CN113249375A - 一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法 - Google Patents

一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113249375A
CN113249375A CN202110522325.6A CN202110522325A CN113249375A CN 113249375 A CN113249375 A CN 113249375A CN 202110522325 A CN202110522325 A CN 202110522325A CN 113249375 A CN113249375 A CN 113249375A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
sample
solution
buffer
fecal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110522325.6A
Other languages
English (en)
Inventor
张帮周
肖传兴
林爱强
罗旌万
何剑全
谌宝龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN202110522325.6A priority Critical patent/CN113249375A/zh
Publication of CN113249375A publication Critical patent/CN113249375A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，属于生物技术领域，包括以下七个步骤：粪便样本病毒富集、病毒核酸提取、逆转录、MDA扩增、文库构建、高通量测序及生物信息分析。粪便样本病毒富集及逆转录是本发明的主要步骤，首先用生物物理的方法去除粪便样本中人和宿主的核酸，然后提取样本病毒核酸，将病毒核酸进行逆转录步骤。本发明公开的快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，该检测技术能够极大的提高粪便病毒的丰度，使医护工作者可以对粪便样本病毒进行可靠富集，获取充足而有效的数据，以便对病毒进行建库以及生物信息分析，对研究胃肠道病毒与胃肠道健康提供了丰富、可靠的数据依据。

Description

一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法。
背景技术
肠道微生物指在人或动物肠道中定植的数量巨大的细菌,古细菌,真菌和肠道病毒等。当前对肠道微生物的研究大多集中于对细菌的研究,而随着研究的深入肠道病毒数量,种类以及对人体健康和疾病的影响也越来越受到重视。
对肠道病毒的研究，传统上集中于病原体的感染致病机制和宿主对病原的免疫应答等。近年来，通过高通量测序技术对肠道中病毒核酸序列分析,揭示了动态和多样化的肠道病毒组,除了已知的肠道病毒病原体外,还发现了许多新的共生病毒,包括感染细菌的噬菌体,感染真核细胞的病毒以及已整合到宿主基因组的内源性逆转录病毒元件等。
多项研究表明肠道病毒组和疾病之间存在关联。病毒可以直接或间接调节肠道中的原核生物生长和宿主基因表达,发挥了"跨界"调控作用。因而肠道病毒与其他肠道微生物及宿主之间复杂的相互作用机制被认为是影响和干预肠道感染性疾病,炎性肠炎和肠道肿瘤等多种疾病的重要因素。但是，由于肠道粪便中游离的病毒颗粒少导致粪便中病毒的富集和建库困难以及后续的生信分析存在大量的背景，导致有效数据不足或缺乏，而本发明能够有效的解决上述问题。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题在于提出一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，综合利用物理学和生物学的方法有效富集粪便中病毒颗粒，在样本病毒核酸提取和建库之前去除样本中宿主的核酸。该方法可以使病毒的reads数得到极大的提高，可以快速检测病毒全基因组序列，大幅度的降低测序成本。使医护工作者可以对粪便样本病毒进行可靠富集，获取充足而有效的数据，以便对病毒进行建库以及生物信息分析。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供的一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，包括如下步骤：
粪便样本病毒富集步骤：利用生物物理方法对待检测样本进行病毒核酸富集，获取病毒纯化颗粒溶液；
病毒核酸提取步骤：在病毒纯化颗粒溶液中利用病毒核酸提取试剂盒提取病毒核酸；
逆转录步骤：对提取的病毒核酸利用逆转录试剂盒对RNA病毒逆转录为DNA病毒，生成DNA样本；
MDA扩增步骤：在DNA样本中，对病毒gDNA进行扩增，以达到建库所需起始量；
文库构建步骤：机械随机打断病毒gDNA构建文库；
高通量测序步骤：检测5G Raw Reads数据量；
生物信息分析步骤：从高通量测序数据中准确分析样本中的物种组成；
粪便样本病毒富集步骤包括取样步骤、离心除杂步骤、过滤步骤以及病毒提取步骤；
在取样步骤中，取人或者动物粪便样本到试管中；
在离心除杂步骤中，往取样步骤的粪便样本试管中加入SM缓冲液涡旋振荡匀质化后置于离心机中离心；
