CN111074005A - 一种检测2019新型冠状病毒的双靶位点反转录荧光pcr引物、探针及试剂盒 - Google Patents

一种检测2019新型冠状病毒的双靶位点反转录荧光pcr引物、探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测2019新型冠状病毒的双靶位点反转录荧光PCR引物、探针及试剂盒，通过对2019新型冠状病毒全基因组进行核酸序列比对，找到了该病毒N基因中3条特异性核酸序列W1、W2、W3，序列分别如SEQ ID NO.1‑3所示，针对3个靶位点，分别设计多对引物探针，发现将针对W1和W2的靶点设计的引物探针组合(序列分别如SEQ ID NO.4‑6、SEQ ID NO.7‑9所示)进行双靶位点反转录荧光PCR，能够特异、灵敏地检测2019新型冠状病毒，检测灵敏度在10个拷贝以内，对临床常见22种呼吸道病原体均无非特异扩增，可有效避免单靶点突变造成的假阴性结果，具有良好的标本检测能力。

Description

一种检测2019新型冠状病毒的双靶位点反转录荧光PCR引物、 探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，特别是涉及用于检测2019新型冠状病毒的靶位点，针对靶位点的特异性引物和探针，本发明还涉及利用该引物和探针进行2019新型冠状病毒检测的方法和试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV)是2020年1月最新检测到的一种人致病性冠状病毒，引发不明原因肺炎疫情的呼吸道病原。临床表现为发热、乏力等全身症状，伴有干咳，住院患者呼吸困难较为常见；绝大多数患者入院时生命体征大致平稳。该病毒虽未发现人与人之间的传染性，但仍然需要密切监测防止更大规模的感染。2020年1月11日至12日，该病毒的6组基因组序列信息公布，通过基因组序列对比，发现其序列与SARS 病毒较为相近，是SARS病毒的变异株，而6组基因序列中有冠状病毒N 基因上的变异。
检测病毒感染的传统手段为显微镜镜检、抗原检测。显微镜镜检涉及细胞培养，耗时较长，且需要一定的镜检技术经验；抗原检测大多基于ELISA，虽然能够快速得到检测结果，但灵敏度仍然较低。目前，病毒感染的检测主要依赖于核酸检测技术，如PCR、全基因组测序等，尤其是实时荧光PCR(qPCR)技术，具有极高的灵敏度和特异性，能够快速、准确的得到检测结果。目前，2019-nCoV感染无法通过特异性的临床症状进行识别诊断，核酸检测技术是其最重要的技术手段，通过快速的RT-qPCR技术，能够快速、准确地识别临床有疑似症状的检测者。可做到对2019-nCoV的快速检测，防止疫情扩散。
2019-nCoV归属为新型的SARS变异病毒，但目前尚没有经CFDA认证的商品化2019-nCoV核酸检测试剂盒，部分生物科技公司目前研发了针对2019-nCoV检测的科研用核酸检测试剂盒。但目前所有的2019-nCoV 核酸检测试剂盒均是基于传统RT-qPCR检测技术，其检测使用的引物探针均是针对单一的病原核酸序靶位点都设计的。众所周知，病毒的核酸序列变异程度高，其单碱基突变的频率约为10-6，远高于细菌的10-9。因此，针对病毒的核酸检测，单一靶位点容易产生由于突变导致假阴性检测结果，造成漏检。
发明内容
本发明目的在于建立一种具有高灵敏度和特异度的双靶位点 2019-nCoV检测的RT-qPCR方法、及用于该方法的特异性引物、探针和试剂盒。以弥补目前该新型冠状病毒核酸检测方法的空白；针对病毒核酸变异性高的特点，双靶位点的设计可极大的降低单一靶点对变异病毒的漏检情况。
本发明通过对6株2019新型冠状病毒(2019-nCoV)全基因测序和比对，发现了3段2019-nCoV的N基因上保守且具有种间特异性的核酸序列(W1-W3)，其序列分别如SEQ IDNO.1-3所示。本发明这对这 3个靶点涉及了多套相应的特异性引物探针组合用于分别检测3个靶点，在多套引物探针组合中，进一步筛选出4套检测效果优良的特异性引物探针组合，它们对靶位点的检测限达到了10-100拷贝。本发明进一步设计了针对该2019-nCoV病毒检测的双靶位点反转录荧光PCR (RT-qPCR)引物和探针，并由此进行检测的方法和试剂盒。
具体而言，第一方面，本发明首先提供了用于检测2019新型冠状病毒的靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、和/或SEQ ID NO.2、和 /或SEQ ID NO.1所示。这3个特异性强的靶序列分别命名为W1、W2、 W3。
本发明提供了上述靶序列W1、和/或W2、和/或W3在检测 2019-nCoV病毒中的应用。
优选地，本发明提供了用于检测2019新型冠状病毒的靶序列组合，即W1+W2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、和SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本发明提供了用于检测上述靶序列或靶序列组合的检测试剂在检测2019新型冠状病毒中的应用。
第三方面，本发明提供了一种用于检测2019新型冠状病毒的特异性引物探针组合，其为以下任一个或多个特异性引物探针组合：
