CN109022619A - 一种用于检测人类疱疹病毒4型的试剂盒 - Google Patents
一种用于检测人类疱疹病毒4型的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测人类疱疹病毒4型的试剂盒，包括用于检测人类疱疹病毒4型的2条特异性引物和1条特异性探针，依据人基因组β珠蛋白特异性设计的2条引物和1条特异性探针，阴性质控品、阳性质控品和定量参考品A、B、C、D；其序列为SEQ ID No.1~6。本发明的优点在于检测方便快捷，能在较短的时间内定量检测人类疱疹病毒4型；灵敏度高，最低检出限为5 IU/ml，相当于100 Copies/mL；特异性好，本发明根据内重复序列BamHIW设计1对引物，与其他病原体无交叉干扰，具有较高的特异性；本发明溯源至世界卫生组织（WHO）标准单位IU/mL，定量结果具有可追溯性，对于人类疱疹病毒4型引物的相关疾病的临床诊断具有较高的参考价值，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其是涉及一种用于检测人类疱疹病毒4型的试剂盒。
背景技术
人类疱疹病毒4型，简称EB病毒，主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。该病毒感染不仅和儿童的传染性单核细胞增多症、家族性遗传病X连锁淋巴细胞增生综合症、EBV病毒相关淋巴组织细胞增生性噬血综合症和慢性活动性EBV感染有密切关系，还与全球约1%的肿瘤（胃癌、鼻咽癌、Burkitt肿瘤、Hodgkin肿瘤）发病有关，被世界卫生组织归类为第一类致癌物。目前人类疱疹病毒4型的检测主要是传统的酶联免疫吸附法、胶体金法和化学发光法，存在窗口期长、操作繁琐、假阳性和假阴性问题。PCR技术由于其灵敏度高、特异性好和操作简便，已经越来越广泛地应用于病毒检测，目前已有少部分公司将PCR技术应用于人类疱疹病毒4型检测，但由于各厂家定量单位均未溯源至世界卫生组织（WHO）标准单位IU/mL，且灵敏度很低（400 Copies/mL），导致临床病患漏检现象很多，各厂家定量结果无可比性、无溯源性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可溯源至世界卫生组织（WHO）标准单位IU/mL且操作简单，灵敏度高，特异性好的用于检测人类疱疹病毒4型的试剂盒。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的用于检测人类疱疹病毒4型的试剂盒，包括用于检测人类疱疹病毒4型的2条特异性引物和1条特异性探针，依据人基因组β珠蛋白特异性设计的2条引物和1条特异性探针，阴性质控品、阳性质控品和定量参考品A、B、C、D；其中
用于检测人类疱疹病毒4型的2条特异性引物为引物1和引物2，其序列为：
引物1：5’- CATGGGGCAATTGGGCATAC -3’（SEQ ID No.1），
引物2：5’- AAAGCCGTCGCATGTCTGAT -3’（SEQ ID No.2）；
依据人基因组β珠蛋白特异性设计的2条引物为引物3和引物4，其序列为：
引物3：5’- TGGAACATATTTGACGGCTTT -3’（SEQ ID No.3），
引物4：5’- GATCTTAGCTACTACTGCCAA -3’（SEQ ID No.4）；
用于检测人类疱疹病毒4型的特异性探针为探针1，其序列为：
探针1：FAM- CATGTTGTCACGTCACTCAGCTCC –BHQ1（SEQ ID No.5）；
依据人基因组β珠蛋白特异性设计的特异性探针为探针2，其序列号为：
探针2：ROX- AAACCCACTGCATCACTCT –BHQ2（SEQ ID No.6）。
所述阴性质控品为仅含人β珠蛋白基因的质粒。
所述阳性质控品为含人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒。
本发明试剂盒根据人类疱疹病毒4型内重复序列BamHIW的特异性设计2条特异性引物和1条特异性探针，依据人基因组β珠蛋白特异性设计2条引物和1条特异性探针，利用聚合酶链式反应技术，在50℃ 2min，94℃ 2min，（94℃ 5s， 55℃ 30s）40循环扩增条件下，使用实时荧光定量PCR仪进行荧光检测，依据标准品的Ct值、标准品溯源的浓度值与待测样本的Ct值对人类疱疹病毒4型进行定量检测，使用内部对照（β珠蛋白）、阴性质控品、强阳性质控品和弱阳性质控品对检测结果进行监控。
本发明试剂盒的检测方法如下：