在过滤步骤中，取离心除杂步骤的上清液过0.45um的滤膜，去除部分宿主细胞；
在病毒提取步骤中，取过滤步骤的滤液裂解残余宿主细胞后离心，去除宿主核酸后，获取病毒纯化颗粒溶液。
本发明优选的技术方案在于，在离心除杂步骤中，往粪便样本试管中加入SM缓冲液涡旋振荡匀质化后置于离心机中3000×g离心5min，取上清液置于离心机中3000×g再离心5min。
本发明优选的技术方案在于，在病毒提取步骤中，取滤液加入100mg/ul的溶菌酶混匀，37℃孵育30min，裂解残余宿主细胞，孵育结束后，加入占比上述溶液0.2体积的氯仿混匀，室温静置10min，再置于迷你离心机中瞬离，取上清液后，向上清液中添加10×DNasebuffer、Turbo DNase I、DNase I、全能酶以及RNase，37℃孵育45min，去除宿主核酸，获取病毒纯化颗粒溶液；其中，溶菌酶、10×DNase buffer、Turbo DNase I、DNase I、全能酶以及RNase之间依次按照2：2：2：2：2：5的比例进行配比添加。
本发明优选的技术方案在于，病毒核酸提取步骤包括如下步骤：
第一步，取病毒纯化颗粒溶液到试管中，并分别加入Carrier RNA、蛋白酶K以及裂解液，在56℃温度下孵育15min；
第二步，加入预冷无水乙醇室温孵育5min；
第三步，过柱置于离心机中6800×g离心1min，丢弃液体；
第四步，加入wash buffer洗涤缓冲液置于离心机中6800×g离心1min，重复该步骤1次，总计2次；
第五步，丢弃液体，离心机中空离10000rpm 1min；
第六步，室温晾干1min；
第七步，加入RNase-free H2O，室温孵育1min；
第八步，离心机中10000rpm离心1min，回收病毒核酸；
其中，病毒纯化颗粒溶液、Carrier RNA、蛋白酶K、裂解液、无水乙醇、wash buffer洗涤缓冲液以及RNase-free H2O之间依次按照200：6：25：200：250：500：30的比例进行配比添加。
本发明优选的技术方案在于，逆转录步骤包括如下步骤：
第一步，将病毒核酸以及Random Primer Mix按照6：2的比例混合，进行一链合成；
第二步，将经过第一步的样本置于PCR仪中65℃温度下变性反应5min；
第三步，将ProtoScript II Reaction Mix(2X)以及ProtoScript II Enzyme Mix(2X)按照10：2的比例添加到经过第二步的样本中，置于PCR仪中25℃温度下反应5min后，再置于PCR仪中42℃温度下反应60min，进行二链合成，将RNA病毒逆转录为DNA病毒，生成DNA样本并于4℃温度下保持。
本发明优选的技术方案在于，MDA扩增步骤包括如下步骤：
第一步，将Buffer D以及H2O按照7：25的比例配置为Buffer D 1溶液；
第二步，将Buffer N以及H2O按照9：51的比例配置为Buffer N 1溶液；
第三步，将经过逆转录步骤处理的DNA样本加入到PCR管中，加入Buffer D 1溶液，轻弹管壁混匀并置于离心机中短暂离心后，室温孵育3min。再加入Buffer N 1溶液，轻弹管壁混匀并置于离心机中短暂离心，生成预处理样本溶液，其中，DNA样本、Buffer D 1溶液以及Buffer N 1溶液之间依次按照2.5：2.5：5的比例进行配比添加；
第四步，将H2O、Reaction buffer以及DNA Polymerase按照8：30：2的比例配置为反应混合液；
第五步，将第四步的反应混合液添加至经过第三步的预处理样本溶液中，轻弹管壁混匀并置于离心机中短暂离心，30℃温度下孵育4h；
第六步、将经过第五步的样本溶液在65℃温度下孵育5min，失活DNA Polymerase。
本发明优选的技术方案在于，文库构建步骤包括如下步骤：
第一步，取用经过MDA扩增步骤的gDNA进行机械随机打断；
第二步，将NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix、NEBNext Ultra II EndPrep Reaction Buffer以及Fragmented DNA按照3：7：50的比例配置为末端修复反应体系，末端修复反应体系在PCR仪中依次进行如下程序反应：30min20℃、30min 65℃、Hold at 4℃，以进行末端修复；
第三步，将NEBNext Ultra II Ligation Master Mix、NEBNext LigationEnhancer、NEBNext Adaptor for Illumina以及末端修复产物按照30：1：2.5：60的比例配置为接头反应体系，接头反应体系在PCR仪中20℃反应15min，以进行添加接头；
第四步，向第三步反应体系添加USER酶，37℃反应15min；
第五步，通过磁珠对上述反应产物进行片段筛选；
第六步，将Univeral Primer、Index Primer、UItraⅡMaster Mix以及加接头DNA产物按照5：5：25：15的比例配置为PCR文库富集体系，PCR文库富集体系在PCR仪中依次进行如下程序反应：98℃30sec；20cycles 98℃10sec，65℃75sec；65℃5min；Hold at 4℃进行文库扩增；
第七步，文库纯化回收。
本发明优选的技术方案在于，gDNA通过如下步骤进行机械打断：
第一步，提前打开机械打断仪，设置水浴温度为4℃；
第二步，将经过MDA扩增步骤的MDA扩增产物gDNA稀释50倍；
