CN108220478B - 可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品，包括阳性质控品和阴性质控品；所述阳性质控品的溶质包括灭活的HCV病毒和保存剂；所述阴性质控品的溶质包括灭活的非HCV病毒和保存剂，或者包括保存剂；所述保存剂包含金精三甲酸铵盐、防腐剂、苯丁抑制素盐酸盐。本发明通过向质控品中加入含有金精三甲酸铵盐、防腐剂、苯丁抑制素盐酸盐的保存剂，并进一步控制金精三甲酸铵盐、防腐剂、苯丁抑制素盐酸加入后在质控品中的浓度分别为100‑500μM、80‑180mM、20‑60nM，抑制了质控品病毒颗粒的降解，使其更稳定，更易保存，延长了有效期。

Description

可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品
技术领域
本发明涉及病毒检测试剂盒质控技术领域，特别是涉及可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品。
背景技术
丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)引起、主要经血液传播的肝脏急、慢性炎症的传染性疾病。HCV是一种RNA病毒，其核酸是单股、线性、正链RNA。由于HCV RNA复制所依赖的聚合酶缺乏校正功能，HCV基因组呈现高度异质性。根据Simmonds建议，利用核酸测序和进化树分析，确定了目前国际通用的HCV基因型命名系统，以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写的英文字母表示基因的亚型(如1a、2b、3c等)，HCV有6种主要的基因型和更多的亚型共11型。基因型1(亚型1a和1b)在全球分布最广，占所有HCV感染的70％以上，欧美国家以1型为主(欧洲为1b，美国以1a为多)，基因2型在欧洲和亚洲均有广泛分布，3型主要分布在印度、巴基斯坦、泰国和新加坡等国家，4a型主要分布在中东、埃及和中非地区。基因型5、6较少见。6a型仅在越南、马来西亚等东南亚国家发现。同HCV基因型感染者的临床表现、肝病严重程度及慢性化病程进展均有差异，抗病毒治疗的效果也不同。因此HCV基因分型与病程发展和治疗应答有一定相关性，例行检测有助于对特定的感染做出判断和有效的临床干预。
1989年Choo等应用分子克隆技术获得HCV全基因克隆。HCV为单股正链RNA病毒，属于黄病毒科中一个独立种属。基因组全长约9.6Kbp，5’和3’为非编码区(UTR)，长3l9～341bp和27～55bp，含有几个顺向和反向重复序列，可能与基因复制有关。在5非编码区下游紧接一开放阅读框(ORF)，其基因组排列顺序为5-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3，编码长达30l4个氨基酸的多聚蛋白前体，经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成各自独立病毒蛋白。c蛋白(核心蛋白)、E蛋白(包膜蛋白)为结构蛋白；NS2～NS5为非结构蛋白，NS3蛋白具有解螺旋酶活性。参与HCV-RNA分子解螺旋，以协助RNA复制，NS5具有依赖于RNA的聚合酶活性，参与HCV基因组复制。NS5B蛋白为RNA依赖的RNA多聚酶，由于其缺乏校读功能，使HCV-RNA呈高度异质性，同时也给研制有效的HCV疫苗造成极大的困难。根据HCV基因组核苷酸序列的差异程度可将HCV分为基因型(30％～35％)、基因亚型(20％～25％)、分离株(5％～9％)和准种(1％～5％)。
在对HCV进行分型检测时，一般有三个步骤：步骤一：提取HCV RNA，主要为病毒外膜及衣壳的破碎，病毒核酸的释放；步骤二：HCV RNA进行RT-PCR；步骤三：将RT-PCR产物进行杂交显色。而现有的阳性对照，主要包含下述几种来源：确诊为丙型肝炎患者或被感染动物的阳性血清；体内或体外转录RNA；质粒或化学合成。所有阳性对照中，最准确可靠的应该是含HCV病毒的天然样本(如患者或被感染动物的血液、细胞培养液)，可充分保证其作为前述三个步骤的阳性对照，但其最大缺陷在于难以长期保存和运输。体内或体外转录的HCVRNA，可以作为逆转录的阳性对照。但是，由于其不具备病毒外壳，所以不适合作为提取病毒RNA步骤中的阳性对照，且易被环境中普遍存在的RNase降解，不易保存。用质粒作为阳性对照，其优点是制备容易，但由于质粒是DNA，不是RNA，因此它只能作为PCR扩增步骤的阳性对照，而无法作为RNA提取和逆转录的对照。至于化学合成法，成本非常高，没有核衣壳的保护而容易降解，因此不适用于大规模生产。
