CN105624311A - 单管中多重靶核酸的实时荧光pcr检测方法及其试剂盒 - Google Patents

单管中多重靶核酸的实时荧光pcr检测方法及其试剂盒 Download PDF

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CN105624311A CN201610129787.0A CN201610129787A CN105624311A CN 105624311 A CN105624311 A CN 105624311A CN 201610129787 A CN201610129787 A CN 201610129787A CN 105624311 A CN105624311 A CN 105624311A
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Abstract

本发明实施例公开了一种单管中多重靶核酸的实时荧光PCR检测方法及其试剂盒，其包括在所述单个PCR反应管中混合样本核酸，Tth？DNA聚合酶，H-Taq？DNA聚合酶，Mn(OAc)2，dNTPs，内标，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的上下游引物和探针，以及内标上下游引物和探针，针对所述的各种探针标记有荧光基团和荧光淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的检测波长不同；所述内标是竞争性内标，其与HIV共用所述HIV的上下游引物。本发明的能够检测HIV、HCV、HBV三种常见血液传染病毒的各种基因型别，同时降低成本，提高仪器使用率，满足血液中心检测要求。

Description

单管中多重靶核酸的实时荧光PCR检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，涉及在单个PCR反应容器中多重检测样品中靶核酸的PCR方法，具体涉及一种单管中多重靶核酸的实时荧光检测PCR方法以及检测试剂盒。
背景技术
自1971年开始HBsAg作为常规筛查项目引入到血液筛查，使得输血后感染乙肝的发生率大大降低，但每年仍有少量新发输血后肝炎病例报道。例如美国无偿献血者每单位供血传播HBV的危险性为1/6.3万。这些危险主要来自HBV“窗口期”、病毒变异、低病毒载量感染等。间接酶联免疫法(ELISA)筛查并不能从根本上排除病毒存在的危险，由于HBV感染后病毒颗粒先于HBsAg释放到血液中，在约50天的“窗口期”内，感染者的HBsAg检测呈阴性，但是其血液却具传染性。而使用核酸检测(Nucleicacidtest，NAT)技术能提前20天筛查出HBsAg阴性、HBV-DNA阳性献血者。
随着血液制品在世界范围的流通，HCV感染呈世界性分布，为了控制丙型肝炎病毒的血液传播，世界各国均开展了对献血员抗-HCV的检测。常用的抗-HCV诊断试剂采用间接酶联免疫法(ELISA)，第一代抗-HCVELISA采用的抗原C100-3是HCV非结构基因(NS3/NS4)和人超氧化物歧化酶基因嵌合后表达的融合蛋白，灵敏度低，漏检率较高；第二代抗-HCVELISA在第一代基础上增加了核心区重组蛋白C22和NS3区重组蛋白C33c，虽然在灵敏度和特异性上有很大改善，但仍不能排除由于重组融合蛋白带来的少数假阳性和极少数的漏检。目前我国多采用第三代抗-HCVELISA试剂，其包被抗原为HCV核心抗原、NS3、NS4和NS5抗原，特异性超过99％，虽然目前缺乏判断其敏感性的金标准，但对于免疫功能正常的HCV-RNA阳性感染者，抗-HCV检出率也高于99％。HCV感染后一般到抗体转阳有一个较长的窗口期，平均为70天，有的患者窗口期可延长至6-9月或更长，约1％-3％的患者抗-HCV可持续阴性，而基因组的复制出现得很早，感染后数天即出现病毒血症。已有输血后即有丙型肝炎病毒感染发生的报道，这表明抗-HCV阴性的献血员中有少数存在丙型肝炎病毒输血传播的可能性。
人类获得性免疫缺陷综合症简称艾滋病，是由一种存在于血液中并攻击免疫系统的病毒引起的。据WHO估计，我国艾滋病感染人数到2010年将达到1000万，并持续高速增长。血液传播是艾滋病毒传播的重要途径之一。全球每年增加560万艾滋病毒携带者，有5％至10％的人是经过输血或血液制品而感染的。
根据所采用的检测方法的灵敏度不同，感染窗口期的长短不同。采用核酸测定方法，HIV的感染窗口期为11天；采用第3代EIA试剂盒，HIV的感染窗口期为22天；采用第4代EIA试剂盒，HIV的感染窗口期为18天。由于空白窗口期的存在，即使未来技术的灵敏度足以消除感染窗口期，仍然无法将HIV感染的窗口期缩短为零。
目前，在临床上筛选各种血源性传播疾病的方法，主要是免疫学诊断方法。尽管随着第三代单克隆诊断抗体的出现，在很大程度上增加了筛查和检测的灵敏度，并在一定程度上减少了血源传播病毒性疾病的概率。但由于受免疫学诊断方法的灵敏度及其与生俱来的限制，依然不能完全杜绝阳性病毒血样的漏检，漏检率较高。其主要原因在于，免疫学诊断主要依赖抗原抗体介导的免疫反应，而病毒感染机体后，机体产生可检测水平的高滴度抗体的需要一段相对较长的时间。另外，由于个体免疫机能不同，其中有少数感染者感染后机体所产生的抗体滴度有可能低于免疫学检测线一下，甚至不产生抗体。因此，免疫学诊断方法不能检测出处于窗口期和新近感染病毒的献血员，这样势必导致漏检。其次，抗原出现变异以及稀有亚型也可导致漏检，因此，免疫学筛查后，输血相关疾病传播依然存在一定的概率。
目前免疫学检测以上三种病毒的平均窗口期分别为：HBV56天，HCV70天，HIV22天。近5年来，随着以核酸检测(Nucleicacidtest，NAT)为代表的分子生物学技术在血液筛查方面的应用，输血及血制品安全性有了很大的提高。在理论上，NAT技术能够显著的缩短病原体检出的窗口期。另外，NAT技术灵敏度和特异性均较显著的高于免疫学方法。核酸检测HBV，HCV，HIV病毒的窗口期较抗体检测分别提前：9天、25天、14天。而应用NAT技术筛查献血员，相应的可将献血员传播以上病毒性疾病的概率分别降低42％、72％和50％。
但是现有的核酸检测技术具有以下缺点：(1)以诺华诊断的TMA方法以及罗氏诊断等采用单管检测，但是不能区分HBV，HCV及HIV-1病毒种类，根据中国国情，如血液中心检测到HIV-1反应性样本，需报当地疾病预防控制中心做确诊检测，因此血液中心还需要采购这些厂家的病毒种类检测试剂，增加了成本；