第三步，取稀释产物用Qubit3.0荧光计测定病毒gDNA浓度；
第四步，取稀释病毒gDNA放于灭菌的EP管中，添加NF·H2O；
第五步，涡旋振荡混匀，置于离心机中短暂离心使液体全部置于管底；
第六步，待打断仪水浴温度为4℃时，对第五步的gDNA样本溶液进行打断。
本发明优选的技术方案在于，在高通量测序步骤中，选用Nova-PE150进行上机测序，要求5G Raw Reads的数据产出量。
本发明优选的技术方案在于，在生物信息分析步骤中，利用MEGAN将BLAST的结果转换成物种组成信息，以进一步分析提取病毒的核酸信息。
本发明的有益效果为：
本发明提供的快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，采用离心除杂步骤，通过离心机离心作用，可将大部分大分子有机物以及无机物等无关联杂质通过离心作用进行分离，采用过滤步骤，可过滤掉体积较大的宿主细胞组织，采用病毒提取步骤，先对残余宿主细胞进行裂解，并破坏宿主细胞表面的蛋白质结构，实现杀灭，以便离心后将核酸与大分子蛋白质等杂质相分离，再添加物质去除宿主核酸，以充分提取出病毒，提高病毒的纯度，提高病毒样本数据的丰富度，且无关联杂质被充分去除，保证病毒样本数据更可靠有效。通过上述过程，该检测技术能够极大的提高粪便病毒的丰度，使医护工作者可以对粪便样本病毒进行可靠富集，获取充足而有效的数据，以便对病毒进行建库以及生物信息分析，对研究胃肠道病毒与胃肠道健康提供了丰富、可靠的数据依据。综合利用物理学和生物学的方法有效富集粪便中病毒颗粒，在样本病毒核酸提取和建库之前去除样本中宿主的核酸。该方法可以使病毒的reads数得到极大的提高，可以快速检测病毒全基因组序列，大幅度的降低测序成本。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中提供的采用快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法与采用常规检测方法处理样本数据的reads数据对比图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
如图1所示，为了使医护工作者可以对粪便样本病毒进行可靠富集，获取充足而有效的数据，以便对病毒进行建库以及生物信息分析，进一步地，本实施例中提供的一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，包括如下步骤：粪便样本病毒富集步骤：利用生物物理方法对待检测样本进行病毒核酸富集，获取病毒纯化颗粒溶液；病毒核酸提取步骤：在病毒纯化颗粒溶液中利用病毒核酸提取试剂盒提取病毒核酸；逆转录步骤：对提取的病毒核酸利用逆转录试剂盒对RNA病毒逆转录为DNA病毒，生成DNA样本；MDA扩增步骤：在DNA样本中，对病毒gDNA进行扩增，以达到建库所需起始量；文库构建步骤：机械随机打断病毒gDNA构建文库；高通量测序步骤：检测5G Raw Reads数据量；生物信息分析步骤：从高通量测序数据中准确分析样本中的物种组成；粪便样本病毒富集步骤包括取样步骤、离心除杂步骤、过滤步骤以及病毒提取步骤；在取样步骤中，取人或者动物粪便样本到试管中；在离心除杂步骤中，往取样步骤的粪便样本试管中加入SM缓冲液涡旋振荡匀质化后置于离心机中离心；在过滤步骤中，取离心除杂步骤的上清液过0.45um的滤膜，去除部分宿主细胞；在病毒提取步骤中，取过滤步骤的滤液裂解残余宿主细胞后离心，去除宿主核酸后，获取病毒纯化颗粒溶液。其中，取样步骤中，人或者动物粪便样本可采用新鲜样本或者-80℃冻存样本。采用离心除杂步骤，通过离心机离心作用，可将大部分大分子有机物以及无机物等无关联杂质通过离心作用进行分离，采用过滤步骤，可过滤掉体积较大的宿主细胞组织，采用病毒提取步骤，先对残余宿主细胞进行裂解，并破坏宿主细胞表面的蛋白质结构，实现杀灭，以便离心后将核酸与大分子蛋白质等杂质相分离，再添加物质去除宿主核酸，以充分提取出病毒，提高病毒的纯度，提高病毒样本数据的丰富度，且无关联杂质被充分去除，保证病毒样本数据更可靠有效。该方法可以使病毒的reads数得到极大的提高，可以快速检测病毒全基因组序列，大幅度的降低测序成本。通过上述过程，使医护工作者可以对粪便样本病毒进行可靠富集，获取充足而有效的数据，以便对病毒进行建库以及生物信息分析。
优选地，在离心除杂步骤中，往粪便样本试管中加入SM缓冲液涡旋振荡匀质化后置于离心机中3000×g离心5min，取上清液置于离心机中3000×g再离心5min。对粪便样本进行二次离心，在保证样本量满足实验要求的前提下，可将大部分无关联杂质通过离心作用与目标病毒样本进行分离，提高病毒的纯度，保证病毒样本数据更可靠有效。
优选地，在病毒提取步骤中，取滤液加入100mg/ul的溶菌酶混匀，37℃孵育30min，裂解残余宿主细胞，孵育结束后，加入占比上述溶液0.2体积的氯仿混匀，室温静置10min，再置于迷你离心机中瞬离，取上清液后，向上清液中添加10×DNase buffer、Turbo DNaseI、DNase I、全能酶以及RNase，37℃孵育45min，去除宿主核酸，获取病毒纯化颗粒溶液；其中，溶菌酶、10×DNase buffer、Turbo DNase I、DNase I、全能酶以及RNase之间依次按照2：2：2：2：2：5的比例进行配比添加。采用溶菌酶可初步裂解宿主细胞以及其他微生物，再加入氯仿，可破坏宿主细胞以及其他微生物表面的蛋白质结构，并将其杀灭，且不会破坏病毒的感染性，再经过离心后，可分离出含大部分核酸物质的上清液，通过添加10×DNasebuffer、Turbo DNase I、DNase I、全能酶以及RNase，可去除宿主核酸，以充分提取出病毒，提高病毒的纯度，提高病毒样本数据的丰富度，且无关联杂质被充分去除，保证病毒样本数据更可靠有效。
