CN102154510A

CN102154510A - 丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒

Info

Publication number: CN102154510A
Application number: CN 201110046921
Authority: CN
Inventors: 戴立忠
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2011-02-25
Filing date: 2011-02-25
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2031-02-25
Also published as: CN102154510B

Abstract

本发明公开了一种丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，包括用于检测靶多核苷酸的探针、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和DNA聚合酶，其中，用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No.1序列。本发明试剂盒因为采用用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No.1序列，具有很好的特异性，应用本发明的试剂盒，可以对血清、血浆或乳汁等未知样本中的HCV-RNA浓度进行快速、准确测定，能够检测出所有HCV的六个基因型。

Description

丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒

技术领域

本发明涉及医学检测领域，特别涉及一种丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒。

背景技术

丙型肝炎呈世界性分布，人群普遍易感。丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)感染率为0.1％～10％，平均为3％，全球约1.7～2亿人感染HCV。我国一般人群HCV感染率为3％，约3800万感染者。HCV感染者70～80％发展成慢性丙型肝炎，慢性丙型肝炎的表现亦轻重不等，约20～30％可逐渐发展至肝硬化，肝硬化患者中，每年约1％～4％可发展为肝癌。

抗HCV酶联免疫试剂是目前诊断丙肝的主要手段，普遍应用于检查血源和血液制品，此类试剂已被广泛应用，但由于HCV病毒的分离尚不成功，目前所制备的抗原均为人工合成，其特异性方面仍然存在不足，主要是在低危人群中发现大量的不确定结果；对于某些免疫球蛋白水平高的患者，也可能出现假阳性。另外，感染后至抗体出现，在第二代试剂间隔为9～10周，第三代为6～8周，因此对于HCV感染的早期检测还需加强。试纸条免疫印迹试验(RIBA)现已有第二代试剂，灵敏度和特异性有所提高，主要用于ELISA检测可疑者，能帮助区别特异性HCV抗体和非特异性反应，是一确证试验。HCV抗体检测方法虽然有了改进，但仍然存在其局限性：“窗口期”平均长达70天，不利于早期诊断；而且只代表既往感染，可在病毒清除后仍长时间存在，有报道说该时间可长达9年，无法准确判别抗-HCV阳性者是否有病毒血症。

血清中的HCV RNA是病毒复制和肝炎进程的确切标志。所以检测血清HCV RNA已成为诊断HCV病毒血症的“金标准”。HCV感染者血清病毒滴度通常很低，常规分子杂交技术难以检出HCV RNA。近年发展的逆转录PCR(RT-PCR)，巢式PCR(nested PCR)技术将HCV-RNA检测的特异性和灵敏度大大提高，而荧光PCR的出现又将此检测技术推向了另一台阶。

通过荧光PCR的方法直接检测HCV RNA，大大提高HCV感染的检测准确性，有利于疾病的早期诊断，可将“窗口期”缩短平均56～60天，对“窗口期”感染的筛选和提高输血安全也非常有意义。此外，在抗病毒药物治疗中，HCV RNA是对其疗效评价的指标之一。另检测HCV RNA的滴度和基因型可对用药和预后提供参考。治疗过程中，HCV RNA的动态监测同时还可以为临床上的用药剂量、时间等提供依据。

目前，常用的RNA类标本的提取和纯化方法比较如下：

国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测HCV-RNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的HCV-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒具有一定的优点，但是，存在很多不足之处：1)酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；2)无法有效去除复杂样本(如高血脂、乳汁等样本)中的PCR抑制物，体系中一般没有阳性内对照(即内标)，无法预防假阴性；3)检测灵敏度低，约在500IU/ml左右；定量范围窄，一般在1.00E+03IU/ml～1.00E+07IU/ml之间，对于临床高值(大于5.00E+07IU/ml)和低值(小于1.00E+03IU/ml)的样本无法准确定量；4)没有荧光归一化校正系统。国外，性能优异的同类试剂是Roche(罗氏)公司的“Roche AmpliPrep-Cobas TaqMan HCV Test”诊断系统，使用1ml的样本量，应用磁珠法原理采用全自动化的仪器进行RNA提取，然后自动加样进行RNA的荧光PCR扩增，实现临床样本中HCV-RNA的定量检测。该诊断系统具有自动化程度高、操作简便、检测灵敏度低(大于30IU/ml)等优点，但是样本需求量(1ml)太大，而且全自动化操作的试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。

磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法，其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂，提取纯化的核酸质量好、产量高，提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化，这些优点及特点使其提取核酸的方法有替代所有其它方法的发展趋势。然而目前所用试剂基本上为国外所垄断，价格非常昂贵，从而限制了其在我国的广泛应用。

发明内容

本发明的目的提供一种丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，可检测出HCV所有已知6个基因型，但不能检测出非HCV病原体，解决现有技术中丙型肝炎检测试剂盒特异性差的技术问题。

本发明是通过以下技术方案实现：一种丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，包括用于检测靶多核苷酸的探针、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和DNA聚合酶，其中用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No.1序列。

优选地，用于扩增靶多核苷酸上游引物具有SEQ No.2序列，下游引物具有SEQ No.3序列。

该试剂盒进一步包括内标，内标是由具有SEQ No.4序列的DNA插入到pUC 18T载体而构成的重组体。

优选地，用于检测内标的探针具有SEQ No.5序列。

该试剂盒进一步包括用于扩增内标的上游引物以及下游引物，用于扩增内标的上游引物具有SEQ No.6序列，用于扩增内标的下游引物具有SEQ No.7序列。

该试剂盒进一步包括：

RNA提取溶液I：含有十二烷基硫酸钠0.2～1.0g/100ml，曲拉通1.0～4.0ml/100ml，异硫氰酸胍0.2mol/L～1.0mol/L和磁珠100～400μg/ml；

