CN107586886B

CN107586886B - 一种快速检测猪腺病毒的试剂以及方法

Info

Publication number: CN107586886B
Application number: CN201711030142.2A
Authority: CN
Inventors: 陈平; 李娜; 钟鑫涛; 张婷婷; 李楠
Original assignee: Jiaxing Anyu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiaxing Anyu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2037-10-30
Also published as: US20190127811A1; CN107586886A; US11098380B2

Abstract

本发明提供一用于检测样本中猪腺病毒的试剂，其中，该试剂包括如下引物对，所述的引物为上游引物：（5’—3’）ATCTTGAAATCACAATTCTTCTG；下游引物：（5’—3’）CAAGGAGCAGYTGGTGGAG，Y为简并引物，为T或C；以及利用该试剂检测猪腺病毒的方法；这样的试剂或者方法检测猪腺病毒特异性强，灵敏度高，可以快速检测猪的腺病毒。

Description

一种快速检测猪腺病毒的试剂以及方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测流体样品中的腺病毒的试剂,特别地，属于一种快速检测猪腺病毒的试剂以及方法。

背景技术

下面的背景技术用于帮助读者理解本发明，而不能被认为是现有技术。

腺病毒是双链DNA病毒，具有典型的二十面体病毒外壳，病毒外壳含有三种主要的蛋白：六邻体、五邻体和纤突，这些蛋白对于腺病毒的感染起重要作用。在腺病毒感染中，复制早期的基因主要有E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4，其中E1基因表达产物对蛋白的复制和转化起着重要作用，是病毒复制不可缺的产物。

猪腺病毒，属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属，有4个血清型，猪腺病毒会引起猪腺病毒感染，存在一些脑炎、肾炎、肺炎和腹泻等临床症状，存在于普遍的猪群中，在猪的鼻腔、肛门、粪便中可以检测到，根据分离病毒和检测抗体的结果，发现世界各国的猪都在遭受该腺病毒的感染。

猪腺病毒只感染猪,不感染人和其他动物,但是该病毒可以转导多种人和动物的细胞。以猪腺病毒为基础的载体增殖滴度高,可以稳定地携带外源基因并实现外源基因在转导细胞中高效表达。同时，猪腺病毒与人腺病毒之间没有交叉免疫反应,因此,猪腺病毒载体既可以作为猪用疫苗的投递系统,又具有作为人用基因治疗和疫苗投递系统的潜力。目前，对于猪腺病毒的疫苗载体远远小于对于人腺病毒的研究，猪腺病毒载体疫苗将是疫苗载体开发的重要一个组成部分，同时，猪腺病毒的检测也是其市场化的一个短板。

基于复制缺陷型腺病毒载体制备的动物疫苗在以猪和牛为主的畜牧业中的运用正在逐步大规模实施。根据转基因技术的安全性严格的规范，对复制缺陷型腺病毒载体动物疫苗应用在猪和牛的安全性和对环境的影响需要快速检测。现在，猪腺病毒、牛腺病毒以及人复制缺陷型腺病毒已经成为畜牧业生产中最为关注的腺病毒类型，对其快速检测鉴定有着广泛的需求以及巨大的运用前景。上述三种腺病毒，易于混合感染，快速检测鉴定十分困难。

目前生物制品行业普遍采用细胞培养法，血吸附法，免疫荧光法进行检测，但这些方法敏感度低，检测周期长，检测精度低，结果判定易受多种因素影响，客观性不足，劳动量大等问题；常规PCR检测法虽然敏感性、稳定性、特异性较好，但容易污染，造成假阳性结果。这就需要提供一种更为可靠的、快速检测腺病毒，特别是猪腺病毒的试剂以及方法。

发明内容

我们的发明通过对NCBI数据库已报道的猪腺病毒基因序列比对，使用在线的BLAST找到高度保守区基因序列DBP(DNA Binding Protein)，该序列在各个血清型中高度同源，通过反复比对、筛选，设计了用于检测该序列的特异性的通用引物，不但适用于猪腺病毒5型，还适用于已知的其他3个血清型。

一方面，本发明提供一种用于检测样本中猪腺病毒的试剂，其中，该试剂包括1对引物，所述的引物为上游引物：(5’—3’)ATCTTGAAATCACAATTCTTCTG；下游引物：(5’—3’)CAAGGAGCAGYTGGTGGAG，Y为简并引物，为T或C。

在一些优选的方式中，所述的试剂包括能够完成核酸扩增的必要试剂。在一些优选的方式中，必要的试剂包括TaqDNA聚合酶。

在一些优选的方式中，所述的核酸扩增的方法为PCR、重组酶聚合酶扩增(RPA)、转录介导的扩增、基于核酸序列的扩增、信号介导的RNA扩增技术、链置换扩增、滚环扩增、环介导的DNA等温扩增、等温多重置换扩增、解链酶依赖性扩增、单引物等温扩增、环解链酶依赖性扩增以及切口和延长扩增反应中的一种或者几种。

另一方面，本发明涉及引物序列在制备检测样本中猪腺病毒的用途，其中所述的引物为上游引物：(5’—3’)ATCTTGAAATCACAATTCTTCTG；下游引物：(5’—3’)CAAGGAGCAGYTGGTGGAG，Y为简并引物，为T或C。

在前述所有的方法或用途中，所述的猪腺病毒包括5型猪腺病毒。

在前述所有的方法或用途中，所述的猪腺病毒包括如下几个血清型：AB026117.1、AC_000009.1、AF289262.1、AJ237815.1中的一个或者几个。

所述的样本采集于猪的鼻腔，或者肛门。

另一方面，本发明提供一种检测猪腺病毒的方法，该方法包括:PCR扩增目的产物，所述的PCR扩增的条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃最终延伸7min。

在一些优选的方式中，该方法还包括提供反应的混合物，该混合物包括样本总DNA3ul；10uM的上游引物1ul；10uM的下游引物1ul；TaqDNA聚合酶25ul；ddH₂O 20ul；其中上游引物为：(5’—3’)ATCTTGAAATCACAATTCTTCTG；下游引物为CAAGGAGCAGYTGGTGGAG，其中Y为T。

有益效果

本发明的主要优势有以下几点：特异性引物涵盖范围广，包含了所有的猪腺病毒血清型，其特异性的PCR引物可以区别于不同动物的腺病毒；避免了多重PCR中多对引物引起的非特异性结合而导致的假阴性；检测周期短，十分适合大量临床样本的鉴别，极大的缩短了动物实验的周期。与现有的技术相比，本发明扩增的片段位于腺病毒的DBP(DNABinding protein)区域，是相对比较保守的区域，特异性引物可以找到同源的区域。同时，与其他动物病毒如：流感病毒、口蹄疫病毒等，没有交叉反应。发明采用通用的引物，操作简单、耗材少，大大降低了操作成本，特别适用于腺病毒感染以及转基因技术安全性实验的大量临床样本的快速检测。特异性好：利用上述的方法对其他常见的病原，如：牛腺病毒、人腺病毒、新城疫病毒、A型流感病毒进行检测，其结果如图所示，结果皆为阴性，表明本发明有良好的特异性。准确性高：本发明通过对猪腺病毒分离结果与测序结果均符合，同时对于不同采样地点、不同采样时间的样本均适用。敏感度高：将阳性样本进行十倍稀释后进行PCR扩增。

附图说明

图1为拭子样本感染A-293细胞，其中，A：正常的A-293细胞B：病变的A-293细胞。

图2为病变细胞病毒DNA PCR扩增电泳结果，其中M：marker；P：阳性对照(猪腺病毒5型)；1～5：病变细胞病毒DNA；6：未病变细胞病毒DNA；N：阴性对照。

图3为拭子样本病毒DNA PCR扩增，M：marker；P：阳性对照(猪腺病毒5型)；N：阴性对照；1～7拭子样本病毒DNA。

图4为拭子样本病毒DNA PCR扩增，其中，M：marker；P：阳性对照(猪腺病毒5型)；N：阴性对照；11～28拭子样本病毒DNA。

图5为拭子样本病毒DNA PCR扩增，其中，M：marker；P：阳性对照(猪腺病毒5型)；N：阴性对照；11～28拭子样本病毒DNA。

图6为DNA Binding protein基因进化树，其中sequencing analysis为本病毒的测序结果。

图7为引物特异性检测结果图，M：marker；P：阳性对照(猪腺病毒5型)；N：阴性对照；1：A型流感病毒；2：牛腺病毒；3：人腺病毒；4：新城疫病毒；5：猪组织样本。

图8为引物特异性检测M：marker；P：阳性对照(猪腺病毒5型)；N：阴性对照；1～7：模板DNA稀释度分别为10、10²、10³、10⁴、10⁵，10⁶、10⁷(从左到右)。

具体实施方式

下面对本发明涉及的结构或这些所使用的技术术语做进一步的说明。这些说明仅仅是采用举例的方式进行说明本发明的方式是如何实现的，并不能对本发明构成任何的限制。

检测

检测表示化验或测试一种物质或材料是否存在，比如，但并不限于此，化学物质、有机化合物、无机化合物、新陈代谢产物、药物或者药物代谢物、有机组织或有机组织的代谢物、核酸、蛋白质或聚合物。另外，检测表示测试物质或材料的数量。进一步说，化验还表示免疫检测，化学检测、酶检测等。

样本

用本发明的检测试剂或者方法可以检测的样本包括生物液体(例如病例液体或者临床样本)。液体样本或者流体样本可以来源于固态或者半固态的样本，包括排泄物，生物组织和食品样本。利用任何适当的方法可以将固态或半固态的样本转化成液体样本，例如混合、捣碎、浸软、孵育、溶解或在合适的溶液中(例如水，磷酸盐溶液或其他缓冲溶液)利用酶解作用消化固体样本。“生物样本”包括来源于动物，植物和食品样本，例如包括来源于人或动物的尿，唾液，血及其成分，脊髓液、阴道分泌物，精子，粪便，汗液，分泌物，组织，器官，瘤，组织和器官的培养物，细胞培养物和介质。优选生物样本是尿或者拭子。食品样本包括食品加工的物质，最终产品，肉，干酪，酒，牛奶和引用水。植物样本包括源于任何植物，植物组织，植物细胞培养物和介质。“环境样本”来源于环境(例如，来自于湖或者其他水体的液体样本，污水样品，土质样品，地下水，海水和废液样品)。环境样本还可包括污水或者其他废水。利用本发明和合适的检测元件，可以检测任何被分析物。

优选利用本发明检测拭子中的腺病毒，特别是，检测猪拭子中的腺病毒，这种拭子可以采集鼻腔，或者肛门，或者其他部位的样本。

核酸检测方法

本发明所述的检测方法，可以是任何让核酸扩增的方法，例如PCR的方法，还可以其它的扩增方法，例如各种核酸扩增技术，包括例如重组酶聚合酶扩增(RPA)、转录介导的扩增、基于核酸序列的扩增、信号介导的RNA扩增技术、链置换扩增、滚环扩增、环介导的DNA等温扩增、等温多重置换扩增、解链酶依赖性扩增、单引物等温扩增、环解链酶依赖性扩增以及切口和延长扩增反应(参见US 2009/0017453)。聚合酶链反应是最广泛已知的方法，但区别在于其需要使用热循环以引起核酸链分离。这些扩增方法和其它扩增方法论述于以下中：例如，凡尼思(VanNess)等人，美国科学院院报(PNAS)2003，第100卷，第8期，第4504至4509页；谭(Tan)等人，分析化学(Anal.Chem.)2005，77，7984-7992；利泽德(Lizard)等人，自然生物技术(Nature Biotech.)1998，6，1197-1202；纳富(Notomi)等人，核酸研究(NAR)2000，28，12，e63；和克恩(Kurn)等人，临床化学杂志(Clin.Chem.)2005，51:10，1973-1981。有关这些常用扩增技术的其它参考文献包括例如美国专利第7,112,423号、第5,455,166号、第5,712,124号、第5,744,311号、第5,916,779号、第5,556,751号、第5,733,733号、第5,834,202号、第5,354,668号、第5,591,609号、第5,614,389号、第5,942,391号；和美国专利公开案第US20030082590号、第US20030138800号、第US20040058378号和第US20060154286号。所有上述文件都以引用方式并入本文中。

RPA是一种例示性等温核酸扩增方法。RPA采用称作重组酶的酶，其能够使寡核苷酸引物与双螺旋DNA中的同源序列成对。以此方式，DNA合成涉及试样DNA中的界定点。如果存在靶序列，则使用两种基因特异性引物开始指数式扩增反应。反应快速进展且在20到40分钟内从数个靶拷贝特异性扩增到可检测水平。RPA方法揭示于(例如)US 7,270,981、US7,399,590、US 7,777,958、US 7,435,561、US 2009/0029421和PCT/US2010/037611中，所有案件都以引用方式并入本文中。

具体实施方式

为了更为详细的说明本发明的试剂以及方法，现在以举例的方式进行说明，这些说明仅仅是证明本发明的精髓是如何实现的，而不能构成对本发明权利要求保护范围的限制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1标本和细胞

标本来自本实验于2016年和2017年于北京河南采集的猪鼻腔拭子和肛门拭子；研发中使用的AY-293细胞系为本公司由HEK293细胞自主构建和保存。

1.1.2主要试剂

DMEM培养基(批号：1830673)购自Gibco公司；

TaqDNA聚合酶(批号：A3901A)购自TaKaRa公司；

病毒DNA提取试剂盒(批号：AK2501、AK2502D)购自TaKaRa公司；

TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0(批号：AK2623D)购自TaKaRa公司；

DL2,000DNA Marker(批号：A2001B)购自TaKaRa公司；

动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒(批号：Lot.No.20150608)

组织裂解液TL(批号：706368BJ)购自博迈德生物有限公司。

1.1.3主要仪器

PCR仪VERIT196购自美国赛默飞世尔科技公司；高速台式离心机5810R购自德国Eppendorf公司；CO₂培养箱311购自美国赛默飞世尔科技公司；恒温水浴锅DK-8D购自上海精宏实验设备有限公司；凝胶成相分析仪Universal Hood II购自美国BIO-RAD公司。

1.2方法

1.2.1样品处理

将取自各地各个时间的样本进行登记整理，每个样本中加入1mlPBS，涡旋混匀后放入4℃冰箱1小时。

1.2.2细胞培养

第一日，准备AY-293细胞，接种24孔板，2.5*10⁵细胞/孔，0.5ml/孔，37℃，5％CO₂，静置培养。

第二日，制备样品，将5ml无血清DMEM培养基中加入0.5ml青链霉素(PS)，混匀后分到96孔板中，0.1ml/孔，将拭子4℃离心2000rpm，10min后，0.22微米的滤膜过滤，吸取上清分别加入96孔板中，0.1ml/孔，混匀。

取出24孔板，弃上清，用PBS洗细胞，然后将0.2ml的样品分别加到24孔板中，37℃，5％CO₂，感染作用1小时后，弃上清，补充5％FBS的DMEM培养基(含PS)，0.5ml/孔，37℃，5％CO₂，静置培养，连续观察三日，看有无病变。

第四日，再次准备细胞，接种24孔板，2.5*10⁵细胞/孔，0.5ml/孔，37℃，5％CO₂，静置培养。

第五日，收集病毒，-20℃～37℃反复冻融3次后，按照上面方法接种，盲传5代。倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)情况，病变程度达到80％时收集病毒液。

1.2.3病毒DNA/RNA提取

使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit按照说明书操作方法提取拭子样品中的病毒DNA。使用动物组织/细胞基因组DNA按照说明书操作方法提取试剂盒提取正常和病变细胞中的病毒DNA。

1.2.4引物设计

NCBI GenBank数据库中下载的四个血清型猪腺病毒的基因DBP(DNA BindingProtein)的序列，其中，下载的四个猪腺病毒血清型的基因序列号为：AB026117.1、AC_000009.1、AF289262.1、AJ237815.1，将其进行同源性分析，并从四个血清型猪腺病毒各自的序列中找到型内比较保守但血清型之间存在变异的区域设计的引物序列，上游引物：(5’—3’)ATCTTGAAATCACAATTCTTCTG；下游引物：(5’—3’)CAAGGAGCAGYTGGTGGAG，Y为简并引物，为T或C；预计扩增片段长度为534bp。