（1）全血前处理：将红细胞裂解液与全血体积比3:1混合，12000r/min离心5min去上清取沉淀，用1ml生理盐水重悬；所用的红细胞裂解液包含0.1~0.2M NH4Cl，0.1~0.2mM EDTA和10~20mM NaHCO3。
（2）模板DNA的提取：提取待检样品DNA，所述待检样品是已前处理后的全血临床样本；
（3）阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品和标准品A~D：将-20℃保存的阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品和标准品A~D平衡至室温；
其中的阴性质控品为仅含人β珠蛋白基因质粒；
强阳性质控品为含人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒，其中人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒的浓度经溯源为4.0E+04 IU/ml（8.0E+05 Copies/ml）；
弱阳性质控品为含人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒，其中人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒的浓度经溯源为4.0E+02 IU/ml（8.0E+03 Copies/ml）；
标准品A为含人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒，其中人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒的浓度经溯源为2.0E+05 IU/ml（4.0E+06 Copies/ml）；
标准品B为含人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒，其中人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒的浓度经溯源为2.0E+04 IU/ml（4.0E+05 Copies/ml）；
标准品C为含人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒，其中人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒的浓度经溯源为2.0E+03 IU/ml（4.0E+04 Copies/ml）；
标准品D为含人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒，其中人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒的浓度经溯源为2.0E+02 IU/ml（4.0E+03 Copies/ml）；
（4）聚合酶链式反应：在100µl PCR管配制反应体系：PCR反应液1 10µl，PCR反应液2 10µl，模板DNA 20~50µl，将上述反应管于50℃ 2min，94℃ 2min，（94℃ 5s， 55℃ 30s）40循环扩增条件下反应；
其中PCR反应液1中含有上述的4条特异性引物（SEQ ID No.1~4）和2条特异性探针（SEQID No.5~6），其中，引物SEQ ID No 1~4的浓度为20~30 pmol/µl、探针SEQ ID No.5~6的浓度为10~15 pmol/µl，Taq聚合酶5~10U/ul， UNG酶0.1~0.5U/ul，20mM dNTP，10×PCR反应缓冲液；
PCR反应液2中含有20~30mM MgCl2和0.09%叠氮化钠；
（5）结果判断：阴性质控品应ROX显示Ct值≤40，FAM显示No Ct；强阳性质控品的浓度值应在1.42E+04~1.13E+05 IU/ml之间；强阳性质控品的浓度值应在1.42E+02~1.13E+03 IU/ml之间；以校准品A~D作标准曲线，其|R|应≥0.98。在以上条件下，待测样品的结果解释如下：
本发明的优点在于检测方便快捷，能在较短的时间内定量检测人类疱疹病毒4型；灵敏度高，最低检出限为5 IU/ml，相当于100 Copies/mL；特异性好，本发明根据内重复序列BamHIW设计1对引物，与其他病原体无交叉干扰，具有较高的特异性；本发明溯源至世界卫生组织（WHO）标准单位IU/mL，定量结果具有可追溯性，对于人类疱疹病毒4型引物的相关疾病的临床诊断具有较高的参考价值，适于推广应用。
附图说明
图1是本发明试剂盒对标准品A~D进行检测的扩增曲线图。