(1)引物序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针序列如SEQ ID NO.6 所示；或
(2)引物序列如SEQ ID NO.7-8所示，探针序列如SEQ ID NO.9 所示；或
(3)引物序列如SEQ ID NO.10-11所示，探针序列如SEQ ID NO.12 所示；或
(4)引物序列如SEQ ID NO.13-14所示，探针序列如SEQ ID NO.15 所示。
含有上述特异性引物探针组合属于本发明的保护范围。
优选地，本发明提供一种用于检测2019新型冠状病毒的特异性引物探针组合，其由两个特异性引物探针组合组成，(1)引物序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针序列如SEQ IDNO.6所示；和(2)引物序列如 SEQ ID NO.7-8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示。
探针的5’分别标记荧光基团，3’标记淬灭基团。所述荧光基团选自但不限于FAM、VIC或CY5，所述淬灭基团选自但不限于BHQ1、MGB。在本发明的实施例中，探针类型是MGB探针，荧光基团为FAM。
第四方面，本发明提供一种检测2019新型冠状病毒的双靶位点反转录荧光检测试剂盒，该试剂盒含有两个特异性引物探针组合，(1) 引物序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示；和(2) 引物序列如SEQ ID NO.7-8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示。
上述试剂盒工作原理是以待测样品基因组RNA为模板，同时利用第(1)、第(2)个特异性引物探针组合，进行双靶位点反转录荧光定量PCR，根据扩增曲线和荧光信号判定结果。
优选地，所述反转录荧光定量PCR的25μl反应体系为：
Figure BDA0002372303230000041
和/或，所述反转录荧光定量PCR的反应程序为：50℃15min；95℃预变性3min；95℃变性30s，58-61℃退火30s，45个循环。
第五方面，本发明一种检测2019新型冠状病毒的双靶位点反转录荧光检测方法，以待测样品基因组RNA为模板，同时利用上述第(1)、 (2)组的特异性引物探针组合，进行双靶位点反转录荧光定量PCR，根据扩增曲线和荧光信号判定结果。
本领域技术人员能够理解，出于防疫部门对流行病学第一手资料掌握与统计的目的、或检验检疫部门对进出口食品、生活用品、动植物产品的检验检疫的目的，均需要快速、准确、灵敏地实现对2019新型冠状病毒的检测，因此，本发明提供了一种非疾病诊断目的的检测2019新型冠状病毒的双靶位点反转录荧光检测方法，以待测样品基因组RNA为模板，同时利用上述第(1)、(2)组的特异性引物探针组合，进行双靶位点反转录荧光定量PCR，根据扩增曲线和荧光信号判定结果。
无论是疾病诊断目的，还是非疾病诊断目的，采用本发明的试剂盒或本发明的方法对待测样品进行检测时，每次检测标本时必须设立NTC 对照(无模板对照)、NEG(阴性对照)和POS对照(阳性对照)，三种对照对于结果判读起决定性作用：有效扩增：NTC(-)、NEG(-)、POS(+)；
无效扩增：NTC(-)、NEG(-)、POS(-)提示试剂失效；
无效扩增：NTC(-)、NEG(+)、POS(+)提示加样污染；
无效扩增：NTC(+)、NEG(+)、POS(+)提示体系污染。
只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。
在检测中三种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
CT值小于等于36的标本为阳性结果；
CT值大于38的标本为阴性结果；
CT值在36-38之间的标本需要重复，重复试验如CT值依然低于38判定为阳性扩增，超过38判定为阴性扩增。
本发明通过已报道的6条2019-nCoV全基因组核酸序列比对，发现了 3段2019-nCoV的N基因上保守且具有种间特异性的核酸序列(W1-W3)，设计并选取了4套相应的特异性RT-qPCR检测探针和引物(实施例中体系 1-4)，井进行体系优化和特异性验证。随后通过两两组合优化和筛选，最终建立了基于体系1和2组合(对应前述的第(1)、(2)特异性引物探针组合)的双靶位点RT-qPCR试剂盒，该试剂盒对2019-nCoV的检测灵敏度在10copies以内，对临床常见22种呼吸道病原体均无非特异扩增，显示出良好的特异度，可有效避免单靶点突变造成的假阴性结果，而造成对变异变动的漏检情况；双靶位点的检测可增强荧光检测信号，提高检测的灵敏度。
附图说明
图1A-图1D分别为采用1-4组引物探针组合形成的4套RT-qPCR 检测体系特异度检测图，结果显示除阳性模板外其余模板均无扩增，图 1A-图1D中横坐标自左至右标识的数值依次按等差数列递进排练，为2， 4，6，8……40，42，44。以下图2，图3的A图，图4横坐标排练均同此描述。
图2为双靶点RT-qPCR检测体系对相同浓度阳性模板检测结果比对图。
