CN103898239A - 一种同管检测htlv-i和htlv-ii前病毒的引物和方法 - Google Patents

一种同管检测htlv-i和htlv-ii前病毒的引物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测人类T淋巴细胞白血病病毒I型和II型前病毒的引物和方法，包括检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针和检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针，并在同一PCR管中按合理的浓度比加入上述两种引物及探针，并通过已优化的Real-timePCR反应条件对样本进行检测。本检测方法在血清学变化之前即可检测是否有HTLV感染，大幅度缩短了窗口期，同时相对于常规的血清学检测方法具有检测周期短，特异性高，准确度高，灵敏度高，条件依赖少，污染风险低等优点。检测结果有助于监测患者HTLV前病毒载量的变化及限制HTLV病毒的传播。

Description

一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物和方法
技术领域
本发明属于医学检验领域，具体涉及一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物和方法。
背景技术
人类T淋巴细胞白血病病毒（Human T-cell lymphotropic virus, HTLV）是1980年美国人Gallo首先从皮肤型T细胞淋巴瘤患者体内发现的第一种人类逆转录病毒，按基因组学及血清学反应可分为1型（HTLV-I）和2型（HTLV-II）。该病毒为球型颗粒，内部由RNA核蛋白及围绕在外的20面体蛋白衣壳组成，最外层具有包膜结构，表面镶嵌有糖蛋白。目前全世界大约1000到2000万人感染HTLV病毒，而在我国的北京、广西、江西、新疆、柳州、合肥和四川等10多个省市已发现了HTLV感染病例，同时某些沿海地区也出现了局部小规模流行。
    HTLV感染细胞主要通过细胞间感染的方式，游离病毒颗粒是没有感染能力的。HTLV感染细胞与未感染细胞建立突触，进而使病毒蛋白和RNA染色体组进入靶细胞。通过逆转录酶使病毒RNA逆转录为cDNA，同时这种前病毒DNA被整合到宿主细胞，最终引起成人T细胞白血病、热带痉挛性瘫痪及其他相关神经疾病的产生。
HTLV病毒的传播途径主要有输血传播、母乳传播及性传播三种，而迄今有效的治疗药物和预防性疫苗尚未研制成功。因此，唯一积极的控制办法就是及时发现HTLV感染者，并采取措施切断其传播途径。
目前较为常用的检测方法是采用ELISA法检测HTLV抗体，其它还有间接免疫荧光法、蛋白印迹试验及重组免疫印记等。但研究显示并非所有的HTLV感染者都会产生抗体，且血液标本中尚存在单细胞感染，因此血清学检测存在一些假阳性和假阴性问题，特异性较差，无法很好地解决上述问题。本检测方法在血清学变化之前即可检测是否有HTLV感染，大幅度缩短了窗口期，同时相对于常规的血清学检测方法具有检测周期短，特异性高，准确度高，灵敏度高，条件依赖少，污染风险低等优点。检测结果将有助于临床筛选，监测患者HTLV前病毒载量的变化及限制HTLV病毒的传播。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物，包括检测HTLV-I前病毒的特异性引物（SEQ NO1和SEQ NO2）及探针（SEQ NO3）和检测HTLV-II前病毒的特异性引物（SEQ NO4和SEQ NO5）及探针（SEQ NO6），其中：
(i)     检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针：
SEQ NO1：CCCATTGGCTCCTGTGAAAG；
SEQ NO2：TTGAGACAGCGCCACGAAC；
SEQ NO3：JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(ii)    检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针：
SEQ NO4：TTGCCATACCTGTCAAACCATC；
SEQ NO5：CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC；
SEQ NO6：FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA。
进一步地，在检测HTLV-I和HTLV-II前病毒时，所述的引物同时被使用，并被放置在同一个反应管中。
进一步地，在总反应体积为25ul时，引物和探针的使用量为：引物SEQ NO1、SEQ NO 2、SEQ NO4、SEQ NO 5各0.6ul、探针SEQ NO3和SEQ NO 6各0.3 ul。
进一步地，所述的引物参与的反应程序为95℃ 5min预变性；95℃ 15s，59℃ 35s循环40次。
本发明还提供一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的方法，包括：
(1)提取样本中的DNA；
(2)以步骤(1)中的DNA作为模板，在同一PCR管同时加入检测HTLV-I前病毒的引物及探针和检测HTLV-II前病毒的引物及探针，并通过Real-time PCR反应对样本进行检测，其中：
(i)   检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针：
SEQ NO1：CCCATTGGCTCCTGTGAAAG；
SEQ NO2：TTGAGACAGCGCCACGAAC；
SEQ NO3：JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(ii)  检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针：
SEQ NO4：TTGCCATACCTGTCAAACCATC；
SEQ NO5：CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC；
SEQ NO6：FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA；
(3) 根据结果来分析样本是否感染HTLV病毒。
进一步地，Real-time PCR的反应体系为25ul，包括2*qPCR MIX 12.5ul、引物SEQ NO1、SEQ NO 2、SEQ NO4、SEQ NO 5各0.6ul、探针SEQ NO3和SEQ NO 6各0.3 ul、灭菌水7.5ul、DNA模板2 ul。
进一步地，Real-time PCR反应程序为：95℃ 5min预变性；95℃ 15s，59℃ 35s循环40次。
进一步地，对检测结果分析包括：若样本产生一条扩增曲线，且CT值≤38，则样本为HTLV阳性，且根据相对应的探针，可判断样本所感染的HTLV基因型；若样本未产生扩增曲线，则判定样本为阴性。
有益效果：目前较为常用的检测方法有是ELISA法、间接免疫荧光法、蛋白印迹试验及重组免疫印记等。但并非所有的HTLV感染者都会产生抗体，且血液标本中尚存在单细胞感染，因此血清学检测存在一些假阳性和假阴性问题，特异性较差，无法很好地解决上述问题，而检测HTLV的核酸检测方法主要是常规的PCR法，但操作繁琐且容易出现假阳性。本发明的同管检测方法采用Real-time PCR，在血清学变化之前即可检测是否有HTLV感染，大幅度缩短了窗口期，同时相对于常规的血清学检测和PCR法具有检测周期短，特异性高，准确度高，灵敏度高，条件依赖少，污染风险低等优点。检测结果将有助于临床筛选，监测患者HTLV前病毒载量的变化及限制HTLV病毒的传播。
附图说明