RNA提取溶液II：含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸0.1～0.3mol/L和氯化钠0.1～0.3mol/L；RNA提取溶液II的pH值为6.5±0.2；

RNA提取溶液III：含有曲拉通0.1～1.0ml/100ml和氯化钠0.1～0.3mmol/L；

RNA提取溶液IV：矿物油。

优选地，DNA聚合酶是Tth DNA聚合酶。

该述试剂盒进一步包括ROX参比染料，ROX参比染料的浓度为40～200mmol/L。

本发明试剂盒因为采用用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No.1序列，具有很好的特异性，应用本发明的试剂盒，可以对血清、血浆或乳汁等未知样本中的HCV-RNA浓度进行快速、准确测定，特异性好，能够检测出所有HCV的六个基因型。进一步地，因为本发明试剂盒加入内标，可以有效监控假阴性的存在；加入ROX参比染料起到明显的归一化效果。进一步地，本试剂盒对HCV-RNA的提取方法进行优化，选择吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，只需一步洗涤步骤，不需要洗脱核酸，可以直接用于检测，且获得的核酸纯度高，大大提高了检测灵敏度、准确度。

附图说明

图1A示出了本发明提供的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒中定量参考品A(5.00E+06IU/ml)、B(5.00E+05IU/ml)、C(5.00E+04IU/ml)和D(5.00E+03IU/ml)的扩增曲线图；

图1B示出了本发明提供的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒中定量分析的标准曲线图；

图2A示出了特异性实验中6个样本(包括HCV 6个基因型)扩增的结果图；

图2B示出了特异性实验中4例HCV阳性血清以及甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)等样本的扩增曲线图；

图3A示出了荧光归一化实验中对同样的12份样本，PCR体系中加入参比荧光(ROX)的扩增结果图；

图3B示出了荧光归一化实验中对同样的12份样本，PCR体系中不加入参比荧光(ROX)的扩增结果图；

图4示出了临床样本的检测中10个临床阴性标本的扩增曲线图；

图5示出了临床样本的检测中10个临床阳性标本的扩增曲线图；

图6示出了临床样本的检测中浓度为5.0×10¹IU/ml～1.0×10⁸IU/ml的8个梯度样本的扩增曲线图；

图7示出了临床样本的检测中浓度为5.0×10¹IU/ml～1.0×10⁸IU/ml的8个梯度样本的标准曲线图；

图8A示出了临床样本的检测中50IU/ml样本各重复8次的扩增曲线图；

图8B示出了临床样本的检测中25IU/ml样本各重复8次的扩增曲线图；

图8C示出了临床样本的检测中10IU/ml样本各重复8次的扩增曲线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

在本发明的一种具体实施方式中，提供了一种丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，包括以下组分：

(1)用于靶多核苷酸检测的探针HCV-P，源于丙肝病毒最保守的5’UTR区，具有SEQ No.1序列(Invitrogen公司合成)：

SEQ No.1：5’-ATTTGGGCGTGCCCCCGC-3’

优选地，SEQ No.1羧基端用FAM标记，羟基端用BHQ1猝灭基团修饰。在本发明的其他实施方式中，还可以选用6-FAM、TET、JOE、HEX等荧光素标记，配合选用DABCYL、TAMRA、BHQ2、BHQ3等猝灭基团。

(2)用于扩增靶多核苷酸的上游引物HCV-F和下游引物HCV-R，源于丙肝病毒最保守的5’UTR区，上游引物HCV-F具有SEQ No.2序列，下游引物HCV-R具有SEQ No.3序列(Invitrogen公司合成)：

SEQ No.2：5′-GCGGAACCGGTGAGTACAC-3′

SEQ No.3：5′-CTTTCGCGACCCAAC ACTACT-3′

(3)DNA聚合酶及附带的PCR反应液；

(4)脱氧核糖核苷三磷酸：为dATP、dCTP、dGTP和dTTP(均购自Promega公司)；

根据本发明提供的试剂盒，因为采用了上述探针和上下游引物，所以具有很好的特异性，应用本发明提供的试剂盒，可以对血清、血浆或乳汁等未知样本中的HCV-RNA浓度进行快速、准确测定，特异性好，能够检测出HCV的六个基因型。

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括：

RNA提取溶液I：含有十二烷基硫酸钠0.2～1.0g/100ml，曲拉通1.0～4.0ml/100ml，异硫氰酸胍0.2mol/L～1.0mol/L，磁珠100～400μg/ml；

RNA提取溶液II：含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸100～300mmol/L，氯化钠100～300mmol/L，RNA提取溶液II的pH值为6.5±0.2；

RNA提取溶液III：含有曲拉通0.1～1.0ml/100ml，氯化钠100～300mmol/L；

RNA提取溶液IV：矿物油；

本试剂盒所采用的核酸提取液，能够有效去除复杂样本中的PCR抑制物，适合于血清、血浆、乳汁等样本的RNA提取和PCR检测。

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括内标(阳性内对照)：本发明采用的阳性对照品为插入一段长为97碱基对的人工合成DNA序列的pUC18T载体的重组体，即质粒，浓度为1.00E+03copies/ml～1.00E+06copies/ml，作为PCR扩增体系中的内标，预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性，97碱基对的序列SEQ No.4如下所示(Invitrogen公司合成)：