目前市场上大多数临床检测缺乏稳定可靠的质控品，因此开发一种可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品是非常必要的。
发明内容
基于此，有必要提供一种可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品。
一种可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品，包括阳性质控品和阴性质控品；
所述阳性质控品的溶质包含有灭活的HCV病毒和保存剂；
所述阴性质控品的溶质包含有灭活的非HCV病毒和保存剂，或者包含有保存剂；
所述保存剂包含金精三甲酸铵盐、防腐剂、苯丁抑制素盐酸盐；
所述防腐剂选自甘氨酸、ε-聚赖氨酸或半胱氨酸。
在其中一个实施例中，所述金精三甲酸铵盐在所述质控品中的浓度为100-500μM，所述防腐剂为甘氨酸，所述甘氨酸在所述质控品中的浓度为80-180mM，所述苯丁抑制素盐酸盐在所述质控品中的浓度为20-60nM。
在其中一个实施例中，所述金精三甲酸铵盐在所述质控品中的浓度为200-400μM，所述甘氨酸在所述质控品中的浓度为80-120mM，所述苯丁抑制素盐酸盐在所述质控品中的浓度为30-50nM。
在其中一个实施例中，所述金精三甲酸铵盐在所述质控品中的浓度为250μM，所述甘氨酸在所述质控品中的浓度为100mM，所述苯丁抑制素盐酸盐在所述质控品中的浓度为40nM。
在其中一个实施例中，HCV病毒选自HCV1a型、HCV1b型、HCV 2a型、HCV3型、HCV 4型、HCV 6型中的至少一种。
在其中一个实施例中，HCV病毒选自HCV1a型、HCV1b型和HCV 2a型。上述阳性质控品，是发明人在工作中通过大量样本分析筛选后得出，以上述类型的病毒亚型作为阳性质控品，能够覆盖大部分的中国人群的丙肝类型，既有较好的参考效果，又能够降低成本。
在其中一个实施例中，所述阳性质控品中灭活的HCV病毒的浓度为5-25μg/m l。
在其中一个实施例中，所述阳性质控品的溶剂为健康人的血浆；所述阴性质控品的溶剂为健康人的血浆。
上述质控品的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒。
上述质控品在丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的质量鉴定中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过向质控品中加入含有金精三甲酸铵盐、防腐剂、苯丁抑制素盐酸盐的保存剂，并进一步控制金精三甲酸铵盐、防腐剂、苯丁抑制素盐酸加入后在质控品中的浓度分别为100-500μM、80-180mM、20-60nM，有效抑制了质控品病毒颗粒的降解，使其更稳定，更易保存，延长了有效期。
附图说明
图1为核糖核酸酶攻击实验中三组Ct值变化图；
图2为短期贮存稳定性实验中A1组、B1组Ct值变化图；
图3为短期贮存稳定性实验中A1组、A2组Ct值变化图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品作进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratory Press,1989)中所述的5条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1、制备可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品
1、本实施例提供可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品，包括阳性质控品和阴性质控品；
(1)阳性质控品：溶质为灭活的HCV病毒、保存剂，溶剂为健康人血浆；具体包括含灭活的HCV 1a型病毒的阳性质控品、含灭活的HCV 1b型病毒的阳性质控品、含灭活的HCV2a型病毒的阳性质控品；
(2)阴性质控品：不含任何灭活的病毒，溶质为保存剂，溶剂为健康人血浆；
其中，本实施例阳性质控品、阴性质控品中均包含有250μM金精三甲酸铵盐、100mM甘氨酸、40nM苯丁抑制素盐酸盐。
2、可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品的制备步骤包括：
(1)阳性质控品的制备：
取10株临床分离培养的HCV病毒(基因型为1a型)，测定其病毒滴度；
将所得HCV病毒置于60℃下10小时进行灭活处理，得灭活的HCV病毒；