图1是同管real-time PCR检测体系扩增产生的两种标准曲线（质粒梯度为10、102、103、104、105、106copies/ul），其中HTLV-I标准曲线Slope为-3.41，R2为0.996；HTLV-II标准曲线Slope为-3.35，R2为0.995。根据Slope及R2值说明本发明的同管Real-time体系扩增效果理想，最低下限均可达10 copies/ul。
图2是同管real-time PCR检测体系扩增两种10 copies/ul质粒的结果。
图3是样本A的同管Real-time PCR检测结果。由于只产生一条扩增曲线，且对应探针SEQ NO3，CT值＜38。因此A样本为HTLV-I型。
图4是样本B的同管Real-time PCR检测结果。由于只产生一条扩增曲线，且对应探针SEQ NO6，CT值＜38。因此B样本为HTLV-II型。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1 一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物和试剂盒
用于检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物，包括检测HTLV-I前病毒的特异性引物（SEQ NO1和SEQ NO2）及探针（SEQ NO3）和检测HTLV-II前病毒的特异性引物（SEQ NO4和SEQ NO5）及探针（SEQ NO6），其中：
(i)        检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针：
SEQ NO1：CCCATTGGCTCCTGTGAAAG；
SEQ NO2：TTGAGACAGCGCCACGAAC；
SEQ NO3：JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(ii)      检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针：
SEQ NO4：TTGCCATACCTGTCAAACCATC；
SEQ NO5：CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC；
SEQ NO6：FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA。
在同一PCR管中加入上述两种引物及探针，并通过Real-time PCR反应条件对样本进行检测。
用于检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的试剂盒，包括DNA提取试剂、PCR扩增体系，所述PCR扩增体系包括用于检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物，包括检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针和检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针，其中：
(i)   检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针：
SEQ NO1：CCCATTGGCTCCTGTGAAAG；
SEQ NO2：TTGAGACAGCGCCACGAAC；
SEQ NO3：JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(ii)  检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针：
SEQ NO4：TTGCCATACCTGTCAAACCATC；
SEQ NO5：CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC；
SEQ NO6：FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA
实施例2 一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的方法
一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的方法包括：
(1)提取样本中的DNA；
(2)以步骤(1)中的DNA作为模板，在同一PCR管中按合理的浓度比同时加入检测HTLV-I前病毒的引物及探针和检测HTLV-II前病毒的引物及探针，并通过Real-time PCR反应对样本进行检测，其中：
(i)  检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针：
SEQ NO1：CCCATTGGCTCCTGTGAAAG；
SEQ NO2：TTGAGACAGCGCCACGAAC；
SEQ NO3：JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(ii) 检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针：
SEQ NO4：TTGCCATACCTGTCAAACCATC；
SEQ NO5：CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC；
SEQ NO6：FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA。
(3) 根据Real-time PCR结果来分析样本是否感染HTLV病毒。
采用常规的酚-氯仿提取样本血液DNA。
PCR扩增方法如下：
一例样本的总Real-time PCR体系为25ul：包括2*qPCR MIX 12.5ul、引物SEQ NO1、SEQ NO 2、SEQ NO4、SEQ NO 5各0.6ul、探针SEQ NO3和SEQ NO 6各0.3 ul、灭菌水7.5ul、DNA模板2 ul。
Real-time PCR反应程序：95℃ 5min预变性；95℃ 15s，59℃ 35s循环40次。
对样本检测结果分析：若样本产生一条扩增曲线，且CT值≤38，则样本为HTLV阳性，且根据相对应的探针，可判断样本所感染的HTLV基因型；若样本未产生扩增曲线，则判定样本为阴性。
使用该检测方法中的引物及探针（SEQ NO1、SEQ NO2、SEQ NO3、SEQ NO 4、SEQ NO5、SEQ NO6）进行样本检测，发现其相比于现有技术具有检测周期短，特异性高，准确度高，重复性好，条件依赖少，污染风险低等优点。同时也可检测出10 copies/ul HTLV-I及HTLV-II，说明本方法具有较好的灵敏度。
实施例3：灵敏度测定
分别将重组的HTLV-I质粒和HTLV-II质粒梯度稀释（质粒梯度为10、102、103、104、105、106copies/ul）作为模板，依照本发明所述方法进行Real-time PCR反应。图1是同管real-time PCR检测体系扩增产生的两种标准曲线（质粒梯度为10、102、103、104、105、106copies/ul），其中HTLV-I标准曲线Slope为-3.41，R2为0.996；HTLV-II标准曲线Slope为-3.35，R2为0.995。根据Slope及R2值说明本发明的同管Real-time体系扩增效果理想，最低下限均可达10 copies/ul。
图2是同管real-time PCR检测体系扩增两种10copies/ulHTLV-I质粒和HTLV-II质粒的结果。
实施例4：临床样本检测
取2份临床标本A和B，经本发明所述方法完成Real-time PCR检测，检测结果如图3和4所示。
图3是样本A的同管Real-time PCR检测结果。由于只产生一条扩增曲线，且对应探针SEQ NO3，CT值＜38。因此A样本为HTLV-I型。
图4是样本B的同管Real-time PCR检测结果。由于只产生一条扩增曲线，且对应探针SEQ NO6，CT值＜38。因此B样本为HTLV-II型。
利用本发明所述方法检测临床样本A和B的结果与ELISA试剂盒比较，两种方法的结果完全一样。
  SEQUENCE LISTING
 