优选地，病毒核酸提取步骤包括如下步骤：
第一步，取病毒纯化颗粒溶液到试管中，并分别加入Carrier RNA、蛋白酶K以及裂解液，在56℃温度下孵育15min；
第二步，加入预冷无水乙醇室温孵育5min；
第三步，过柱置于离心机中6800×g离心1min，丢弃液体；
第四步，加入wash buffer洗涤缓冲液置于离心机中6800×g离心1min，重复该步骤1次，总计2次；
第五步，丢弃液体，离心机中空离10000rpm 1min；
第六步，室温晾干1min；
第七步，加入RNase-free H2O，室温孵育1min；
第八步，离心机中10000rpm离心1min，回收病毒核酸；
其中，病毒纯化颗粒溶液、Carrier RNA、蛋白酶K、裂解液、无水乙醇、wash buffer洗涤缓冲液以及RNase-free H2O之间依次按照200：6：25：200：250：500：30的比例进行配比添加。
通过上述过程，可充分分解病毒并提取病毒核酸，充分去除杂质，既保证病毒核酸的样本丰富度，又保证病毒核酸的样本纯度，提高样本数据的准确可靠度。
优选地，逆转录步骤包括如下步骤：
第一步，将病毒核酸以及Random Primer Mix按照6：2的比例混合，进行一链合成；
第二步，将经过第一步的样本置于PCR仪中65℃温度下变性反应5min；
第三步，将ProtoScript II Reaction Mix(2X)以及ProtoScript II Enzyme Mix(2X)按照10：2的比例添加到经过第二步的样本中，置于PCR仪中25℃温度下反应5min后，再置于PCR仪中42℃温度下反应60min，进行二链合成，将RNA病毒逆转录为DNA病毒，生成DNA样本并于4℃温度下保持。
通过上述过程，可将RNA病毒逆转录为DNA病毒，以便对病毒样本数据进行扩增测序。
优选地，MDA扩增步骤包括如下步骤：
第一步，将Buffer D以及H2O按照7：25的比例配置为Buffer D 1溶液；
第二步，将Buffer N以及H2O按照9：51的比例配置为Buffer N 1溶液；
第三步，将经过逆转录步骤处理的DNA样本加入到PCR管中，加入Buffer D 1溶液，轻弹管壁混匀并置于离心机中短暂离心后，室温孵育3min。再加入Buffer N 1溶液，轻弹管壁混匀并置于离心机中短暂离心，生成预处理样本溶液，其中，DNA样本、Buffer D 1溶液以及Buffer N 1溶液之间依次按照2.5：2.5：5的比例进行配比添加；
第四步，将H2O、Reaction buffer以及DNA Polymerase按照8：30：2的比例配置为反应混合液；
第五步，将第四步的反应混合液添加至经过第三步的预处理样本溶液中，轻弹管壁混匀并置于离心机中短暂离心，30℃温度下孵育4h；
第六步、将经过第五步的样本溶液在65℃温度下孵育5min，失活DNA Polymerase。
通过上述过程，采用MDA多重置换扩增技术，可有效对病毒的全基因组进行高保真的均匀扩增，扩增出10～100kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因组序列，保证病毒测序数据的丰富度，建立健全病毒数据文库，以进行有效可靠的生物信息分析，有助于医护工作者对胃肠道等系统的疾病进行可靠有效的病理诊断以及治疗策略。
优选地，文库构建步骤包括如下步骤：
第一步，取用经过MDA扩增步骤的gDNA进行机械随机打断；
第二步，将NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix、NEBNext Ultra II EndPrep Reaction Buffer以及Fragmented DNA按照3：7：50的比例配置为末端修复反应体系，末端修复反应体系在PCR仪中依次进行如下程序反应：30min20℃、30min 65℃、Hold at 4℃，以进行末端修复；
第三步，将NEBNext Ultra II Ligation Master Mix、NEBNext LigationEnhancer、NEBNext Adaptor for Illumina以及末端修复产物按照30：1：2.5：60的比例配置为接头反应体系，接头反应体系在PCR仪中20℃反应15min，以进行添加接头；
第四步，向第三步反应体系添加USER酶，37℃反应15min；
第五步，通过磁珠对上述反应产物进行片段筛选；
第六步，将Univeral Primer、Index Primer、UItraⅡMaster Mix以及加接头DNA产物按照5：5：25：15的比例配置为PCR文库富集体系，PCR文库富集体系在PCR仪中依次进行如下程序反应：98℃30sec；20cycles 98℃10sec，65℃75sec；65℃5min；Hold at 4℃进行文库扩增；
第七步，文库纯化回收。
通过上述过程，可提高病毒文库的丰富度以及完整度，有助于医护工作者通过对病毒文库的数据进行高通量测序后，对胃肠道中病毒核酸序列分析，揭示了动态和多样化的胃肠道病毒组，从而对胃肠道等系统的疾病进行可靠有效的病理诊断以及治疗策略。
优选地，gDNA通过如下步骤进行机械打断；
第一步，提前打开机械打断仪，设置水浴温度为4℃；
第二步，将经过MDA扩增步骤的MDA扩增产物gDNA稀释50倍；
第三步，取稀释产物用Qubit3.0荧光计测定病毒gDNA浓度；
第四步，取稀释病毒gDNA放于灭菌的EP管中，添加NF·H2O；
第五步，涡旋振荡混匀，置于离心机中短暂离心使液体全部置于管底；
第六步，待打断仪水浴温度为4℃时，对第五步的gDNA样本溶液进行打断。
通过上述过程，可高效可靠地对gDNA样本进行打断，以高效进行文库富集构建。
优选地，在高通量测序步骤中，选用Nova-PE150进行上机测序，要求5G Raw Reads的数据产出量。通过Nova-PE150对病毒文库数据进行高通量测序，通过对文库中数以万计的克隆(colony)进行延伸反应，检测对应的信号获取序列信息，该方法可以使病毒的reads数得到极大的提高，可以快速检测病毒全基因组序列，大幅度的降低测序成本，最终通过数据分析来挖掘胃肠道病毒核酸序列中的胃肠道病毒与其他胃肠道微生物及宿主之间复杂的相互作用机制，从而对胃肠道等系统的疾病进行可靠有效的病理诊断以及治疗策略。
优选地，在生物信息分析步骤中，利用MEGAN将BLAST的结果转换成物种组成信息，以进一步分析提取病毒的核酸信息。MEGAN是用于交互式分析微生物组数据的综合工具箱。MEGAN支持许多不同类型的数据输入，可以通过序列比对的方法轻松的识别和去除宿主DNA。
以下以收集到的-80℃冻存的新鲜病人粪便样本为例，通过具体实施例对本申请的高通量检测方法进行具体阐述说明。
一、粪便样本病毒富集
1)取样待检测样本解冻后，于灭菌的生物安全柜中将样本搅拌均匀，称取0.25g于灭菌的2ml EP管。
2)加入SM缓冲液1000ul，涡旋振荡10min匀质化后置于离心机中3000×g，离心5min。
3)取2)中的上清液于灭菌的2ml EP管,在离心机中3000×g，离心5min。
4)取3)中的上清液过0.45um的滤膜。
5)取4)滤液200ul加入2ul 100mg/ul的溶菌酶混匀，37℃孵育30min。
6)孵育结束后加入0.2×体积的氯仿混匀，室温静置10min。
7)迷你离心机中瞬离，取小心吸取上层液体。
8)向上清中添加源叶10×DNase buffer；2ul Turbo DNase I；
2ul源叶DNase I；2ul全能酶；5ul天根RNase；37℃孵育45min。
二、病毒核酸提取
1)取200ul病毒富集样本加入5.6ulCarrier RNA，25ul蛋白酶K,200ul裂解液。
2)56℃孵育15min。
3)加入预冷的无水乙醇250ul，室温孵育5min。
4)将上述裂解液加入吸附柱中6800×g离心1min，丢弃液体。
5)向吸附柱加500ul wash buffer 6800×g离心1min，重复步骤1次，总计2次。
6)丢弃液体，10000rpm空离1min。
7)向吸附柱加入30ul RNase-free H2O，室温孵育1min。
8)离心机中10000rpm 1min离心回收核酸。
9)Qubit检测核酸浓度，马上进行下一步骤。
三、逆转录
1)按下表配置一链合成体系：
Figure BDA0003064520190000151
2)在PCR仪中执行65℃5min程序。
3)按下表配置二链合成体系：
Figure BDA0003064520190000152
4)在PCR仪中执行25℃5min；42℃60min；4℃Hold。
四、MDA扩增
1)按下表配置Buffer D：
Figure BDA0003064520190000153
2)按下表配置Buffer N：
Figure BDA0003064520190000161
3)将2.5ul二链产物DNA样品加入到PCR管中，加入2.5μl Buffer D1，轻弹管壁混匀并短暂离心,室温孵育3min。
4)加入5ul Buffer N1，轻弹管壁混匀并短暂离心。
5)配置反应混合液：
Figure BDA0003064520190000162
6)将40μl反应混合液加入到准备好的10ul DNA样品中，轻弹管壁混匀并短暂离心，30℃孵育4h。
7)灭活：65℃孵育5min失活DNA Polymerase。
五、文库构建
1)提前打开机械打断仪Bioruptor Pico设置水浴温度为4℃。
2)稀释MDA扩增产物50倍。
3)取稀释产物用Qubit3.0测定病毒gDNA浓度。
4)取200ng稀释病毒gDNA，放于灭菌的500ul EP管中。
5)加NF·H2O补足至60ul。
6)涡旋振荡混匀，短暂离心使液体全部置于管底。
7)待打断仪Bioruptor Pico水浴温度为4℃时，设置以下程序进行打断：
Figure BDA0003064520190000171
8)按下表配置末端修复反应体系：
Figure BDA0003064520190000172
8)PCR仪中进行如下程序反应30min 20℃；30min 65℃；Hold at 4℃。
9)按下表配置加接头反应体系：
Figure BDA0003064520190000173
10)20℃反应15min。
11)添加3ul USERTM酶，37℃反应15min。
12)向上述反应产物中加入到磁珠25ul混匀，室温孵育5min。
13)将EP管放于磁力架上。
14)待液体澄清，小心吸取上清到另一干净的15ml EP管。
15)加入磁珠10ul混匀，室温孵育5min。
16)将EP管放于磁力架上，待液体澄清，吸弃上清。
17)80％无水乙醇漂洗两遍后，晾干。
18)加入17ul NF·H2O洗脱文库，室温孵育5min
19)上磁力架，待液体澄清，小心吸取15ul上清放于PCR管中。
20)按下表配置PCR文库富集体系：
Figure BDA0003064520190000181
21)设置PCR程序98℃30sec；20cycles 98℃10sec,65℃75sec；65℃5min；4℃Hold进行文库扩增。
22)文库胶回收或磁珠回收。
六、高通量测序
本次上机测序选用Nova-PE150，要求5G Raw Reads的数据产出量。
七、生物信息分析
所述生物信息分析是利用MEGAN将BLAST的结果转换成物种组成信息，提取病毒的核酸信息进一步分析。
图1可以看到使用离心、过滤等常规方法去除人源及细菌、真菌的reads后只有不到1％的数量，使用本专利可以得到80％左右的数量。
本发明是通过优选实施例进行描述的，本领域技术人员知悉，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，其他落入本申请的权利要求内的实施例都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
粪便样本病毒富集步骤：利用生物物理方法对待检测样本进行病毒核酸富集，获取病毒纯化颗粒溶液；
病毒核酸提取步骤：在病毒纯化颗粒溶液中利用病毒核酸提取试剂盒提取病毒核酸；
逆转录步骤：对提取的病毒核酸利用逆转录试剂盒对RNA病毒逆转录为DNA病毒，生成DNA样本；
MDA扩增步骤：在DNA样本中，对病毒gDNA进行扩增，以达到建库所需起始量；
文库构建步骤：机械随机打断病毒gDNA构建文库；
高通量测序步骤：检测5G Raw Reads数据量；
生物信息分析步骤：从高通量测序数据中准确分析样本中的物种组成；
所述粪便样本病毒富集步骤包括取样步骤、离心除杂步骤、过滤步骤以及病毒提取步骤；
在所述取样步骤中，取人或者动物粪便样本到试管中；
在所述离心除杂步骤中，往所述取样步骤的粪便样本试管中加入SM缓冲液涡旋振荡匀质化后置于离心机中离心；
在所述过滤步骤中，取所述离心除杂步骤的上清液过0.45um的滤膜，去除部分宿主细胞；
在所述病毒提取步骤中，取所述过滤步骤的滤液裂解残余宿主细胞后离心，去除宿主核酸后，获取病毒纯化颗粒溶液。
2.根据权利要求1所述的快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，其特征在于：
在所述离心除杂步骤中，往粪便样本试管中加入SM缓冲液涡旋振荡匀质化后置于离心机中3000×g离心5min，取上清液置于离心机中3000×g再离心5min。
3.根据权利要求1所述的快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，其特征在于：
在所述病毒提取步骤中，取滤液加入100mg/ul的溶菌酶混匀，37℃孵育30min，裂解残余宿主细胞，孵育结束后，加入占比上述溶液0.2体积的氯仿混匀，室温静置10min，再置于迷你离心机中瞬离，取上清液后，向上清液中添加10×DNase buffer、Turbo DNase I、DNase I、全能酶以及RNase，37℃孵育45min，去除宿主核酸，获取病毒纯化颗粒溶液；
其中，溶菌酶、10×DNase buffer、Turbo DNase I、DNase I、全能酶以及RNase之间依次按照2：2：2：2：2：5的比例进行配比添加。
4.根据权利要求1所述的快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，其特征在于：
所述病毒核酸提取步骤包括如下步骤：
第一步，取病毒纯化颗粒溶液到试管中，并分别加入Carrier RNA、蛋白酶K以及裂解液，在56℃温度下孵育15min；
第二步，加入预冷无水乙醇室温孵育5min；
第三步，过柱置于离心机中6800×g离心1min，丢弃液体；
第四步，加入wash buffer洗涤缓冲液置于离心机中6800×g离心1min，重复该步骤1次，总计2次；
第五步，丢弃液体，离心机中空离10000rpm 1min；
第六步，室温晾干1min；
第七步，加入RNase-free H2O，室温孵育1min；
第八步，离心机中10000rpm离心1min，回收病毒核酸；
其中，病毒纯化颗粒溶液、Carrier RNA、蛋白酶K、裂解液、无水乙醇、wash buffer洗涤缓冲液以及RNase-free H2O之间依次按照200：6：25：200：250：500：30的比例进行配比添加。
5.根据权利要求1所述的快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，其特征在于：
所述逆转录步骤包括如下步骤：
第一步，将病毒核酸以及Random Primer Mix按照6：2的比例混合，进行一链合成；
第二步，将经过第一步的样本置于PCR仪中65℃温度下变性反应5min；
第三步，将ProtoScript II Reaction Mix(2X)以及ProtoScript II Enzyme Mix(2X)按照10：2的比例添加到经过第二步的样本中，置于PCR仪中25℃温度下反应5min后，再置于PCR仪中42℃温度下反应60min，进行二链合成，将RNA病毒逆转录为DNA病毒，生成DNA样本并于4℃温度下保持。
6.根据权利要求1所述的快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，其特征在于：
所述MDA扩增步骤包括如下步骤：
第一步，将Buffer D以及H2O按照7：25的比例配置为Buffer D 1溶液；
第二步，将Buffer N以及H2O按照9：51的比例配置为Buffer N 1溶液；
第三步，将经过所述逆转录步骤处理的DNA样本加入到PCR管中，加入Buffer D 1溶液，轻弹管壁混匀并置于离心机中短暂离心后，室温孵育3min。再加入Buffer N 1溶液，轻弹管壁混匀并置于离心机中短暂离心，生成预处理样本溶液，其中，DNA样本、Buffer D 1溶液以及Buffer N 1溶液之间依次按照2.5：2.5：5的比例进行配比添加；
第四步，将H2O、Reaction buffer以及DNA Polymerase按照8：30：2的比例配置为反应混合液；
第五步，将第四步的反应混合液添加至经过第三步的预处理样本溶液中，轻弹管壁混匀并置于离心机中短暂离心，30℃温度下孵育4h；
第六步、将经过第五步的样本溶液在65℃温度下孵育5min，失活DNA Polymerase。
7.根据权利要求1所述的快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，其特征在于：
所述文库构建步骤包括如下步骤：
第一步，取用经过所述MDA扩增步骤的gDNA进行机械随机打断；
第二步，将NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix、NEBNext Ultra II End PrepReaction Buffer以及Fragmented DNA按照3：7：50的比例配置为末端修复反应体系，末端修复反应体系在PCR仪中依次进行如下程序反应：30min 20℃、30min 65℃、Hold at 4℃，以进行末端修复；
第三步，将NEBNext Ultra II Ligation Master Mix、NEBNext Ligation Enhancer、NEBNext Adaptor for Illumina以及末端修复产物按照30：1：2.5：60的比例配置为接头反应体系，接头反应体系在PCR仪中20℃反应15min，以进行添加接头；
第四步，向第三步反应体系添加USER酶，37℃反应15min；
第五步，通过磁珠对上述反应产物进行片段筛选；
第六步，将Univeral Primer、Index Primer、UItraⅡMaster Mix以及加接头DNA产物按照5：5：25：15的比例配置为PCR文库富集体系，PCR文库富集体系在PCR仪中依次进行如下程序反应：98℃30sec；20cycles 98℃10sec，65℃75sec；65℃5min；Hold at 4℃进行文库扩增；
第七步，文库纯化回收。
8.根据权利要求7所述的快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，其特征在于：
gDNA通过如下步骤进行机械打断：
第一步，提前打开机械打断仪，设置水浴温度为4℃；
第二步，将经过所述MDA扩增步骤的MDA扩增产物gDNA稀释50倍；
第三步，取稀释产物用Qubit3.0荧光计测定病毒gDNA浓度；
第四步，取稀释病毒gDNA放于灭菌的EP管中，添加NF·H2O；
第五步，涡旋振荡混匀，置于离心机中短暂离心使液体全部置于管底；
第六步，待打断仪水浴温度为4℃时，对第五步的gDNA样本溶液进行打断。
9.根据权利要求1所述的快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，其特征在于：
在所述高通量测序步骤中，选用Nova-PE150进行上机测序，要求5G Raw Reads的数据产出量。
10.根据权利要求1所述的快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法，其特征在于：
在所述生物信息分析步骤中，利用MEGAN将BLAST的结果转换成物种组成信息，以进一步分析提取病毒的核酸信息。
CN202110522325.6A 2021-05-13 2021-05-13 一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法 Pending CN113249375A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110522325.6A CN113249375A (zh) 2021-05-13 2021-05-13 一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110522325.6A CN113249375A (zh) 2021-05-13 2021-05-13 一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113249375A true CN113249375A (zh) 2021-08-13

Family

ID=77181686

