海沉积物样品中慢病毒的检测方法，其特征在于，步骤1)中，收集缓冲液上清，具体包括：
通过0.1～0.32μm滤器过滤，滤除细菌。
7.根据权利要求1所述的深海沉积物样品中慢病毒的检测方法，其特征在于，步骤1)中，收集缓冲液上清，具体包括：通过0.17～0.27μm滤器过滤，滤除细菌。
8.根据权利要求6或7所述的深海沉积物样品中慢病毒的检测方法，其特征在于，所述的滤器为滤膜。
9.根据权利要求1所述的深海沉积物样品中慢病毒的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述的特异性的引物为四对用于检测深海沉积物样品慢病毒的特异性引物，具体为：
第一对的上游引物为：GGGTGGCAAG TGGTCAAA；
第一对的下游引物为：GAAATGCTAG GCGGCTGT；
第二对的上游引物为：CTTTTGTTTT GCTCTTCCTC；
第二对的下游引物为：TCCCGTATGG CTTTCATT；
第三对的上游引物为：CTTCCTTGGT GTCTTTTATC；
第三对的下游引物为：GTGGTGTGCA CTGTGTTT；
第四对的上游引物为：CGATCTAATT CTCCCCCG；
第四对的下游引物为：GTGGTGTGCA CTGTGTTT。
10.根据权利要求1所述的深海沉积物样品中慢病毒的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述的慢病毒的DNA碱基序列，如SEQ ID No.1所示。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201030 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |