CN110904096B - 一种利用抑制剂提取不含dna的rna方法 - Google Patents

一种利用抑制剂提取不含dna的rna方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用抑制剂提取不含DNA的RNA方法，本发明使用经处理的生长至一定周期的小桐子幼叶研磨上清液，与样本进行共提取，可以阻止样本中与病原体RNA同源的病原体DNA的回收，从而提高病原体RNA的提取质量。样本包括但不仅是病毒、细菌等。本发明的提取方法可以达到安全、经济、高效，不用增加时间长、成本高的DNAse I消化步骤，即可获得不含同源DNA的病原体RNA。

Description

一种利用抑制剂提取不含DNA的RNA方法
技术领域
本发明属于核酸提取技术领域，特别涉及一种利用抑制剂提取不含DNA的RNA方法。
背景技术
核酸提取是分子生物学研究的基础技术。在一些病原体的扩增实验中，我们需要检测其中的RNA，而不能检测出同源的DNA。如果这些同源的DNA难以去除干净，就可能会造成假阳性的结果。
例如，血清中的HBV pgRNA代表当前肝组织中的HBV cccDNA是否活跃，如果研究人员扩增血清中的HBV pgRNA，RT-qPCR实验会将血清中的HBV DNA(HBV rcDNA)一并扩增，RNA和DNA共同扩增，不能正确反映肝组织中HBV cccDNA复制的活跃程度，影响后续实验的精准度。
在临床检验方面，检测痰液活的结核杆菌，需要去除结核杆菌的DNA，检测对象是活菌中仅表达的mRNA。如果结核杆菌DNA被扩增，则无法判断痰液中的结核杆菌是否具有感染性。
在现有技术中，获得不含DNA的RNA提取方法，主要依靠DNAse(主要是DNAse I)的消化作用。但是DNAse的活性并不稳定，通常并不能将DNA去除干净。而且DNAse价格昂贵，使用量大，很难广泛应用于病原体的检测。
传统的Trizol法(酸酚法)通常被认为可去除DNA。Trizol法主要使用异硫氰酸胍和重蒸酚，异硫氰酸胍裂解细胞后，通过有机相萃取掉结合了大量组蛋白的基因组DNA，可以去除大部分基因组DNA。但此方法无法去除结合蛋白较少、分子量较小的DNA，如质粒DNA和病毒DNA。所以Trizol法并不适合前面两种应用。而且Trizol法需要使用苯酚、氯仿等有机试剂，严重危害了研究人员的身体健康。
根据现有问题，本发明致力于寻求一种提取不含有DNA的RNA方法。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种方法，无须DNAse I，通过与含有抑制剂的植物成分共提取，回收不含DNA的RNA。
为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一个方面，提出了小桐子幼叶的应用，小桐子幼叶作为DNA抑制剂在RNA提取中的应用。
根据本发明的实施例，所述小桐子幼叶生长10～30天的小桐子幼叶。
根据本发明的实施例，所述RNA提取适用不含同源DNA的病毒RNA或杆菌RNA。
根据本发明的实施例，所述肝炎病毒为乙型肝炎病毒；所述杆菌为结核杆菌。
根据本发明的实施例，所述小桐子因结合样本DNA而减少DNA含量。
根据本发明的实施例，所述RNA提取步骤如下：将小桐子幼叶和裂解液混合后，与样本混合；异丙醇磁吸、洗涤液磁吸和洗脱液磁吸，取上清即得不含DNA的RNA。
本发明第二个方面，提出了前面所述小桐子幼叶的使用方法，包括以下步骤：
①小桐子幼叶在液氮中迅速研磨成粉末；
②将Buffer S加到粉末，混合成裂解混合液，振荡使其裂解；
③将裂解混合液孵育；
④再加入Buffer P冰上孵育；
⑤将裂解混合液离心，取上清液；
⑥将步骤⑤上清液与样本混合，使用常规方法进行RNA提取。
根据本发明的实施例，步骤②所述Buffer S由以下质量份成分组成：50mM Tris，20～30mM EDTA，3～5％SDS。
根据本发明的实施例，步骤②所述Buffer S包括50mM Tris、25mM EDTA和3％SDS。
根据本发明的实施例，所述小桐子幼叶和Buffer S的质量体积比为：50～100mg：400～500μL。
根据本发明的实施例，步骤③所述孵育条件为：65～70℃孵育10～15分钟，倒置管混合2～3次。
根据本发明的实施例，步骤④Buffer P与步骤②Buffer S体积比：400～500μL：130～162.5μL。
根据本发明的实施例，步骤④所述Buffer P为3M乙酸钾KOAc，pH 5.5。
根据本发明的实施例，步骤⑤20,000×g离心5～10分钟。
根据本发明的实施例，步骤⑥所述样本选自HBV血清、肺灌洗液或NaOH处理过的结核杆菌痰液的任意一种；所述上清液与样本体积比为1：9～19。
根据本发明的实施例，所述小桐子研磨液中的某种成分结合了混合液中的DNA，造成DNA无法被提取。
发明人偶然发现，提取小桐子幼叶的核酸时，仅能够提取RNA，而无法提取DNA。将提取试剂的组成改变，加入5％的PVP40用于结合其中的抑制剂后，可以同时提取小桐子幼叶的DNA和RNA。发明人推测，小桐子幼叶存在某种可被PVP40结合的抑制剂，结合了DNA，使DNA无法回收，但这种抑制剂并不会结合RNA。因此，可以将这两者结合起来，反常规思维而行(核酸提取的纯度越高越好)，通过人为地引入小桐子进行共提取，获得不含同源DNA的RNA。
本发明的有益效果是：
本发明公开了一种利用抑制剂回收不含DNA的RNA的方法，本发明使用经处理的生长至一定周期的小桐子幼叶研磨上清液，与样本进行共提取，可以阻止样本中与病原体RNA同源的病原体DNA的回收，从而提高病原体RNA的提取质量。样本包括但不仅是病毒、细菌等。本发明的提取方法可以达到安全、经济、高效，不用增加时间长、成本高的DNAse I消化步骤，即可获得不含同源DNA的病原体RNA。
附图说明
图1为使用本发明方法扩增HBV pgRNA的扩增曲线图。
图2为使用本发明方法扩增结核杆菌mRNA的扩增曲线图。
图3为使用生长天数为30天的小桐子幼叶扩增结核杆菌mRNA的扩增曲线图。
图4是使用生长天数为330天的小桐子叶片扩增图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。
实施例1
HBV样本购自广州邦德盛生物科技有限公司，经
Figure BDA0002331537980000031
HBV试剂盒(购自：罗氏股份公司)检测，测得HBV DNA＞105IU/mL。
小桐子幼叶：生长10天的小桐子幼叶
小桐子幼叶处理方法：
①50～100mg小桐子幼叶在液氮中迅速研磨成粉末；
②加入500μL Buffer S(50mM Tris，25mM EDTA，3％SDS)，涡旋振荡使其充分裂解；
③将混合液在65℃孵育10分钟。在培养期间通过倒置管混合2或3次；
④向混合液中加入162.5μL Buffer P(3M KOAc，pH 5.5)，混合，在冰上孵育5分钟；
⑤将混合液以20,000x g(14,000rpm)离心5分钟，吸取上清液100μL至新的离心管，待用。
将20μL上清液与380μL HBV血清样本混合后按下面方法进行核酸提取。
核酸提取试剂及其方法：
裂解液：Tris-Cl pH 8，4M异硫氰酸胍，15％Triton X-100，100mM NaCl；
洗涤液1：3M盐酸胍，65％乙醇；
洗涤液2：75％乙醇；
洗脱液：10mM Tris-Cl pH 7.5，1mM EDTA；
1)将400μL样本加入1200μL裂解液中，混匀后，1000rpm振荡5min；
2)加入400μL异丙醇，30μL粒径1μm的羟基磁珠(购自：苏州为度生物)，静置1min，用磁力架进行磁吸，弃废液；
3)添加600μL洗涤液1，静置1min，磁吸弃废液；
4)添加600μL洗涤液2，静置1min，磁吸弃废液；
5)添加600μL洗涤液2，静置1min，磁吸弃废液；
6)添加100μL洗脱液，静置1min，磁吸，吸取上清即为不含DNA的RNA。
RT-qPCR反应
实验组的反应液体系如下：
Figure BDA0002331537980000041
所述qPCR PreMix购自：天根生化；货号：FP206 SuperReal PreMix。
同时设立无MMLV酶作为对照组，反应液体系如下：
Figure BDA0002331537980000042
其中：
所述上游引物：5’-GGTCCCCTAGAAGAAGAACTCC-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-GATTGAGATCTTCTGCGACGC-3’(SEQ ID NO.2)；
荧光探针：5’-Fam-TCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAA-BHQ1-3’(SEQ ID NO.3)。
qPCR检测反应程序为：
45℃1h；95℃5min；95℃15s，58℃45s，72℃10s，循环10次；95℃15s，58℃45s，循环40次。
结果：实验组qPCR检测，扩增Ct值为17.89；无MMLV对照组无扩增目的条带。本申请提取核酸以及核酸扩增方法，可用于检测血清样本中HBV pgRNA，而且不会同时扩增出血清样本中的HBV DNA。
图1为使用本发明方法扩增HBV(乙型肝炎病毒)pgRNA的效果，其中无MMLV对照组中的MMLV高温(100℃10min，冷却至室温)灭活，仅可以扩增提取核酸中的DNA。实验证明，使用本发明方法提取的核酸中不含有HBV DNA。
实施例2
样本：180μL结核病人的肺灌洗液
小桐子幼叶：生长15天的小桐子幼叶
小桐子幼叶处理方法：
①50～100mg小桐子幼叶在液氮中迅速研磨成粉末；
②加入500μL Buffer S(50mM Tris，25mM EDTA，3％SDS)，涡旋振荡使其充分裂解；
③将混合液在65℃孵育10分钟。在培养期间通过倒置管混合2或3次；
④向混合液中加入162.5μL Buffer P(3M KOAc，pH 5.5)，混合，在冰上孵育5分钟；
⑤将混合液以20,000x g(14,000rpm)离心5分钟，吸取上清液100μL至新的离心管，待用。
将20μL上清液与180μL结核病人的肺灌洗液样本混合后按下面方法进行核酸提取。
裂解液：Tris-Cl pH 5，5M异硫氰酸胍，10％Triton X-100，50mM NaI，1mM 1-硫代甘油；
洗涤液1：3M异硫氰酸胍，65％乙醇；
洗涤液2：75％乙醇；
洗脱液：10mM Tris-Cl pH 7.5；
离心柱购自：天根生化；
核酸提取：
1)4℃、13,400×g(12,000rpm)离心2min收集菌体，加入90μL 1xTE缓冲液，彻底重悬；
2)加入10μL 50mg/mL的溶菌酶(购自上海生工，货号：A610308)，吹打混匀，25℃孵育30min；
3)加入350μl裂解液混匀，边吹打混合液边转移到离心柱；
4)加入200μl异丙醇，静置2min，13,400×g离心1min，弃滤液；
5)加入600μl预先加有无水乙醇的洗涤液1，10000×g离心1min，弃废液；
6)加入600μl预先加有无水乙醇的洗涤液2，10000×g离心1min，弃废液；
7)加入600μl预先加油无水乙醇的洗涤液2，10000×g离心1min，弃废液；
8)13,400×g离心2min，弃套管，吸附柱转入新的离心管中；
9)滴加50μl洗脱液，室温放置2min，13,400×g离心1min。
核酸qPCR反应
实验组的反应液体系如下：
Figure BDA0002331537980000061
无MMLV酶对照组：
Figure BDA0002331537980000062
其中：
所述上游引物：5’-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3’(SEQ ID NO.4)；
下游引物：5’-GCCCGCACGCTCACA-3’(SEQ ID NO.5)；
荧光探针：5’-Fam-TGAAATCTCACGGCTTAA-MGB-3’(SEQ ID NO.6)。
qPCR检测反应程序为：
45℃1h；95℃5min；95℃15s，58℃45s，72℃10s，循环8次；95℃15s，58℃45s，循环40次。
结果：实验组qPCR检测，扩增Ct值为28.17；无MMLV对照组无扩增目的条带。图2为使用本发明方法扩增结核杆菌mRNA的图，表明本发明方法可提取肺灌洗液样本中的结核杆菌mRNA，不会同时检测结核杆菌DNA，可用于检测活的结核杆菌。
实施例3
样本：结核病人的肺灌洗液
小桐子幼叶为生长30天的小桐子幼叶
小桐子幼叶处理方法：
①50～100mg小桐子幼叶在液氮中迅速研磨成粉末；
②加入500μL Buffer S(50mM Tris，25mM EDTA，3％SDS)，涡旋振荡使其充分裂解；
③将混合液在65℃孵育10分钟。在培养期间通过倒置管混合2或3次；
④向混合液中加入162.5μL Buffer P(3M KOAc，pH 5.5)，混合，在冰上孵育5分钟；
⑤将混合液以20,000x g(14,000rpm)离心5分钟，吸取上清液100μL至新的离心管，待用。