1.2.5PCR扩增

收集病毒感染的A-293细胞，12000rpm离心1min，按照天根小量组织/细胞基因组DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA，按照下述扩增条件进行PCR扩增。

PCR扩增体系：样本总DNA 3ul；10uM的上游引物1ul；10uM的下游引物1ul；TaqDNA聚合酶25ul；ddH₂O 20ul。其中上游引物为：(5’—3’)ATCTTGAAATCACAATTCTTCTG；下游引物为CAAGGAGCAGYTGGTGGAG，其中Y为T。

PCR扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃最终延伸7min；每次PCR扩增的阳性对照为猪5型腺病毒，阴性对照为ddH₂O。PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像系统中观察，拍照并记录结果。使用胶回收试剂盒将扩增的PCR产物纯化和回收，委托英潍捷基(上海)贸易有限公司进行序列测定。

1.2.6同源性分析

用SeqMan2.0拼接测序结果，并将测序结果用BLAST进行同源比对，使用MEGA5.0构建进化树。

1.2.7引物敏感度检测

将阳性样本DNA进行十倍稀释，稀释度为10、10²、10³、10⁴、10⁵，将其作为模板，并用上述PCR扩增体系以及扩增条件进行检测。

1.2.8引物特异性分析

利用上述方法对其他常见的病毒，如A型流感病毒、牛腺病毒、人腺病毒、新城疫病毒进行检测。

2结果

2.1猪腺病毒的检测

2.1.1病毒的分离

用所采集的拭子样本接种A-293细胞，在普通的光学显微镜下可见：为接种的拭子样本的正常的A-293细胞的对照培养基清亮，细胞为多角形、长菱形；接种拭子的部分阳性样本组织细胞肿胀变圆，成团，如葡萄状(图B)。结果为30个样本中5个样本发生病变。说明所采集的30个样本中，有5个样本为阳性样本，含有猪腺病毒。从传统的细胞培养的方法来验证所采集的样本是否含有腺病毒。

2.1.2病变细胞病毒DNA PCR扩增及电泳结果

将病变的细胞通过动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取后经过PCR扩增(扩增所用试剂和方法和1.2.5所列举的试剂和方法进行)，均可以发现其病变的细胞中均呈现阳性(图2)。

2.2拭子样本病毒DNA PCR扩增以及电泳结果

将拭子样品直接提取病毒DNA，通过PCR扩增检测(扩增所用试剂和方法和1.2.5所列举的试剂和方法进行)，30个拭子样品中出现5个阳性，分别为4、7、15、18、29号样本，与细胞分离纯化的结果相同(结果见图3和图4以及图5)。

2.3测序结果

将5个目的条带进行分别测序，反馈的测序结果，使用SeqMan2.0拼接。

测序结果发现5个目的片段进行测序拼接后都是如下序列：

TTTGCAGCACTGAACACGAGCACCGCTGGGTGGTCCAGAGTGGCTAAAATCTTCGGGTCGTCCATCAGGTTTCTGTCGATGTTGCCCGGCGTAGACATGGCAAACGGGGTCACCTTGCACGTTTGCTTGCCAAGAAGCGGCAGGTGGTTGGCTCCCTAGTTGCACTCGCAGACCAGAGGCATGAGGAGGTGAGACTCGGCCGTTGTCATGTTGGGATAGATGGCCGTGACGAAGGCGGCGATCTGGCGAAAAGCGGTGACAGCTTTTGGTCCGTCAGAGTAAAAATAGCCGCAAGACTGAGGACTGAAGGTATTGATGGGCGATTTTGCGTCGTTTACGCAGCACATGGCGTCGCTGTTGCGGATTTGCACCACACTGCGTCCCCATCTGTTGGTGACAATCTTGGCCTTCTCTGGGGTTTCCTTGAGAGCTCTCTGCCCGTTTTCGCTGTTGATATCCATCTCCACCACTGGCTCCCTGGA