<110>  上海艾迪康医学检验所有限公司
 
<120>  一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物和方法
 
<130> 
 
<160>  6    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
cccattggct cctgtgaaag                                                 20
 
 
<210>  2
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
ttgagacagc gccacgaac                                                  19
 
 
<210>  3
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
tctcggactt ttgcatggcc tctcc                                           25
 
 
<210>  4
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
ttgccatacc tgtcaaacca tc                                              22
 
 
<210>  5
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
ctgaagaacg gcgctgatag tc                                              22
 
 
<210>  6
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
cttctccggt gcggtttccg tct                                             23
 
 

Claims (8)

1.一种用于检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物，包括检测HTLV-I前病毒的特异性引物（SEQ NO1和SEQ NO2）及探针（SEQ NO3）和检测HTLV-II前病毒的特异性引物（SEQ NO4和SEQ NO5）及探针（SEQ NO6），其中：
(i)    检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针：
SEQ NO1：CCCATTGGCTCCTGTGAAAG；
SEQ NO2：TTGAGACAGCGCCACGAAC；
SEQ NO3：JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(ii)   检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针：
SEQ NO4：TTGCCATACCTGTCAAACCATC；
SEQ NO5：CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC；
SEQ NO6：FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，在检测HTLV-I和HTLV-II前病毒时，所述的引物同时被使用，并被放置在同一个反应管中。
3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，在总反应体积为25ul时，引物和探针的使用量为：引物SEQ NO1、SEQ NO 2、SEQ NO4、SEQ NO 5各0.6ul、探针SEQ NO3和SEQ NO 6各0.3 ul。
4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述的引物参与的反应程序为95℃ 5min预变性；95℃ 15s，59℃ 35s循环40次。
5.一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的方法，其特征在于包括：
(1)提取样本中的DNA；
(2)以步骤(1)中的DNA作为模板，在同一PCR管同时加入检测HTLV-I前病毒的引物及探针和检测HTLV-II前病毒的引物及探针，并通过Real-time PCR反应对样本进行检测，其中：
(i) 检测HTLV-I前病毒的特异性引物及探针：
SEQ NO1：CCCATTGGCTCCTGTGAAAG；
SEQ NO2：TTGAGACAGCGCCACGAAC；
SEQ NO3：JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(ii) 检测HTLV-II前病毒的特异性引物及探针：
SEQ NO4：TTGCCATACCTGTCAAACCATC；
SEQ NO5：CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC；
SEQ NO6：FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA；
(3) 根据结果来分析样本是否感染HTLV病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，Real-time PCR的反应体系为25ul，包括2*qPCR MIX 12.5ul、引物SEQ NO1、SEQ NO 2、SEQ NO4、SEQ NO 5各0.6ul、探针SEQ NO3和SEQ NO 6各0.3 ul、灭菌水7.5ul、DNA模板2 ul。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，Real-time PCR反应程序为：95℃ 5min预变性；95℃ 15s，59℃ 35s循环40次。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对检测结果分析包括：若样本产生一条扩增曲线，且CT值≤38，则样本为HTLV阳性，且根据相对应的探针，可判断样本所感染的HTLV基因型；若样本未产生扩增曲线，则判定样本为阴性。
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