将20μL上清液与180μL结核病人的肺灌洗液样本混合后按下面方法进行核酸提取。
裂解液：Tris-Cl pH 5，5M异硫氰酸胍，10％Triton X-100，50mM NaI，1mM 1-硫代甘油；
洗涤液1：3M异硫氰酸胍，65％乙醇；
洗涤液2：75％乙醇；
洗脱液：10mM Tris-Cl pH 7.5；
离心柱购自：天根生化；
核酸提取：
1)4℃、13,400×g(12,000rpm)离心2min收集菌体，加入90μL 1xTE缓冲液，彻底重悬；
2)加入10μL 50mg/mL的溶菌酶(购自上海生工，货号：A610308)，吹打混匀，25℃
孵育30min；
3)加入350μl裂解液混匀，边吹打混合液边转移到离心柱；
4)加入200μl异丙醇，静置2min，13,400×g离心1min，弃滤液；
5)加入600μl预先加有无水乙醇的洗涤液1，10000×g离心1min，弃废液；
6)加入600μl预先加有无水乙醇的洗涤液2，10000×g离心1min，弃废液；
7)加入600μl预先加油无水乙醇的洗涤液2，10000×g离心1min，弃废液；
8)13,400×g离心2min，弃套管，吸附柱转入新的离心管中；
9)滴加50μl洗脱液，室温放置2min，13,400×g离心1min。
核酸qPCR反应
实验组的反应液体系如下：
Figure BDA0002331537980000081
无MMLV酶对照组：
Figure BDA0002331537980000082
其中：
所述上游引物：5’-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3’(SEQ ID NO.4)；
下游引物：5’-GCCCGCACGCTCACA-3’(SEQ ID NO.5)；
荧光探针：5’-Fam-TGAAATCTCACGGCTTAA-MGB-3’(SEQ ID NO.6)。
qPCR检测反应程序为：
45℃1h；95℃5min；95℃15s，58℃45s，72℃10s，循环8次；95℃15s，58℃45s，循环40次。
结果：实验组qPCR检测，扩增Ct值为28.17；无MMLV对照组无扩增目的条带。图3为使用本发明方法扩增结核杆菌mRNA的图，表明本发明方法可提取肺灌洗液样本中的结核杆菌mRNA，不会同时检测结核杆菌DNA，可用于检测活的结核杆菌。
对比例1
HBV样本获得：购自广州邦德盛生物科技有限公司，经
Figure BDA0002331537980000091
HBV试剂盒(购自：罗氏股份公司)检测，测得HBV DNA＞105IU/mL。
小桐子幼叶：生长330天的小桐子幼叶
小桐子幼叶处理方法：
①50～100mg小桐子幼叶在液氮中迅速研磨成粉末；
②加入500μL Buffer S(50mM Tris，25mM EDTA，3％SDS)，涡旋振荡使其充分裂解；
③将混合液在65℃孵育10分钟。在培养期间通过倒置管混合2或3次；
④向混合液中加入162.5μL Buffer P(3M KOAc，pH 5.5)，混合，在冰上孵育5分钟；
⑤将混合液以20,000x g(14,000rpm)离心5分钟，吸取上清液100μL至新的离心管，待用。
将20μL上述上清液与380μL HBV血清样本混合后按下面方法进行核酸提取。
核酸提取
裂解液：Tris-Cl pH 8，4M异硫氰酸胍，15％Triton X-100，100mM NaCl；
洗涤液1：3M盐酸胍，65％乙醇；
洗涤液2：75％乙醇；
洗脱液：10mM Tris-Cl pH 7.5，1mM EDTA；
1)将400μL样本加入1200μL裂解液中，混匀后，1000rpm振荡5min；
2)加入400μL异丙醇，30μL粒径1μm的羟基磁珠(购自：苏州为度生物)，静置1min，用磁力架进行磁吸，弃废液；
3)添加600μL洗涤液1，静置1min，磁吸弃废液；
4)添加600μL洗涤液2，静置1min，磁吸弃废液；
5)添加600μL洗涤液2，静置1min，磁吸弃废液；
6)添加100μL洗脱液，静置1min，磁吸，吸取上清即为不含DNA的RNA。
RT-qPCR反应
实验组的反应液体系如下：
Figure BDA0002331537980000101
所述qPCR PreMix购自：天根生化；货号：FP206 SuperReal PreMix。
同时设立无MMLV酶作为对照组，反应液体系如下：