SEQ No.4：

5’-CTAGCTGGATGTGTCTGCGTTTTTTTATATCTTCCTCCATCCTGCTAGGTGCCTCATCTTAGCTCTTCTATGTTG AACTGTTGTCCTCTCCTGAGCC-3’；

用于内标检测的探针IC-P，具有SEQNo.5序列(Invitrogen公司合成)：

SEQ No.5：5’-TTCCTCCATCCTGCTAGGTGCCTCA-3’；

优选地，SEQ No.5羧基端用HEX标记，羟基端用DABCYL猝灭基团修饰。在本发明的其他实施方式中，SEQNo.5还可以选用不同于SEQNo.1的荧光素标记，如TET、JOE、FAM等，配合选用BHQ1、TAMRA、BHQ2、BHQ3等猝灭基团。

优选地，针对97碱基对序列设计内标的非竞争性上游引物IC-F和下游引物IC-R，上游引物IC-F具有SEQNo.6序列，下游引物IC-R具有SEQNo.7序列(Invitrogen公司合成)：

SEQ No.6：5′-CTAGCTGGATGTGTCTGCGTTT-3′；

SEQ No.7：5′-GGCTCAGGAGAGGACAACAGTT-3′；

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括参比染料，ROX参比染料(购自Roche公司)或其他适用于荧光定量PCR的参比染料。加入ROX参比染料起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。

优选地，DNA聚合酶及PCR缓冲液是Tth DNA聚合酶及其附带的5×PCR反应缓冲液(购自Roche公司)。

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括RT-PCR增强剂：150mmol/L醋酸锰；

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括丙型肝炎病毒定量参考品：来源于经HCV RNA国家标准品(购自中国药品生物制品检定所)标定的HCV强阳性血清，以HCV阴性血清稀释而来，该丙型肝炎病毒定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为1.00～5.00E+06IU/ml(A)、1.00～5.00E+05IU/ml(B)、1.00～5.00E+04IU/ml(C)、1.00～5.00E+03IU/ml(D)；

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括丙型肝炎病毒阳性对照：来源于经HCV RNA国家标准品(购自中国药品生物制品检定所)标定的HCV强阳性血清，以HCV阴性血清稀释而来，其浓度为1.00～5.00E+02IU/ml；以及丙型肝炎病毒阴性对照：不含有乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒以及梅毒的灭活阴性血清。

将本发明丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒用于检测血清、血浆或乳汁等未知样本中的HCV-RNA浓度的操作步骤是：

1.试剂准备：

1)PCR反应液的配制：包含5×PCR反应缓冲液，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，40mmol/L～200mmol/L ROX参比染料，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于扩增靶多核苷酸的上游引物HCV-F以及下游引物HCV-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针HCV-P，0.1μmol/L～0.2μmol/L用于扩增内标的上游引物IC-F以及下游引物IC-R，0.05μmol/L～0.2μmol/L用于检测内标的探针IC-P，1U/μl～5U/μl Tth DNA聚合酶；

2)按比例(提取试剂I 200μl～1ml/人份+HCV内标0.4μl/人份)取相应量的提取试剂I及HCV内标，充分混匀成提取试剂I-mix，瞬时离心后备用。

3)根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D的量，按比例(PCR反应液49μl/人份+增强剂1μl/人份)取相应量的HCV PCR反应液及RT-PCR增强剂，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。

2.RNA提取操作

1)裂解病毒：每管加入200μl～1ml RNA提取溶液I-mix，然后加入100μl～1ml待测样本(血清、血浆或乳汁等待测样本)，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心(丙型肝炎病毒定量参考品、丙型肝炎病毒阴性对照以及阳性对照参照相同步骤提取)；

2)磁珠吸附核酸：每管加入50μl～400μl RNA提取溶液II，震荡混匀10秒钟后，室温静置10～30分钟；

3)去除杂质：瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出；

4)洗涤：每管加入400μl～1ml RNA提取溶液III和100μl～500μl RNA提取溶液IV，震荡混匀3～7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；

5)2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃。

6)每管加入50μl PCR-mix，用吸头吸取PCR-mix洗脱吸附于离心管壁的棕色残留物，反复几次尽量将其完全洗脱，然后将洗脱后的全部棕色混合液转移至PCR反应管中，盖上管盖。

3.荧光PCR反应

1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度。

2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reportere:FAM，Quencher:None)检测HCV；选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC，Quencher:None)检测内标；参比荧光(Passive Reference)设置为ROX。

3)荧光定量PCR反应条件为：

4.结果分析

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cyclethreshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，通过4个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定值结果。如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且定值结果≥25IU/ml，可以判为阳性；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示(Undet)或无定值结果显示，可以判为阴性。

特异性试验

采用本发明提供的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒对HCV六个基因型(1～6)标准品、四例HCV阳性血清以及甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)已知样本进行检测，考查本试剂盒的特异性。各试剂配方以及操作过程如下所示：

本发明的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒包括以下组分：

(1)RNA提取溶液I：含有十二烷基硫酸钠0.2g/100ml，曲拉通1.0ml/100ml，异硫氰酸胍0.2mol/L，磁珠100μg/ml；

(2)RNA提取溶液II：含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L，氯化钠100mmol/L，RNA提取溶液II的pH值为6.3；