图3为双靶点RT-qPCR检测体系标准扩增曲线。A为标准曲线示意图，B为标准曲线对数图。
图4为位点突变对于双靶点RT-qPCR检测体系和单靶点体系比较结果图，A为模拟2019-nCoV核酸模板，B为模拟2019-nCoV突变株核酸模板。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 2019新型冠状病毒2019-nCoV基因序列比对与靶序列确定
依据最新公布的6条2019-nCoV全基因组，通过NCBI数据库进行核酸序列比对，找到了该病毒N基因中特异性核酸序列：W1(SEQ ID NO.1)，W2(SEQ ID NO.2)和W3(SEQ IDNO.3)。
实施例2针对靶序列的引物和探针的设计
针对实施例1确定的靶序列(SEQ ID NO.1-3)，发明人设计了多个引物与探针组合。并进一步从诸多引物探针组合中，选出检测效果较好的4组MGB探针与引物组合，分别见表1-表4。其中体系1用于检测靶序列W1，体系2用于检测靶序列W2，体系3和4分别用于检测靶序列W3。
表1体系1的引物探针序列
2019-nCoV-F1:TGGCAATGGCGGTGATG(SEQ ID NO.4)
2019-nCoV-R1:AGCTGGTTCAATCTGTCAAGCA(SEQ ID NO.5)
2019-nCoV-P1:TGCTCTTGCTTTGCTG(SEQ ID NO.6)
表2体系2的引物探针序列
2019-nCoV-F2:GAAGCCTCGGCAAAAACG(SEQ ID NO.7)
2019-nCoV-R2:GCCGAAAGCTTGTGTTACATTG(SEQ ID NO.8)
2019-nCoV-P2:ACTGCCACTAAAGCAT(SEQ ID NO.9)
表3体系3的引物探针序列
2019-nCoV-F3:CGGGAACGTGGTTGACCTA(SEQ ID NO.10)
2019-nCoV-R3:TCTTTGAAATTTGGATCTTTGTCATC(SEQ ID NO.11)
2019-nCoV-P3:CAG(C/G)TGCCATCAAA(SEQ ID NO.12)
表4体系4的引物探针序列
2019-nCoV-F4:AGTCACACCTTCGGGAACGT(SEQ ID NO.13)
2019-nCoV-R4:TCTTTGAAATTTGGATCTTTGTCATC(SEQ ID NO.14)
2019-nCoV-P4:TTGACCTACACAG(C/G)TGC(SEQ ID NO.15)
本实施例进一步对筛选的4种体系荧光定量PCR方法的退火温度进行了优化实验，从55℃-65℃改变，结果显示体系1的最优退火温度为58℃-61℃，体系2的最优退火温度为56℃-62℃，体系3的最优退火温度为58℃-60℃，体系4的最优退火温度为58℃-62℃。
每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)、NEG(阴性对照)和POS对照(阳性对照)，三种对照对于结果判读起决定性作用：有效扩增：NTC(-)、NEG(-)、POS(+)；
无效扩增：NTC(-)、NEG(-)、POS(-)提示试剂失效；
无效扩增：NTC(-)、NEG(+)、POS(+)提示加样污染；
无效扩增：NTC(+)、NEG(+)、POS(+)提示体系污染。
只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。
在检测中三种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
CT值小于等于36的标本为阳性结果；
CT值大于38的标本为阴性结果；
CT值在36-38之间的标本需要重复，重复试验如CT值依然低于38判定为阳性扩增，超过38判定为阴性扩增。
实施例3 4种荧光PCR检测体系对2019-nCoV的检测灵敏度、特异性验证
1.灵敏度评价
目前由于缺乏2019-nCoV毒株，灵敏度实验使用人工合成的 2019-nCoV序列体外反转录后的RNA序列作为阳性模板，其中SARS 合成片段：S1-S3，分别对应2019-nCoV的W1-W3，S1-S3的序列分别如SEQ ID NO.16-18所示；MERS合成片段：M1-M3，分别对应 2019-nCoV的W1-W3，M1-M3的序列分别如SEQ ID NO.19-21所示。将合成序列分别掺入12份正常人咽拭子中，4套RT-qPCR的检测结果均为阳性，灵敏度达100％(12/12)。
2.特异度评价
分别使用实施例2筛选并确定的4套RT-qPCR检测呼吸道常见菌株22种及人类染色体(见表5)，以2019-nCoV人工合成序列体外反转录后的RNA序列(对应W1-W3)作为阳性对照。结果除阳性对照外，其余病原体模板均为阴性(见图1A-图1D)。
表5用于检测2019-nCoV反转录荧光PCR体系特异性模板
Figure BDA0002372303230000081
Figure BDA0002372303230000091
3.体系检测限的评价