(2)以达安基因，科华生物为代表的采用三管检测技术，会限制检测通量。例如，同样采用96孔的PCR仪器，科华需要三个孔才能检测一个样本，整机不计算对照样品最多检测32个样本，试剂整体的成本也较高；另外核酸提取模板要分成三份分别检测，试剂灵敏度受影响较大，尤其是针对隐匿性乙肝造成潜在漏检风险。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明实施例中提供了一种单管中多重靶核酸的实时荧光检测PCR方法，每种病毒靶核酸分别是HBV-DNA，HCV-RNA和HIV-1-RNA，其包括如下步骤：
(1)在单个PCR反应管中混合样本核酸，TthDNA聚合酶，H-TaqDNA聚合酶，Mn(OAc)2，dNTPs，内标，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的上下游引物和探针，以及内标探针，针对所述的各种探针标记有荧光基团和荧光淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的检测波长不同；其中，
所述HBV-DNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:1
5’-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3’；
所述HBV-DNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:2
5’-AGAGTAACTCCACAGWAGCTCCAA-3’；
所述HBV-DNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:3
5’-TTGGGTGGCTTTGGGGCATGGA-3’；
所述HCV-RNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:4
5’-AGTGTCGTRCAGCCTCCAGG-3’；
所述HCV-RNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:5
5’-GGTGTACTCACCGGTTCCG-3’；
所述HCV-RNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:6
5’-CCCCCTCCCGGGAGAGCCAT-3’；
所述HIV-1-RNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:7
5’-CCTCAGATGCTGCATAWAAGCAG-3’；
所述HIV-1-RNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:8
5’-CCAGAGAGCTCCCAGGCTC-3’；
所述HIV-1-RNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:9
5’-TGTACTGGGTCTCTCTDGTTAGACCAGAT-3’；
所述内标探针的碱基序列为：SEQIDNO:10
5’-AACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACG-3’；
所述内标的扩增子序列的碱基序列为：SEQIDNO:11
5’-CCTCAGATGCTGCATATAAGCAGTTCCAAGTTGTAAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGTTCCAAGTTGTAGAGCCTGGGAGCTCTCTGG-3’；
(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；
(3)选择FAM通道检测HIV-1RNA，ROX通道检测HCV-RNA阳性样本，CY5通道检测HBV-DNA；根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有HBV-DNA，HCV-RNA和HIV-1-RNA中的一种或几种病毒靶核酸存在于样品。
优选的，上述的方法，其中，所述内标是竞争性内标，其与HIV共用所述HIV-1-RNA的上下游引物。
优选的，上述的方法，其中，所述内标包含在人造病毒颗粒内。
优选的，上述的方法，其中，所述各种探针标记有不同的荧光基团。
优选的，上述的方法，其中，所述PCR反应条件为：(1)预变性和酶激活，95℃，1分钟，循环数为1；(2)逆转录，60℃，30分钟，循环数为1；(3)cDNA预变性，95℃，1分钟，循环数为1；(4)变性，退火，延伸及荧光采集，循环数为45，其中变性95℃，15秒；退火，延伸及荧光采集，60℃，30秒；(5)仪器冷却，25℃，10秒，循环数为1。
优选的，上述的方法，其中，所述步骤(3)中所述根据荧光检测结果计算出的Ct值判断：FAM通道测定Ct值＜45的样本为HIV阳性样本，ROX通道测定Ct值＜45的样本为HCV阳性样本，CY5通道测定Ct值＜45的样本为HBV阳性样本。
一种单管中多重靶核酸的实时荧光PCR检测试剂盒，其包括TthDNA聚合酶，H-TaqDNA聚合酶，Mn(OAc)2，dNTPs，内标，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的引物对和探针，以及内标探针，针对所述的各种探针标记有荧光基团和荧光淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的检测波长不同；其中，
所述HBV-DNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:1
5’-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3’；
所述HBV-DNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:2
5’-AGAGTAACTCCACAGWAGCTCCAA-3’；