(3)RNA提取溶液III：含有曲拉通0.1ml/100ml，氯化钠100mmol/L；

(4)RNA提取溶液IV：矿物油；

(5)内标(阳性内对照)：本发明提供的内标，浓度为1.00E+03copies/ml；

(6)Tth DNA聚合酶及其附带的5×PCR反应缓冲液；

(7)ROX参比染料；

(8)本发明提供的用于靶多核苷酸检测的探针HCV-P，羧基端用FAM标记，羟基端用BHQ1猝灭基团修饰；；

(9)本发明提供的用于扩增靶多核苷酸的上游引物HCV-F和下游引物HCV-R；

(10)本发明提供的用于内标检测的探针IC-P，羧基端用HEX标记，羟基端用DABCYL猝灭基团修饰；

(11)本发明提供的针对97碱基对序列设计内标的非竞争性上游引物IC-F和下游引物IC-R；

(12)RT-PCR增强剂：150mmol/L醋酸锰；

(13)本发明提供的丙型肝炎病毒定量参考品，浓度分别为1.00E+06IU/ml(A)、1.00E+05IU/ml(B)、1.00E+04IU/ml(C)、1.00E+03IU/ml(D)；

(14)脱氧核糖核苷三磷酸：为dATP、dCTP、dGTP和dTTP；

(15)本发明提供的丙型肝炎病毒阳性对照，其浓度为1.00E+02IU/ml。

(16)本发明提供的丙型肝炎病毒阴性对照。

操作步骤

1.试剂准备：

1)PCR反应液的配置：包含5×PCR反应缓冲液10μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，40mmol/L～200mmol/L ROX溶液，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于扩增靶多核苷酸的上游引物HCV-F以及下游引物HCV-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针HCV-P，0.1μmol/L～0.2μmol/L用于扩增内标的上游引物IC-F以及下游引物IC-R，0.05μmol/L～0.2μmol/L用于检测内标的探针IC-P，1U/μl Tth DNA聚合酶；

2)按比例(提取试剂I 200μl/人份+HCV内标0.4μl/人份)取相应量的提取试剂I及HCV内标，充分混匀成提取试剂I-mix，瞬时离心后备用。

2.RNA提取操作

1)裂解病毒：每管加入200μl RNA提取溶液I-mix，然后加入100μl待测样本(血清、血浆或乳汁等待测样本)，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心(丙型肝炎病毒定量参考品、丙型肝炎病毒阴性对照以及阳性对照参照相同步骤提取)；

2)磁珠吸附核酸：每管加入50μl RNA提取溶液II，震荡混匀10秒钟后，室温静置10分钟；

3)去除杂质：瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2分钟后缓慢将溶液吸出；

4)洗涤：每管加入400μl RNA提取溶液III和100μl RNA提取溶液IV，震荡混匀3秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；

5)2分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃。

3.荧光PCR反应

3)荧光定量PCR反应条件为：

4.结果分析

荧光PCR扩增结束后，使用仪器自带的软件进行分析，可得各样本的荧光扩增曲线。本实例中，阳性对照和阴性对照的结果验证了实验的有效性，HCV六个基因型(1～6)标准品、四例HCV阳性血清以及甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)等样本的扩增曲线如附图2A、2B所示，Ct值统计如下表1所示。

表1HCV特异性样本的检测结果

样本名称	检测结果Ct值
		HCV-1基因型标准品	28.58
HCV-2基因型标准品	28.91
		HCV-3基因型标准品	29.68
HCV-4基因型标准品	29.45
		HCV-5基因型标准品	29.93
HCV-6基因型标准品	30.04
		HCV阳性血清-1	23.99
HCV阳性血清-2	28.37
		HCV阳性血清-3	27.70
HCV阳性血清-4	25.17
		HAV血清	No Ct(阴性)
HBV血清	No Ct(阴性)
		EBV血清	No Ct(阴性)
CMV血清	No Ct(阴性)

从附图2A、2B和上表1可以看出，HCV六个基因型(1～6)、四例HCV阳性血清样本均有明显S型扩增曲线，均有Ct值，均可明显判为阳性样本；而HAV、HBV、EBV、CMV四个样本的扩增曲线都平直，与阈值线无交点，没有Ct值(No Ct)，均可明显判为阴性样本。说明本试剂盒的特异性好，可以检出HCV所有六个基因型样本，而非HCV样本均检测为阴性。

RNA不同提取方法对HCV检测的影响实验

目前市面上已有很多成熟的RNA提取试剂盒可用于样本中HCV-RNA的提取，选择常见的酚-氯仿法和柱提取法与本发明试剂盒中的磁珠法提取核酸进行比较。选取高、中、低浓度的HCV阳性样本(包括血清、血浆和乳汁)八例，分别提取RNA后进行荧光PCR反应。试剂配方与检测步骤如下所示：

本发明的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒包括以下组分：

(1)RNA提取溶液I：含有十二烷基硫酸钠0.5g/100ml，曲拉通2.5ml/100ml，异硫氰酸胍0.6mol/L，磁珠250μg/ml；

(2)RNA提取溶液II：含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸200mmol/L，氯化钠200mmol/L，RNA提取溶液II的pH值为6.5；

(3)RNA提取溶液III：含有曲拉通0.5ml/100ml，氯化钠200mmol/L；

(4)RNA提取溶液IV：矿物油；

(5)本发明提供的内标，浓度为1.00E+04copies/ml；

(6)Tth DNA聚合酶及其附带的5×PCR反应缓冲液；

(7)ROX参比染料；

(8)本发明提供的用于靶多核苷酸检测的探针HCV-P，同特异性实验；

(10)本发明提供的用于内标检测的探针IC-P，同特异性实验；

(11)本发明提供的内标的非竞争性上游引物IC-F和下游引物IC-R；

(12)RT-PCR增强剂：150mmol/L醋酸锰。

(13)本发明提供的脱氧核糖核苷三磷酸；

(14)本发明提供的丙型肝炎病毒定量参考品：其浓度分别为3.00E+06IU/ml(A)、3.00E+05IU/ml(B)、3.00E+04IU/ml(C)、3.00E+03IU/ml(D)；

(15)本发明提供的丙型肝炎病毒阳性对照：其浓度为3.00E+02IU/ml；

(16)本发明提供的丙型肝炎病毒阴性对照。

操作步骤

1.试剂准备：

1)PCR反应液的配置：包含5×PCR反应缓冲液10μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，100mmol/L ROX参比染料，0.3mol/L用于扩增靶多核苷酸的上游引物HCV-F以及下游引物HCV-R，0.3μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针HCV-P，0.2μmol/L用于扩增内标的上游引物IC-F以及下游引物IC-R，0.15μmol/L用于检测内标的探针IC-P，5U/μl Tth DNA聚合酶；

2)按比例(提取试剂I 800μl/人份+HCV内标0.4μl/人份)取相应量的提取试剂I及HCV内标，充分混匀成提取试剂I-mix，瞬时离心后备用。

2.样本中RNA提取操作

方法一：本试剂盒采用的磁珠法

1)裂解病毒：每管加入800μl RNA提取溶液I-mix，然后加入300μl待测样本(血清、血浆或乳汁等待测样本)，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心(丙型肝炎病毒定量参考品、丙型肝炎病毒阴性对照以及阳性对照参照相同步骤提取)；

2)磁珠吸附核酸：每管加入200μl RNA提取溶液II，震荡混匀10秒钟后，室温静置10分钟；

3)去除杂质：瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，3分钟后缓慢将溶液吸出；

4)洗涤：每管加入400μl～1ml RNA提取溶液III和100μl～500μl RNA提取溶液IV，震荡混匀5秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；

5)3分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃。

方法二：酚-氯仿法

1)用移液枪吸取150μl裂解液(十二烷基硫酸钠10.0g/100ml、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mmol/L(PH8.0)、曲拉通4.0ml/100ml、吐温-201.5％ml/100ml、乙二胺四乙酸0.5mmol/L(PH8.0))于0.5ml离心管中，加入50μl血清样本(丙型肝炎病毒定量参考品、丙型肝炎病毒阴性对照以及阳性对照参照相同步骤提取)；

2)用吸头反复吸打混匀后加入50ul氯仿，振荡混匀5秒，13000转离心15分钟；

3)0.5ml离心管中各加入100ul异丙醇，吸取步骤2)中各管中的上层液相转移至相应管中，颠倒混匀，13000转离心15分钟；

4)倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入300ul 75ml/100ml乙醇，颠倒洗涤；

5)13000rpm离心10分钟，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体；

6)2000转离心5秒，将管底部少量液体用微量加样器吸干，室温干燥1-5分钟；

7)于干燥后的沉淀中加入15ul DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，离心5秒，冰上保存，2ul RNA溶液及标准品加入分装有反应液的PCR反应管中。

方法三：柱提取

1)用移液枪吸取20μl去抑制剂于0.5ml离心管中；

2)加入100μl血清样本，反复吸打3次混匀；

3)加入100μl裂解液(十二烷基硫酸钠10.0g/100ml、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mmol/L(PH8.0)、曲拉通4.0ml/100ml、吐温-201.5ml/100ml、乙二胺四乙酸0.5mmol/L(PH8.0))，盖上管盖，振荡混匀，低速(2000rpm)离心数秒后置70℃反应10分钟。低速(2000rpm)离心数秒后，打开管盖，加入110μl无水乙醇，盖上管盖，振荡混匀。

4)将做好标记的核酸提取柱放入2ml离心管中，将上述所有液体移入核酸提取柱；

5)6000rpm离心1分钟，将提取柱放入一新的2ml离心管中，加入500μl洗涤液A(曲拉通2.0ml/100ml，氯化钾200mmol/L)，6000rpm离心1分钟；

6)将提取柱放入一新的2ml离心管中，加入500μl洗涤液B(70ml/100ml乙醇)，6000rpm离心1分钟；

7)将提取柱放入一新的2ml离心管中，14000rpm离心2分钟，去除残留乙醇；

8)将提取柱放入一新的2ml离心管中，小心将50μl洗脱液加在膜中央，静置1分钟；

9)10000rpm离心1分钟，取收集液2μl加入装有PCR-mix的PCR反应管中。

3.荧光PCR反应

3)荧光定量PCR反应条件为：

4.结果分析

三种方法提取RNA后进行PCR扩增反应，根据ABI 7500SDS 1.4软件自动分析，阳性对照和阴性对照的结果验证了实验的有效性，所得HCV检测结果和内标检测结果的Ct值如表2所示：

表2三种RNA提取方法的检测结果比较

从上表2可以明显看出，方法1中，血清、血浆、乳汁样本的HCV检测和内标检测的结果均有Ct值(即都为阳性)，体系中没有PCR抑制物的存在；其他2种提取方法中，均存在低浓度血清、血浆和乳汁样本的HCV检测无Ct值(Undet)的情况(即为阴性)，而此时内标也检测为阴性(Undet)，不同浓度的样本方法2的内标则完全无扩增，由于3种提取方法使用的是同一种PCR扩增体系，由此说明，方法2和方法3提取的RNA中有PCR抑制物存在，而导致HCV阳性样本检测为阴性，即为假阴性，提示应该进行重新检测或者改进方法进行检测。因此，方法1，即本试剂盒所采用的磁珠法提取核酸，能够有效去除复杂样本中的PCR抑制物，适合于血清、血浆、乳汁等样本的RNA提取和PCR检测。同时也说明，体系中加入内标，可以有效预防假阴性结果。

荧光归一化校正

由于加样操作的误差、离心管透光性能的差异、荧光激发效率的差异等偶然因素不可避免，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，以消除这些因素对试验结果的影响。这种校正可以通过在反应体系中添加额外的荧光染料(称为参比荧光)来实现，如加入ROX参比荧光，ROX在PCR反应液中的浓度是恒定的，因此其信号的强度与反应体系的体积和荧光激发效率呈正相关，当反应体积变化或激发光效率发生变化时，ROX信号与目标基因的信号(如FAM)受到同等程度的影响(假设影响因子为s)，但是目标基因的信号与参比荧光信号的比值(即Rn＝(s.R_FAM)/(s.R_ROX)＝R_FAM/R_ROX)不受偶然因素的影响。因此，反应体系中加入参比荧光便于仪器自动分析，使检测结果的稳定性和重复性大大提高，便于准确定值。

本发明的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒包括以下组分：

(1)RNA提取溶液I：含有十二烷基硫酸钠1.0g/100ml，曲拉通4.0ml/100ml，异硫氰酸胍1.0mol/L，磁珠400μg/ml；

(2)RNA提取溶液II：含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸300mmol/L，氯化钠300mmol/L，RNA提取溶液II的pH值为6.7；

(3)RNA提取溶液III：含有曲拉通1.0ml/100ml，氯化钠300mmol/L；

(4)RNA提取溶液IV：矿物油；

(5)本发明提供的内标，浓度为1.00E+06copies/ml；

(6)Tth DNA聚合酶及其附带的5×PCR反应缓冲液；

(7)ROX参比染料；

(10)本发明提供的用于内标检测的探针IC-P，同特异性实验；

(12)RT-PCR增强剂：150mmol/L醋酸锰；

(13)本发明提供的丙型肝炎病毒定量参考品：其浓度分别为5.00E+06IU/ml(A)、5.00E+05IU/ml(B)、5.00E+04IU/ml(C)、5.00E+03IU/ml(D)；

(14)本发明提供的丙型肝炎病毒阳性对照：其浓度为5.00E+02IU/ml；

(15)本发明提供的丙型肝炎病毒阴性对照。

操作步骤

1.试剂准备：

1)PCR反应液-1：包含5×PCR反应缓冲液10μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dUTP、dGTP、dCTP)，200mmol/L ROX溶液，0.4μmol/L用于扩增靶多核苷酸的上游引物HCV-F以及下游引物HCV-R，0.4μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针HCV-P，0.15μmol/L用于扩增内标的上游引物IC-F以及下游引物IC-R，0.1μmol/L用于检测内标的探针IC-P，5U/μl Tth DNA聚合酶；

2)PCR反应液-2：包含5×PCR反应缓冲液10μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dUTP、dGTP、dCTP)，0.4μmol/L用于扩增靶多核苷酸的上游引物HCV-F以及下游引物HCV-R，0.4μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针HCV-P，0.15μmol/L用于扩增内标的上游引物IC-F以及下游引物IC-R，0.1μmol/L用于检测内标的探针IC-P，5U/μl Tth DNA聚合酶；

需要说明的是：本实施例中使用了2种PCR反应液，PCR反应液-2的配方与PCR反应液-1的不同之处仅在于PCR反应液-2中没有ROX溶液，不足的体积用灭菌水补充；

3)按比例(提取试剂I 200μl/人份+HCV内标0.4μl/人份)取相应量的提取试剂I及HCV内标，充分混匀成提取试剂I-mix，瞬时离心后备用。

4)根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D的量，按比例(PCR反应液49μl/人份+增强剂1μl/人份)取相应量的HCV PCR反应液-1或PCR反应液-2及RT-PCR增强剂，充分混匀成PCR-mix-1或PCR-mix-2，瞬时离心后备用。

2.RNA提取操作

1)裂解病毒：每管加入1ml RNA提取溶液I-mix，然后加入1ml待测样本(血清、血浆或乳汁等待测样本)，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心(丙型肝炎病毒定量参考品、丙型肝炎病毒阴性对照以及阳性对照参照相同步骤提取)；

2)磁珠吸附核酸：每管加入400μl RNA提取溶液II，震荡混匀10秒钟后，室温静置20分钟；

3)去除杂质：瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，5分钟后缓慢将溶液吸出；

4)洗涤：每管加入1ml RNA提取溶液III和500μl RNA提取溶液IV，震荡混匀7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；

5)5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃。

6)每管加入50μl PCR-mix-1或50μl PCR-mix-1，用吸头吸取PCR-mix-1或50μl PCR-mix-1洗脱吸附于离心管壁的棕色残留物，反复几次尽量将其完全洗脱，然后将洗脱后的全部棕色混合液转移至PCR反应管中，盖上管盖。

3.荧光PCR反应

3)荧光定量PCR反应条件为：

4.结果分析

荧光PCR扩增结束后，输入丙型肝炎病毒定量参考品A～D的浓度，使用ABI 7500仪器自带的SDS 1.4软件进行自动分析，可得各样本的荧光扩增曲线以及各样本的定值结果(浓度值)。阳性对照和阴性对照的结果验证了实验的有效性，丙型肝炎病毒定量参考品A～D的扩增曲线和标准曲线如附图1A和1B所示；本实例中，对同一浓度的2组样本采用2种PCR反应体系分别检测，PCR反应体系-1(含ROX)、PCR反应体系-2(不含ROX)的荧光扩增曲线图分别如附图3A和附图3B所示，Ct值、浓度值及其均值以及变异系数统计如下表3所示：

表3两种PCR反应体系检测结果的Ct值、浓度值统计结果

从附图3A、图3B和表4可以看出，PCR反应体系1(含ROX)的扩增曲线一致性较好，Ct值一致性好，变异系数小(0.56％)，远小于PCR体系2(不含ROX)结果Ct值的变异系数(1.53％)，说明PCR体系中加入ROX参比荧光可以起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。

临床样本的检测实验

本发明的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒包括以下组分：

(1)RNA提取溶液I：含有十二烷基硫酸钠0.5g/100ml，曲拉通2.0ml/100ml，异硫氰酸胍1.0mol/L，磁珠200μg/ml；

(3)RNA提取溶液III：含有曲拉通0.2ml/100ml，氯化钠200mmol/L；

(4)RNA提取溶液IV：矿物油；

(5)本发明提供的内标，浓度为3.75E+05copies/ml；

(6)Tth DNA聚合酶及其附带的5×PCR反应缓冲液；

(7)ROX参比染料；

(10)本发明提供的用于内标检测的探针IC-P，同特异性实验；

(12)RT-PCR增强剂：150mmol/L醋酸锰。

(15)本发明提供的丙型肝炎病毒阴性对照。

操作步骤

1.试剂准备：

1)PCR反应液的配制：包含5×PCR反应缓冲液10μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dUTP、dGTP、dCTP)，200mmol/L ROX溶液，0.2μmol/L用于扩增靶多核苷酸的上游引物HCV-F以及下游引物HCV-R，0.2μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针HCV-P，0.2μmol/L用于扩增内标的上游引物IC-F以及下游引物IC-R，0.1μmol/L用于检测内标的探针IC-P，5U/μlTth DNA聚合酶；

2)样本准备

①24例临床血清样本(其中阳性样本10例，阴性样本10例)；

②对高浓度的临床样本进行10倍梯度稀释至50IU/ml，考察定量结果的准确性以及线性定量范围；

③对线性定量范围的下限(50IU/ml)作进一步稀释以确定本发明的试剂盒的检测灵敏度。

4)根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D的量，按比例(PCR反应液49μl/人份+增强剂1μl/人份)取相应量的HCV PCR反应液及RT-PCR增强剂，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。

2.RNA提取操作

1)裂解病毒：每管加入600μl RNA提取溶液I-mix，然后加入200μl待测样本(血清、血浆或乳汁等待测样本)，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心(丙型肝炎病毒定量参考品、丙型肝炎病毒阴性对照以及阳性对照参照相同步骤提取)；

2)磁珠吸附核酸：每管加入100μl RNA提取溶液II，震荡混匀10秒钟后，室温静置30分钟；

4)洗涤：每管加入600μl RNA提取溶液III和200μl RNA提取溶液IV，震荡混匀5秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；

3.荧光PCR反应

3)荧光定量PCR反应条件为：

4.结果分析

PCR反应结束后，根据7500SDS 1.4软件自动分析，阳性对照和阴性对照的结果验证了实验的有效性，10例阴性临床样本的扩增曲线见附图4，曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性；10个临床阳性标本扩增曲线见附图5，扩增曲线呈典型S型，均有Ct值，可明确判定为阳性，10个阳性样本的Ct值分别是18.10、21.24、27.11、18.09、24.38、19.88、16.29、29.64、19.45、20.33；软件自动分析所得10个临床阳性标本的丙型肝炎病毒浓度分别为：3.37×10⁷IU/ml、4.54×10⁶IU/ml、1.07×10⁵IU/ml、3.38×10⁷IU/ml、6.13×10⁵IU/ml、1.08×10⁷IU/ml、1.06×10⁸IU/ml、2.13×10⁴IU/ml、1.42×10⁷IU/ml、8.10×10⁶IU/ml。

对高值(1.06×10⁸IU/ml)的临床样本进行梯度依次稀释至1.0×10⁷IU/ml、1.0×10⁶IU/ml、1.0×10⁵IU/ml、1.0×10⁴IU/ml、1.0×10³IU/ml、5.0×10¹IU/ml，扩增曲线见附图6，均有Ct值，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性，同时以5.0×10¹IU/ml～1.0×10⁸IU/ml作为定值的标准品，输入浓度后进行标准曲线分析(如图7)，线性相关系数R²＝0.9995，说明具有良好的线性关系，证明高值(1.0×10⁸IU/ml)的临床样本定量准确，同时也说明线性定量范围为5.0×10¹IU/ml～1.0×10⁸IU/ml。