2.4基因分型分析

将测序结果在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的网站用BLAST程序进行同源比对，发现获得为猪腺病毒5型(其序列号为AF289262.1)的同源性为97％。同时为了进一步确认其血清型，将猪腺病毒的四个血清型以及牛腺病毒的血清型，序列号为AC_000002.1、AC_000191.1、JQ345700.1、NC_001876.1、NC_002685.2，使用MEGA5.0构建进化树(图6)，结果表明该腺病毒与猪5型腺病毒高度同源，综合判断该毒株为猪5型腺病毒(图6)。

2.5引物特异性分析

使用上述引物，检测A型流感病毒、牛腺病毒、人腺病毒、新城疫病毒、猪组织样本(阴性)，发现无条带出现，说明我们的引物很好的特异性，没有交叉反应。

使用的引物对为：上游引物为：(5’—3’)ATCTTGAAATCACAATTCTTCTG；下游引物为CAAGGAGCAGYTGGTGGAG，其中Y为T。或者，上游引物为：(5’—3’)ATCTTGAAATCACAATTCTTCTG；下游引物为CAAGGAGCAGYTGGTGGAG，其中Y为C。都获得如图7的结果，说明该引物对具有高的特异性。同时，当采用平行的其它引物，例如，下游引物中Y为A或者G的时候，结果发现，与牛腺病毒、人腺病毒会出现阳性结果，这就说明当下游引物中Y为A或者G的时候,不具有特异性，不能区分出具体的物种的病毒(图7)。

2.6引物敏感性分析

阳性样本DNA进行十倍稀释，稀释度为10、10²、10³、10⁴、10⁵，10⁶、10⁷，PCR扩增检测的最低稀释度为10⁶，说明本发明的特异性引物有很高的敏感性(图7)。

2.6结果统计

表1拭子样本PCR检测方法以及病毒分离结果统计。

以上引物用本发明的两个引物对都获得了阳性的结果，与细胞培养的结果一致。

在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。

本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。

序列表

<110> 嘉兴安宇生物科技有限公司

<120> 一种快速检测猪腺病毒的试剂以及方法

<130> AppFileReference :17-100070-00002731

<140> CurrentAppNumber :

<141> 2017-10-30

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 1

atcttgaaat cacaattctt ctg 23

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 2

caaggagcag ytggtggag 19

<210> 3

<211> 482

<212> DNA

<213> 腺病毒(人工序列)

<400> 3

tttgcagcac tgaacacgag caccgctggg tggtccagag tggctaaaat cttcgggtcg 60

tccatcaggt ttctgtcgat gttgcccggc gtagacatgg caaacggggt caccttgcac 120

gtttgcttgc caagaagcgg caggtggttg gctccctagt tgcactcgca gaccagaggc 180

atgaggaggt gagactcggc cgttgtcatg ttgggataga tggccgtgac gaaggcggcg 240

atctggcgaa aagcggtgac agcttttggt ccgtcagagt aaaaatagcc gcaagactga 300

ggactgaagg tattgatggg cgattttgcg tcgtttacgc agcacatggc gtcgctgttg 360

cggatttgca ccacactgcg tccccatctg ttggtgacaa tcttggcctt ctctggggtt 420

tccttgagag ctctctgccc gttttcgctg ttgatatcca tctccaccac tggctccctg 480

ga 482

Claims

1.一种用于检测样本中猪腺病毒的试剂，其中，该试剂包括如下引物对，所述的引物为上游引物：5’-ATCTTGAAATCACAATTCTTCTG-3；下游引物：5’-CAAGGAGCAGYTGGTGGAG-3’，Y为简并引物，为T或C，其中，所述的猪腺病毒为5型猪腺病毒。

2.根据权利要求1所述的试剂，其中，所述的试剂包括能够完成核酸扩增的必要试剂，所述的必要的试剂包括TaqDNA聚合酶。

3.一种引物在制备用于检测样本中猪腺病毒的试剂中的用途，其中所述的引物为上游引物：5’-ATCTTGAAATCACAATTCTTCTG-3’；下游引物：

5’-CAAGGAGCAGYTGGTGGAG-3’，Y为简并引物，为T或C；其中，所述的猪腺病毒为5型猪腺病毒。

4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述的样本采集于猪的鼻腔或者肛门。