所述HBV-DNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:3
5’-TTGGGTGGCTTTGGGGCATGGA-3’；
所述HCV-RNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:4
5’-AGTGTCGTRCAGCCTCCAGG-3’；
所述HCV-RNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:5
5’-GGTGTACTCACCGGTTCCG-3’；
所述HCV-RNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:6
5’-CCCCCTCCCGGGAGAGCCAT-3’；
所述HIV-1-RNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:7
5’-CCTCAGATGCTGCATAWAAGCAG-3’；
所述HIV-1-RNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:8
5’-CCAGAGAGCTCCCAGGCTC-3’；
所述HIV-1-RNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:9
5’-TGTACTGGGTCTCTCTDGTTAGACCAGAT-3’；
所述内标探针的碱基序列为：SEQIDNO:10
5’-AACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACG-3’；
所述内标的扩增子序列的碱基序列为：SEQIDNO:11
5’-CCTCAGATGCTGCATATAAGCAGTTCCAAGTTGTAAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGTTCCAAGTTGTAGAGCCTGGGAGCTCTCTGG-3’。
优选的，上述的试剂盒，其中，所述内标是竞争性内标，其与HIV共用所述HIV-1-RNA的上下游引物。
优选的，上述的试剂盒，其中，所述内标核酸被包装在病毒样颗粒内。
在本发明中，“多重检测”指的是同时检测的核酸有多种，即至少两种，由于至少检测了内标核酸和一种靶核酸，因此检测的核酸至少有两种。当要检测的靶核酸种类不止一种时，和/或作为内对照的内对照核酸种类不止一种时，则同时检测的核酸相应增加。其中，每种核酸可以是RNA，也可以是DNA。多种靶核酸中有RNA靶核酸，也有DNA靶核酸。
优选在本发明的方法中，在步骤(1)中所述单个PCR反应容器中还进一步混合有PCR反应所需的其他试剂，如5×PCRbuffer。在本发明的具体实施方式中，5×PCRbuffer由0.25mol/L的N,N-二羟乙基甘氨酸/氢氧化钾(Bicine/KOH),pH8.2；575mmol/L的乙酸钾(Potassiumacetate)和40％(v/v)甘油(glycerol)组成。
在本发明的方法中，不同种探针之间所标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，这样能够同时或快速地顺序扫描不同的检测波长，分别记录下各种荧光基团的荧光变化，从而能够进行同时检测。在每种探针的碱基序列的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。优选其中各种探针标记有不同的荧光基团。
本领域技术人员能够根据引物及相应需要PCR扩增的核酸来设计PCR反应条件。对于多重检测，为了平衡不同种核酸的扩增条件，本发明人经过长期摸索，优化出的条件如表1所示。
表1
在实时荧光PCR反应中，Ct值表示每个PCR反应管内荧光信号到达实时荧光PCR仪所默认设定的阈值时所经历的循环数，其具有良好的再现性，因此可以用于作为判读结果的优良指标。选择FAM通道检测HIV-1RNA，ROX通道检测HCV-RNA，CY5通道检测HBV-DNA；FAM通道测定Ct值＜45的样本为HIV阳性样本，ROX通道测定Ct值＜45的样本为HCV阳性样本，CY5通道测定Ct值＜45的样本为HBV阳性样本。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
采用单管技术可以从根本上解决目前单管检测不能区分HBV，HCV及HIV-1病毒种类的技术问题；血液中心不需要采购厂家的病毒种类检测试剂，降低了成本；解决了三管检测技术，限制检测通量的问题，使得试剂灵敏度提高，并且降低隐匿性乙肝潜在漏检风险；同时降低成本，提高仪器使用率，满足血液中心检测要求。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本实施例提供的一种单管中多重靶核酸的实时荧光PCR检测试剂盒，其包括TthDNA聚合酶，H-TaqDNA聚合酶，Mn(OAc)2，dNTPs，内标，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的引物对和探针，以及内标探针，针对所述的各种探针标记有荧光基团和荧光淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的检测波长不同；其中，
所述HBV-DNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:1
5’-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3’；
所述HBV-DNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:2
5’-AGAGTAACTCCACAGWAGCTCCAA-3’；
所述HBV-DNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:3
5’-TTGGGTGGCTTTGGGGCATGGA-3’；
所述HCV-RNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:4
5’-AGTGTCGTRCAGCCTCCAGG-3’；
所述HCV-RNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:5
5’-GGTGTACTCACCGGTTCCG-3’；
所述HCV-RNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:6
5’-CCCCCTCCCGGGAGAGCCAT-3’；
所述HIV-1-RNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:7
5’-CCTCAGATGCTGCATAWAAGCAG-3’；
所述HIV-1-RNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:8
5’-CCAGAGAGCTCCCAGGCTC-3’；
所述HIV-1-RNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:9
5’-TGTACTGGGTCTCTCTDGTTAGACCAGAT-3’；
所述内标探针的碱基序列为：SEQIDNO:10
5’-AACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACG-3’；
所述内标的扩增子序列的碱基序列为：SEQIDNO:11
5’-CCTCAGATGCTGCATATAAGCAGTTCCAAGTTGTAAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGTTCCAAGTTGTAGAGCCTGGGAGCTCTCTGG-3’。
所述内标是竞争性内标，其与HIV共用所述HIV-1-RNA的上下游引物；所述内标核酸被包装在病毒样颗粒内。
此外，本试剂盒含包括单个PCR反应容器中还进一步混合有PCR反应所需的其他试剂，如5×PCRbuffer，其中5×PCRbuffer由0.25mol/L的N,N-二羟乙基甘氨酸/氢氧化钾(Bicine/KOH),pH8.2；575mmol/L的乙酸钾(Potassiumacetate)和40％(v/v)甘油(glycerol)组成。
其余各组分的用量和浓度如表2所示。
表2
本实施例试剂盒中所述各种探针标记有不同的荧光基团。
使用本实施例的试剂盒在单管中检测多重靶核酸的实时荧光PCR方法的具体步骤如下：
(1)在所述单个PCR反应管中混合样本核酸，TthDNA聚合酶，H-TaqDNA聚合酶，Mn(OAc)2，dNTPs，内标，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的上下游引物和探针，以及内标探针，针对所述的各种探针标记有荧光基团和荧光淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的检测波长不同；
(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；具体PCR反应条件为表1所示。
(3)选择FAM通道检测HIV-1RNA，ROX通道检测HCV-RNA，CY5通道检测HBV-DNA；根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有HBV-DNA，HCV-RNA和HIV-1-RNA中的一种或几种病毒靶核酸存在于样品；若FAM通道测定Ct值＜45的样本为HIV阳性样本，ROX通道测定Ct值＜45的样本为HCV阳性样本，CY5通道测定Ct值＜45的样本为HBV阳性样本。
具体检测结果如表3-5所示。
表3.HBV各种基因型别结果
表4.HCV各种基因型别结果
表5.HIV-1各种基因型别结果
通过表3-5数据分析可知，本发明的单管中检测多重靶核酸的实时荧光PCR方法能够检测HIV、HCV、HBV三种常见血液传染病毒的各种基因型别，解决了目前单管检测不能区分HBV，HCV及HIV-1病毒种类的技术问题；血液中心不需要采购厂家的病毒种类检测试剂，降低了成本；解决了三管检测技术，限制检测通量的问题，使得试剂灵敏度提高，并且降低隐匿性乙肝潜在漏检风险；同时降低成本，提高仪器使用率，满足血液中心检测要求。

Claims (9)

1.单管中多重靶核酸的实时荧光检测PCR方法，每种病毒靶核酸分别是HBV-DNA，HCV-RNA和HIV-1-RNA，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在所述单个PCR反应管中混合样本核酸，TthDNA聚合酶，H-TaqDNA聚合酶，Mn(OAc)2，dNTPs，内标，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的上下游引物和探针，以及内标上下游引物和探针，针对所述的各种探针标记有荧光基团和荧光淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的检测波长不同；其中，
所述HBV-DNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:1
5’-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3’；
所述HBV-DNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:2
5’-AGAGTAACTCCACAGWAGCTCCAA-3’；
所述HBV-DNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:3
5’-TTGGGTGGCTTTGGGGCATGGA-3’；
所述HCV-RNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:4
5’-AGTGTCGTRCAGCCTCCAGG-3’；
所述HCV-RNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:5
5’-GGTGTACTCACCGGTTCCG-3’；
所述HCV-RNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:6
5’-CCCCCTCCCGGGAGAGCCAT-3’；
所述HIV-1-RNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:7