图2是本发明试剂盒对20份最低检出限样本进行检测的扩增曲线图。
图3是本发明试剂盒对20份最低定量限样本进行检测的扩增曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。
实施例1 制备检测人类疱疹病毒4型的试剂盒
本发明试剂盒的组成：
（1）红细胞裂解液： 基础液为H2O，200ul，其中包含0.2M NH4Cl，0.1mM EDTA和15mMNaHCO3；
（2） PCR反应液1：基础液为pH8.0 0.1M Tris-HCl,30ul，其中包括4pmol/µl引物1、4pmol/µl引物2、4pmol/µl引物3、4 pmol/µl引物4、1 pmol/µl探针1、1 pmol/µl探针2、10UTaq酶、0.1U UNG和10×PCR反应缓冲液，四条引物及两条探针的序列分别为：
引物1：5’- CATGGGGCAATTGGGCATAC -3’（SEQ ID No.1）；
引物2：5’- AAAGCCGTCGCATGTCTGAT -3’（SEQ ID No.2）；
引物3：5’- TGGAACATATTTGACGGCTTT -3’（SEQ ID No.3）；
引物4：5’- GATCTTAGCTACTACTGCCAA -3’（SEQ ID No.4）；
探针1：FAM- CATGTTGTCACGTCACTCAGCTCC –BHQ1（SEQ ID No.5）；
探针2：ROX- AAACCCACTGCATCACTCT –BHQ2（SEQ ID No.6）。
（3）反应液2：基础液为H2O，10ul，包含25mM MgCl2和0.09%叠氮化钠；
（4）阴性质控品：基础液为TE，600ul，包含人β珠蛋白基因质粒；
（5）强阳性质控品：基础液为TE，600ul，包含浓度经溯源为4.0E+04 IU/ml（8.0E+05Copies/ml）的人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒；
（6）弱阳性质控品：基础液为TE，600ul，包含浓度经溯源为4.0E+02 IU/ml（8.0E+03Copies/ml）的人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒；
（7）标准品A：基础液为TE，600ul，包含浓度经溯源为2.0E+05 IU/ml（4.0E+06 Copies/ml）的人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒；
（8）标准品B：基础液为TE，600ul，包含浓度经溯源为2.0E+04 IU/ml（4.0E+05 Copies/ml）的人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒；
（9）标准品C：基础液为TE，600ul，包含浓度经溯源为2.0E+03 IU/ml（4.0E+04 Copies/ml）的人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒；
（10）标准品D：基础液是TE，600ul，包含浓度经溯源为2.0E+02 IU/ml（4.0E+03Copies/ml）的人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒。
实施例2 人类疱疹病毒4型的定量检测
采用实施例1制备的试剂盒对人类疱疹病毒4型进行定量检测，待检样品为含有100copies/ml人类疱疹病毒4型的人全血样本，当然，也可以为其他可能含有人类疱疹病毒4型的样本类型。
具体操作步骤为：
1、全血前处理
1）将全血样本与红细胞裂解液以1:3的体积比混合；
2）上下颠倒混匀10次后，12000r/min离心5min；
3）去上清，用1ml的生理盐水重悬沉淀。
2、模板DNA提取：
使用商用提取试剂盒提取模板DNA，以备后续PCR反应使用。
1）添加10ul磁珠混悬液到前处理后的待检样本及强阳性质控品、弱阳性质控品、阴性质控品与校准品A~D中；所用磁珠混悬液的基础液为H2O，包含直径为0.5nm~1nm的超纯磁性氧化硅纳米磁珠；
2）添加1ml裂解液到待检样本中，室温裂解3min；裂解液的基础液为H2O，包含3~5M的异硫氰酸胍和0.5%的Tween-20；
3）使用磁板对待检样本靠磁30s，去上清液；
4）上述离心管中添加2ml洗液A，吹打混匀；洗液A的基础液为H2O，包含1~3M的高氯酸钠，0.1~0.5M 乙酸钾和25%的乙醇；
5）使用磁板对待检样本靠磁30s，去上清液；