Figure BDA0002331537980000102
其中
所述上游引物：5’-GGTCCCCTAGAAGAAGAACTCC-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-GATTGAGATCTTCTGCGACGC-3’(SEQ ID NO.2)；
荧光探针：5’-Fam-TCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAA-BHQ1-3’(SEQ ID NO.3)。
qPCR检测反应程序为：
45℃1h；95℃5min；95℃15s，58℃45s，72℃10s，循环10次；95℃15s，58℃45s，循环40次。
结果：图4中，实验组和对照组qPCR检测，均无目的条带扩增出来。由此可知，本发明提取方法不能使用生长时间过久的小桐子叶片进行提取。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州湾区生物科技有限公司
<120> 一种利用抑制剂提取不含DNA的RNA方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtcccctag aagaagaact cc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gattgagatc ttctgcgacg c 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcgcctcgca gacgaaggtc tcaa 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggtggtttgt cgcgttgttc 20
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcccgcacgc tcaca 15
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgaaatctca cggcttaa 18

Claims (8)

1.小桐子幼叶作为DNA提取抑制剂在RNA提取中的应用；所述RNA提取包括以下步骤：将小桐子幼叶和裂解液混合后，与样本混合；异丙醇磁吸、洗涤液磁吸和洗脱液磁吸，取上清即得不含DNA的RNA，所述小桐子幼叶为生长10～30天的小桐子幼叶。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RNA为病毒RNA或结核杆菌RNA。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述病毒为乙型肝炎病毒。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小桐子幼叶结合样本DNA而减少DNA含量。
5.小桐子幼叶作为DNA提取抑制剂在RNA提取中的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
①小桐子幼叶在液氮中研磨成粉末；所述小桐子幼叶为生长10～30天的小桐子幼叶；
②将Buffer S加到粉末，混合成裂解混合液，振荡使其裂解；所述Buffer S为Tris、EDTA和SDS；
③将裂解混合液孵育；
④再加入Buffer P冰上孵育；所述Buffer P为乙酸钾；
⑤将裂解混合液离心，取上清液；
⑥将步骤⑤上清液与样本混合，使用常规方法进行RNA提取。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述小桐子幼叶和Buffer S的质量体积比为：50~100 mg：400~500μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤③所述孵育条件为：65～70℃孵育10～15分钟，倒置管混合2～3次。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤⑥所述样本选自HBV血清、肺灌洗液或NaOH处理过的结核杆菌痰液的任意一种；所述上清液与样本体积比为1：9~19。
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