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110522325.6A Pending CN113249375A (zh) 2021-05-13 2021-05-13 一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113249375A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117050867A (zh) * 2023-08-20 2023-11-14 浙江深华生物科技有限公司 一种评估肿瘤dna高通量定量检测系统

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019116034A1 (en) * 2017-12-12 2019-06-20 Cell Therapy Catapult Limited Microbial enrichment method
CN112481254A (zh) * 2020-12-01 2021-03-12 杭州杰毅生物技术有限公司 一步法去宿主dna并富集微生物的方法及试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019116034A1 (en) * 2017-12-12 2019-06-20 Cell Therapy Catapult Limited Microbial enrichment method
CN112481254A (zh) * 2020-12-01 2021-03-12 杭州杰毅生物技术有限公司 一步法去宿主dna并富集微生物的方法及试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAO JIABAO等: "Profiling of Human Gut Virome with Oxford Nanopore Technology", 《MEDICINE IN MICROECOLOGY》 *
SHKOPOROV等: "The Human Gut Virome Is Highly Diverse, Stable, and Individual Specific", 《CELL HOST MICROBE》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117050867A (zh) * 2023-08-20 2023-11-14 浙江深华生物科技有限公司 一种评估肿瘤dna高通量定量检测系统

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111334615A (zh) 一种新型冠状病毒检测方法与试剂盒
CN113337639B (zh) 一种基于mNGS检测COVID-19的方法及其应用
CN111662959A (zh) 一种真菌高通量快速检测方法
CN108192965B (zh) 一种检测线粒体基因组a3243g位点异质性的方法
CN109913445B (zh) 一步洗涤磁珠法血液dna提取试剂盒
CN113637795A (zh) 一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测方法与试剂盒
CN113249375A (zh) 一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法
WO2021250617A1 (en) A rapid multiplex rpa based nanopore sequencing method for real-time detection and sequencing of multiple viral pathogens
CN110272898B (zh) 一种通用型微生物病原体裂解液及其应用
CN114350854B (zh) 一种基于RAA-CRISPR检测SARS-CoV-2 69-70del位点的方法
KR101912488B1 (ko) 분자 검출 분석법
CN114591945B (zh) Dna病毒核酸提取检测试剂、试剂盒及其方法和应用
CN107586886B (zh) 一种快速检测猪腺病毒的试剂以及方法
CN113930418B (zh) 核酸释放剂及其核酸释放方法
US20210207125A1 (en) Method of isolating nucleic acids for long sequencing reads
CN113151599A (zh) 用于检测新型冠状病毒的引物组、试剂、试剂盒及检测方法
CN113444720A (zh) 一种特异性扩增rna的引物、其设计方法及用途
CN109811052A (zh) 一种检测特发性无精症的试剂盒及基因panel
CN111235315A (zh) 一种可同时检测多种基因型戊型病毒肝炎病毒的方法
WO2023236618A1 (zh) 一种pe-stop基因编辑系统及基因敲除方法和应用
CN113186250B (zh) 一种用于粪便微生物基因组dna提取的除杂试剂
CN110904096B (zh) 一种利用抑制剂提取不含dna的rna方法
Deng et al. The application of CRISPR/Cas system in fields of virus detection
CN117737049A (zh) 一种宫颈脱落细胞的处理方法及宫颈脱落细胞裂解试剂盒
CN115161313A (zh) 一种高效高纯度分离细胞线粒体基因组的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210813