以2019-nCoV人工合成序列体外反转录后的RNA序列作为模板，分别进行4套RT-qPCR检测体系检测限评价。每个浓度梯度取5μl检测，按照优化的反应体系和反应条件进行real-time PCR，每个浓度梯度做3个平行样。体系1的检测限为10copies，体系2的检测限为10-100 copies，体系3的检测限为100copies，体系4的检测限为10-100copies。
实施例4 4RT-qPCR套体系组合优化和筛选
对上述4套RT-qPCR检测体系进行两两组合和优化，形成1+2，1+3， 1+4，2+3，2+4，3+4六种双靶点检测组合体系，其分别与最灵敏的单靶点体系1(10copies检测限)进行比对，筛选出最优化的双靶点体系为1+2体系，其检测限为10copies，相比单靶点中最灵敏的体系1，其荧光信号值更高，检测ct值更低，优于单靶点体系(见图2)。确定以体系1+2的双靶点RT-qPCR检测体系作为检测2019-nCoV的最佳方案。
实施例5双靶点RT-qPCR检测体系(体系1+2)及扩增条件
25微升的双靶点RT-qPCR检测体系的配置为：
Figure BDA0002372303230000101
扩增条件：50℃15min；95℃预变性3min；95℃变性30s，58-61℃退火30s，45个循环。
实施例6双靶点RT-qPCR检测体系标准曲线
以标准浓度模板的log值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，绘制实施例4确定的双靶点RT-qPCR检测体系的real-time PCR标准曲线。结果显示：阳性模板量在10-106copies这个范围内时，其的对数值与Ct 值具有非常好的相关性(R2＝1.000)，且扩增效率E＝93.4％(见图3)。
实施例7双靶点RT-qPCR检测体系特异性验证
采用实施例4确定的双靶位点RT-qPCR检测方法对呼吸道常见菌株22种及人类染色体(见表5)，以2019-nCoV人工合成序列体外反转录后的RNA序列作为阳性对照。结果除阳性对照外，其余病原体模板均为阴性，说明本发明确定的双靶点RT-qPCR检测方法特异性为100％。
实施例8模拟2019-nCoV单碱基突变对双靶点RT-qPCR检测体系及单靶点体系(体系1)检测结果的影响
依据实施例1确定的2019-nCoV的N基因中特异性序列片段W1，模拟病毒体外突变，设计一个体系探针位点上单碱基突变的变异序列片段W1'(序列中相对于W1序列的第34位的T碱基突变为G碱基)，将W1+W2序列混合模拟现有2019-nCoV核酸模板，将W1'+W2序列混合模拟2019-nCoV单碱基突变株核酸模板，分别进行双靶点RT-qPCR 检测体系(体系1+2)和单靶点体系(体系1)检测。使用103copies 的低载量阳性模板检测，双靶点RT-qPCR检测体系及单靶点体系对模拟2019-nCoV核酸模板(W1+W2序列混合)均能检测(图4的A)，仅双靶点RT-qPCR检测体系对模拟2019-nCoV核突变酸模板(W1'+W2 序列混合)可以检测(见图4的B)。
综合上述实施例，本发明提供的双靶点RT-qPCR检测体系(体系1+2) 检测2019-nCoV取得了特异性好、灵敏度优异、准确度高的检测效果：检测灵敏度在10copies以内，对临床常见22种呼吸道病原体均无非特异扩增，显示出良好的特异度，双靶点的确定、引物探针设计及进行同时检测待测样品，可有效避免病毒的单靶点突变造成的假阴性结果而导致漏检。满足了临床检测领域、食品卫生检验检疫领域对快速检测2019新型冠状病毒的要求，领域取得了优异的效果，应用前景良好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 西安博睿康宁生物医学中心有限公司
<120> 一种检测2019新型冠状病毒的双靶位点反转录荧光PCR引物、探针及试剂盒
<130> KHP201110350.3
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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actgccacta aagcat 16
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgggaacgtg gttgaccta 19
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tctttgaaat ttggatcttt gtcatc 26
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagstgccat caaa 14
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agtcacacct tcgggaacgt 20
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tctttgaaat ttggatcttt gtcatc 26
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttgacctaca cagstgc 17
<210> 16