6）上述离心管中添加2ml洗液B，吹打混匀；洗液B的基础液为H2O，包含70~85%的乙醇；
7）使用磁板对待检样本靠磁30s，去上清液；
8）上述离心管中添加0.2ml洗脱液，吹打混匀；洗脱液为pH8.0 TE；
9）70℃解离后靠磁取出上清液备用。
3、聚合酶链式反应：在100µl PCR管配制反应体系：PCR反应液1 10µl，PCR反应液210µl，模板DNA 20~50µl，将上述反应管于50℃ 2min，94℃ 2min，（94℃ 5s， 55℃ 30s）40循环扩增条件下反应。
4、结果判断：阴性质控品应ROX显示Ct值≤40，FAM显示No Ct；强阳性质控品的浓度值应在1.42E+04~1.13E+05 IU/ml之间；强阳性质控品的浓度值应在1.42E+02~1.13E+03IU/ml之间；以校准品A~D作标准曲线，如图1所示，其|R|应≥0.98（图1中|R|=0.994）。在以上条件下，待测样品的结果解释如下：
实施例3 本发明试剂盒的性能检测实验
1、最低检出限实验
依照实施例2的方法对20份最低检出限样本进行检测，得到的扩增曲线如图2所示，具体数据如下表1所示。
表1
从图2及表1中可以看出，本发明试剂盒对20例5IU/mL的阳性临床样本进行检测，其结果均为阳性，证明本发明试剂盒的检测限可以达到5IU/mL。
2、定量限检测实验
依照实施例2的方法对20份定量限样本进行检测，得到的扩增曲线如图3所示，具体数据如下表2所示。
表2
从图3及表2中可以看出，本发明试剂盒对20例10IU/mL的阳性临床样本进行检测，定量结果均在±0. 5Log值范围内，证明本发明的试剂盒的定量限可达到10IU/mL。
序列表
<110> 郑州安图生物工程股份有限公司
<120> 用于检测人类疱疹病毒4型的试剂盒
<141> 2018-08-08
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
CATGGGGCAATTGGGCATAC 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
AAAGCCGTCGCATGTCTGAT 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
TGGAACATATTTGACGGCTTT 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
GATCTTAGCTACTACTGCCAA 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
CATGTTGTCACGTCACTCAGCTCC 24
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
AAACCCACTGCATCACTCT 19
Claims (3)
1.一种用于检测人类疱疹病毒4型的试剂盒，其特征在于：包括用于检测人类疱疹病毒4型的2条特异性引物和1条特异性探针，依据人基因组β珠蛋白特异性设计的2条引物和1条特异性探针，阴性质控品、阳性质控品和定量参考品A、B、C、D；其中
用于检测人类疱疹病毒4型的2条特异性引物为引物1和引物2，其序列为：
引物1：5’- CATGGGGCAATTGGGCATAC -3’，
引物2：5’- AAAGCCGTCGCATGTCTGAT -3’；
依据人基因组β珠蛋白特异性设计的2条引物为引物3和引物4，其序列为：
引物3：5’- TGGAACATATTTGACGGCTTT -3’，
引物4：5’- GATCTTAGCTACTACTGCCAA -3’；
用于检测人类疱疹病毒4型的特异性探针为探针1，其序列为：
探针1：FAM- CATGTTGTCACGTCACTCAGCTCC –BHQ1；
依据人基因组β珠蛋白特异性设计的特异性探针为探针2，其序列号为：
探针2：ROX- AAACCCACTGCATCACTCT –BHQ2。
2.根据权利要求1所述的用于检测人类疱疹病毒4型的试剂盒，其特征在于：所述阴性质控品为仅含人β珠蛋白基因的质粒。
3.根据权利要求1所述的用于检测人类疱疹病毒4型的试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品为含人类疱疹病毒4型DNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181218 |
|
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