5’-CCTCAGATGCTGCATAWAAGCAG-3’；
所述HIV-1-RNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:8
5’-CCAGAGAGCTCCCAGGCTC-3’；
所述HIV-1-RNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:9
5’-TGTACTGGGTCTCTCTDGTTAGACCAGAT-3’；
所述内标探针的碱基序列为：SEQIDNO:10
5’-AACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACG-3’；
所述内标的扩增子序列的碱基序列为：SEQIDNO:11
5’-CCTCAGATGCTGCATATAAGCAGTTCCAAGTTGTAAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGTTCCAAGTTGTAGAGCCTGGGAGCTCTCTGG-3’；
(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；
(3)选择FAM通道检测HIV-1RNA，ROX通道检测HCV-RNA，CY5通道检测HBV-DNA；根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有HBV-DNA，HCV-RNA和HIV-1-RNA中的一种或几种病毒靶核酸存在于样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标是竞争性内标，其与HIV共用所述HIV-1-RNA的上下游引物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标包含在人造病毒颗粒内。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各种探针标记有不同的荧光基团。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：(1)预变性和酶激活，95℃，1分钟，循环数为1；(2)逆转录，60℃，30分钟，循环数为1；(3)cDNA预变性，95℃，1分钟，循环数为1；(4)变性，退火，延伸及荧光采集，循环数为45，其中变性95℃，15秒；退火，延伸及荧光采集，60℃，30秒；(5)仪器冷却，25℃，10秒，循环数为1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述根据荧光检测结果计算出的Ct值判断：FAM通道测定Ct值＜45的样本为HIV阳性样本，ROX通道测定Ct值＜45的样本为HCV阳性样本，CY5通道测定Ct值＜45的样本为HBV阳性样本。
7.一种单管中多重靶核酸的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括TthDNA聚合酶，H-TaqDNA聚合酶，Mn(OAc)2，dNTPs，内标，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的引物对和探针，以及内标探针，针对所述的各种探针标记有荧光基团和荧光淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的检测波长不同；其中，
所述HBV-DNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:1
5’-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3’；
所述HBV-DNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:2
5’-AGAGTAACTCCACAGWAGCTCCAA-3’；
所述HBV-DNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:3
5’-TTGGGTGGCTTTGGGGCATGGA-3’；
所述HCV-RNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:4
5’-AGTGTCGTRCAGCCTCCAGG-3’；
所述HCV-RNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:5
5’-GGTGTACTCACCGGTTCCG-3’；
所述HCV-RNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:6
5’-CCCCCTCCCGGGAGAGCCAT-3’；
所述HIV-1-RNA上游引物的碱基序列为：SEQIDNO:7
5’-CCTCAGATGCTGCATAWAAGCAG-3’；
所述HIV-1-RNA下游引物的碱基序列为：SEQIDNO:8
5’-CCAGAGAGCTCCCAGGCTC-3’；
所述HIV-1-RNA探针的碱基序列为：SEQIDNO:9
5’-TGTACTGGGTCTCTCTDGTTAGACCAGAT-3’；
所述内标探针的碱基序列为：SEQIDNO:10
5’-AACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACG-3’；
所述内标的扩增子序列的碱基序列为：SEQIDNO:11
5’-CCTCAGATGCTGCATATAAGCAGTTCCAAGTTGTAAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGTTCCAAGTTGTAGAGCCTGGGAGCTCTCTGG-3’。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述内标是竞争性内标，其与HIV共用所述HIV-1-RNA的上下游引物。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述内标核酸被包装在病毒样颗粒内。
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