用临床健康人群血浆加入所述灭活的HCV病毒，得浓度为15μg/ml的混合物；
向所述混合物加入金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐使三者在质控品中的最终浓度分别为250μM、100mM、40nM，即可。
含灭活的HCV 1b型病毒的阳性质控品的制备方法、含灭活的HCV 2a型病毒的阳性质控品的制备方法，与含灭活的HCV 1a型病毒的阳性质控品制备方法相同。
(2)阴性质控品的制备：
取临床健康人群血浆，加入金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐使三者在质控品中的最终浓度分别为250μM、100mM、40nM，即可。
实施例2、可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品
本实施例是实施例1的变化例，变化之处仅在于保护剂的浓度，本实施例的质控品中金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐的最终浓度分别为100μm、80mM、20nM。
实施例3、可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品
本实施例是实施例1的变化例，变化之处仅在于保护剂的浓度，本实施例的质控品中金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐的最终浓度分别为500μm、180mM、60nM。
实施例4、可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品
本对比例是实施例1的变化例，变化之处仅在于，质控品加入的保存剂组成为金精三甲酸铵盐、半胱氨酸、苯丁抑制素盐酸盐。
实施例5、可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品
本对比例是实施例1的变化例，变化之处仅在于，质控品加入的保存剂组成为金精三甲酸铵盐、ε-聚赖氨酸、苯丁抑制素盐酸盐。
对比例1
本对比例是实施例1的对比例，对比之处仅在于，质控品中金精三甲酸铵盐的终浓度为550μM、甘氨酸的终浓度为200mM、苯丁抑制素盐酸盐的终浓度为70nM。
对比例2
本对比例是实施例1的对比例，对比之处仅在于，质控品中的甘氨酸的终浓度为100mM、苯丁抑制素盐酸盐的终浓度为40nM。
性能测试
(一)为了对本发明质控品的稳定性能进行验证，本实施例进行了核糖核酸酶攻击实验、贮存稳定性实验。
1、核糖核酸酶攻击实验(选用含灭活的HCV 1a型病毒的阳性质控品)
(1)A组：
取实施例1的阳性质控品，直接采用常规RNA提取试剂盒提取阳性质控品中的灭活病毒RNA，然后于常规条件下进行反转录和荧光定量PCR扩增。
(2)B组：
取实施例1的阳性质控品，加入核糖核酸酶使其终浓度为1mg/L，室温放置60分钟；然后再采用常规RNA提取试剂盒提取阳性质控品中的灭活病毒RNA，最后于常规条件下进行反转录和荧光定量PCR扩增。
(3)C组：
本组采用的质控品为对照阳性质控品，其与实施例1质控品的区别仅在于没有加入保存剂，即不含金精三甲酸铵、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐。
取对照阳性质控品，加入核糖核酸酶使其终浓度为1mg/L，室温放置60分钟；然后再采用常规RNA提取试剂盒提取该对照阳性质控品中的灭活病毒RNA，最后于常规条件下进行反转录和荧光定量PCR扩增。
比较三组Ct值，结果如图1显示，A、B两组检测结果基本一致，其Ct值的变化趋势几乎没有区别；而C组的Ct值明显出现变化，说明未加保存剂的质控品无法很好地抵抗核糖核酸酶的降解。
2、短期贮存稳定性实验(选用含灭活的HCV 1a型病毒的阳性质控品)
A1组：取实施例1阳性质控品，存放在37℃，存放时间为2周；
A2组：取实施例1阳性质控品，存放在-80℃，存放时间为2周；
B1组：取对照阳性质控品(同核糖核酸酶攻击实验C组)，存放在37℃，存放时间为2周。
比较A1组、B1组：分别取A1组、B1组的质控品，采用常规RNA提取试剂盒提取阳性质控品中的灭活病毒RNA，然后于常规条件下进行反转录和荧光定量PCR扩增。比较两组Ct值，分析质控品是否有降解。结果如图2所示，B1组的Ct值出现明显变化，说明未加保存剂的质控品稳定性差，易降解。