对线性定量范围下限(50IU/ml)进一步稀释至25IU/ml和10IU/ml，对50IU/ml、25IU/ml和10IU/ml的3种浓度的样本各重复8次检测，扩增曲线分别见附图8-A(50IU/ml)、图8-B(25IU/ml)和图8-C(10IU/ml)，由图可以看出，50IU/ml和25IU/ml的样本均有明显的S型扩增曲线，Ct值分别在34～36左右，均可以判定为阳性；而10IU/ml的8个样本中，有2个样本的扩增曲线平直，无Ct值，可以判为阴性，其余6个样本为阳性曲线，阳性率为75％，因此可以判定本发明的试剂盒的检测灵敏度可达25IU/ml。

综合上述实验结果可以看出：

特异性试验表明：试剂盒能够检测HCV 6个基因型(1～6)，而对甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)等样本均保持良好的阴性结果。

RNA不同提取方法对HCV检测的影响试验表明：本发明的磁珠法提取纯化HCV RNA，血清、血浆、乳汁样本的HCV检测和内标检测的结果均有Ct值(即都为阳性)，体系中没有PCR抑制物的存在；而目前常用的酚-氯仿法和柱提取法中，均存在低浓度血清、血浆和乳汁样本的HCV检测无Ct值(Undet)的情况(即为阴性)，而此时内标也检测为阴性(Undet)，不同浓度的样本方法2的内标则完全无扩增，由于3种提取方法使用的是同一种PCR扩增体系，由此说明，酚-氯仿法和柱提取法提取的RNA中有PCR抑制物存在，而导致HCV阳性样本检测为阴性，即为假阴性，提示应该进行重新检测或者改进方法进行检测。因此，本试剂盒所采用的磁珠法提取核酸，能够有效去除复杂样本中的PCR抑制物，适合于血清、血浆、乳汁等样本的RNA提取和PCR检测。同时也说明，体系中加入内标，可以有效预防假阴性结果。

荧光归一化校正试验表明：本发明的磁珠法提取纯化试剂PCR反应体系中加入了ROX归一化校正系统，扩增曲线一致性较好，Ct值一致性好，变异系数小(0.56％)，远小于无归一化校正系统的Ct值的变异系数(1.56％)，说明PCR体系中加入ROX参比荧光可以起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。

临床样本的检测试验表明：本发明的磁珠法提取纯化试剂盒的定量线性范围为50IU/mL～1.0E+08IU/mL，检测下限即灵敏度为25IU/mL。

本发明在对HCV所有已知基因型(1～6型)的序列进行比对的基础上，在HCV的最保守区域5’UTR共设计了两对引物和探针，经定量PCR优化，筛选出了扩增效果最好的一对引物和探针，可检测出HCV所有已知六个基因型，但不能检测出非HCV病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。同时，对HCV-RNA的提取方法进行了比较和优化，选择了吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，而且只需要一步洗涤步骤，最关键的是不需要洗脱核酸，可以直接用于检测，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性，检测灵敏度可达25IU/ml，定量线性范围为50IU/ml～1.0×10⁸IU/ml。另外，对PCR反应体系进行了优化组合，在样本提取过程中增加了内标，利用内标监控RNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性；在PCR反应体系中增加了ROX(参比荧光)溶液，通过ROX荧光归一化校正，减少人员操作误差以及设备或耗材引起的实验误差，提高实验结果的稳定性和定量分析的准确性。荧光定量PCR扩增结束后，通过试剂盒中配备的已知浓度的定量参考品(经HCV国家标准品标定浓度)经仪器自带软件自动分析制作的标准曲线可以定量血清、血浆或乳汁等未知样本中的HCV-RNA浓度，可为灵敏、早期诊断丙型肝炎病毒感染提供可靠的实验证据，同时由于能准确定量，所以可对临床用药进行有效监测。综上，本发明提供的用于丙型肝炎核酸定量检测的试剂盒，由于在引物、内标、核酸提取试剂以及DNA聚合酶的选用和参比染料添加等方面的改进和优化，极大程度的提高了丙型肝炎检测的准确性和精确度。

以上结合较佳实施例对本发明的实施方式作了描述，但这些实施方式仅是出于示例的目的而不是限制本发明。应该理解的是，本领域技术人员可以在不背离本发明的范围和精神的前提下，对于具体实施方式进行变化和修改。同样地，除了以上提到的实施方式，在所附的权利要求中还可以发现许多具体实施方式。

Claims

1.一种丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，包括用于检测靶多核苷酸的探针、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和DNA聚合酶，其特征在于，所述用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No.1序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增靶多核苷酸上游引物具有SEQNo.2序列，下游引物具有SEQ No.3序列。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括内标，所述内标是由具有SEQ No.4序列的DNA插入到pUC18T载体而构成的重组体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括用于检测内标的探针，所述用于检测内标的探针具有SEQ No.5序列。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括用于扩增内标的上游引物以及下游引物，所述用于扩增内标的上游引物具有SEQ No.6序列，所述用于扩增的内标下游引物具有SEQ No.7序列。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括：

RNA提取溶液I：含有十二烷基硫酸钠0.2～1.0g/100ml，曲拉通1.0～4.0ml/100ml，异硫氰酸胍0.2mol/L～1.0mol/L和磁珠100～400tg/ml；

RNA提取溶液II：含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸0.1～0.3mol/L和氯化钠0.1～0.3mol/L；所述RNA提取溶液II的pH值为6.5±0.2；

RNA提取溶液IV：矿物油。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶是Tth DNA聚合酶。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括ROX参比染料，所述ROX参比染料的浓度为40～200mmol/L。