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggctagcgg aggtggtgaa actgccctcg cgctattgct gctagacaga ttgaaccagc 60
ttgagagcaa a 71
<210> 17
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tctaaaaagc ctcgccaaaa acgtactgcc acaaaacagt acaacgtcac tcaagcattt 60
gggagacgtg gtccagaaca aac 83
<210> 18
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgcattggca tggaagtcac accttcggga acatggctga cttatcatgg agccattaaa 60
ttggatgaca aagatccaca attcaaagac aacgtcatac tgctgaa 107
<210> 19
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcggagcagt aggaggtgat ctactttacc ttgatcttct gaacagacta caagcccttg 60
agtctggcaa a 71
<210> 20
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aataagatgc gccacaagcg cacttccacc aaaagtttca acatggtgca agcttttggt 60
cttcgcggac caggaga 77
<210> 21
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgggctgtta aggatggcat cgtttgggtc catgaagatg gcgccactga tgctccttca 60
acttttggga cgcggaaccc taacaatgat tcagctattg ttacacaa 108

Claims (10)

1.用于检测2019新型冠状病毒的靶序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、和/或SEQ ID NO.2、和/或SEQ ID NO.3所示。
2.用于检测2019新型冠状病毒的靶序列组合，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1、和SEQ ID NO.2所示。
3.用于检测权利要求1所述靶序列或权利要求2所述靶序列组合的检测试剂在检测2019新型冠状病毒中的应用。
4.一种用于检测2019新型冠状病毒的特异性引物探针组合，其为以下任一个或多个特异性引物探针组合：
(1)引物序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示；或
(2)引物序列如SEQ ID NO.7-8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；或
(3)引物序列如SEQ ID NO.10-11所示，探针序列如SEQ ID NO.12所示；或
(4)引物序列如SEQ ID NO.13-14所示，探针序列如SEQ ID NO.15所示。
5.一种用于检测2019新型冠状病毒的特异性引物探针组合，其由两个特异性引物探针组合组成，(1)引物序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示；和(2)引物序列如SEQ ID NO.7-8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示。
6.含有权利要求4所述特异性引物探针组合的试剂盒。
7.一种检测2019新型冠状病毒的双靶位点反转录荧光检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求5所述的特异性引物探针组合。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，以待测样品基因组RNA为模板，同时利用第(1)、第(2)个特异性引物探针组合，进行双靶位点反转录荧光定量PCR，根据扩增曲线和荧光信号判定结果。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，反转录荧光定量PCR的25μl反应体系为：
Figure FDA0002372303220000021
和/或，所述反转录荧光定量PCR的反应程序为：50℃15min；95℃预变性3min；95℃变性30s，58-61℃退火30s，45个循环。
10.一种检测2019新型冠状病毒的双靶位点反转录荧光检测方法，其特征在于，以待测样品基因组RNA为模板，同时利用权利要求5所述的特异性引物探针组合，进行双靶位点反转录荧光定量PCR，根据扩增曲线和荧光信号判定结果。
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