比较A1组、A2组：分别取A1组、A2组的质控品，采用常规RNA提取试剂盒提取阳性质控品中的灭活病毒RNA，然后于常规条件下进行反转录和荧光定量PCR扩增。比较两组Ct值，分析质控品是否有降解。如图3所示，两组Ct值的趋势并无显著差别，说明加入的保存剂具有维持质控品的稳定，防止质控品降解，延长质控品的有效使用期的作用。
对实施例2、实施例3获得的质控品做上述核糖核酸酶攻击实验、短期稳定性实验，也获得相似的结果。
3、长期贮存稳定性实验(选用含灭活的HCV 1a型病毒的阳性质控品)
分别取实施例1、实施例4、实施例5、对比例1、对比例2的质控品，存放于室温下，定期抽样检测：取抽样质控品，对采用常规RNA提取试剂盒提取阳性质控品中的灭活病毒RNA，然后于常规条件下进行反转录和荧光定量PCR扩增，分析质控品中灭活病毒颗粒是否有降解。根据存放日期至检测到样品降解的日期获得贮存期限。
Figure BDA0001530970310000091
经过多次长期试验证明，实施例1的贮存期限最长，具备长期稳定的特性。
(二)准确性和重复性
1、按照丙型肝炎病毒检测试剂盒检测实施例1中的质控品。对整套质控品进行测序分析，结果显示，阳性质控品检测结果全部为阳性；阴性质控品检测结果全部为阴性。
2、按照丙型肝炎病毒检测试剂盒检测随机抽取的3套实施例1质控品。结果显示，三套质控品的检测结果相同，说明三套成套质控品之间的检测结果无差异，且检测结果完全正确。由于检测的三套成套质控品是随机抽取的，根据检测结果可推知其他成套质控品之间的检测结果也是一致的。
综上所述，本发明通过向质控品中加入金精三甲酸铵盐、防腐剂、苯丁抑制素盐酸盐，并进一步控制金精三甲酸铵盐、防腐剂、苯丁抑制素盐酸加入后在质控品中的浓度分别为100-500μM、80-180mM、20-60nM，抑制了质控品病毒颗粒的降解，使其更稳定，更易保存，延长了有效期。另外，本发明的质控品为一种灭活病毒与健康人血浆的混合溶液，与临床丙肝患者的外周血浆的接近程度高，具有稳定、易保存、简捷、使用成本低等优点。解决了检测试剂盒质量、性能评价的问题，提高HCV分型检测的准确性和可靠性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品，其特征在于，包括阳性质控品和阴性质控品；
所述阳性质控品包含有灭活的HCV病毒和保存剂；
所述阴性质控品包含有保存剂；
所述保存剂由金精三甲酸铵盐、防腐剂和苯丁抑制素盐酸盐组成；
所述防腐剂为甘氨酸；
所述金精三甲酸铵盐在所述质控品中的浓度为200-400μM，所述甘氨酸在所述质控品中的浓度为80-120mM，所述苯丁抑制素盐酸盐在所述质控品中的浓度为30-50nM。
2.根据权利要求1所述的可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品，其特征在于，所述阴性质控品还包含有灭活的非HCV病毒。
3.根据权利要求1所述的可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品，其特征在于，所述金精三甲酸铵盐在所述质控品中的浓度为250μM，所述甘氨酸在所述质控品中的浓度为100mM，所述苯丁抑制素盐酸盐在所述质控品中的浓度为40nM。
4.根据权利要求1至3任一项所述的可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品，其特征在于，HCV病毒选自HCV1a型、HCV1b型、HCV 2a型、HCV 3型、HCV 4型、HCV 6型中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品，其特征在于，HCV病毒选自HCV1a型、HCV1b型和HCV 2a型。
6.根据权利要求1至3任一项所述的可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品，其特征在于，所述阳性质控品中灭活的HCV病毒的浓度为5-25μg/ml。
7.根据权利要求1至3任一项所述的可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品，其特征在于，所述阳性质控品的溶剂为健康人的血浆；所述阴性质控品的溶剂为健康人的血浆。
8.包括权利要求1至7任一项所述质控品的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒。
9.权利要求1至7任一项所述质控品在丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的质量鉴定中的应用。
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