CN101824491A

CN101824491A - 一种检测丙型肝炎病毒的试剂盒

Info

Publication number: CN101824491A
Application number: CN 201010174458
Authority: CN
Inventors: 孙国明
Original assignee: TRUEHIGH TECH Co Ltd
Current assignee: TRUEHIGH TECH Co Ltd
Priority date: 2010-05-18
Filing date: 2010-05-18
Publication date: 2010-09-08

Abstract

本发明涉及一种用纳米金颗粒检测丙型肝炎病毒DNA经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明结合环介导等温核酸扩增技术和生物纳米技术，提高生物分子检测的灵敏度，是一种操作简单、快速、准确、不需要专业仪器设备的方法，可以广泛应用于家庭诊断、临床诊断、传染病控制、环境监测、检验检疫，生物技术等领域的高灵敏度的丙型肝炎病毒检测。本发明试剂盒包括两部分：(1)标记有可以识别丙型肝炎病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒；(2)可以扩增待检测样品中的丙型肝炎病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的丙型肝炎病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。

Description

一种检测丙型肝炎病毒的试剂盒

一、技术领域

本发明涉及一种用纳米金颗粒检测丙型肝炎病毒DNA或RNA经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，属于生物检测技术领域。

二、背景技术

对基因(DNA)及其转录产物(RNA)的高灵敏性、高特异性、简单、快速的检测，对于疾病的早期诊断和治疗以及在在卫生防疫、环境监测、检验检疫等领域都具有十分重要的意义。以往在这方面较为准确灵敏的检测方法有荧光标记法、放射性标记等方法，这些方法都需要复杂的操作和特殊的设备，应用范围很窄。1993年PE公司的Dr.Kary B.Mullis发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR。随后PCR技术大规模的应用于生物科研和临床治疗中，对DNA的检测进入了新的时代，Dr.Mullis为此还获得了1993年的诺贝尔化学奖。虽然PCR方法具有快速、灵敏、准确性高、操作较简单等优点，但由于其反应进行和产品DNA的检测需要特殊的仪器，PCR技术的使用一直被限定在专业的实验室和医院里。

2001年日本荣研化学株式会社研制出了一种新型DNA扩增方式，环介导等温核酸扩增技术(LAMP)可以在恒温条件下实现DNA的高效快速扩增，该方法反应条件简单，DNA扩增效率高，因此在核酸检测方面具有明显优势。但是对LAMP扩增制备的DNA产物使用常规的检测方法，如电泳法，荧光染料法等，均无法排除LAMP扩增所带来的假阳性问题，而且需要特殊的仪器，因此限制了LAMP技术的实际应用。

1974年Golafield首先报告输血后非甲非乙型肝炎。1989年美国科学家MichaelHoughton和他的同事们终于找到了病毒的基因序列，克隆出了丙肝病毒，并命名本病及其病毒为丙型肝炎(Hepatitis C)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus：HCV)。由于HCV基因组在结构和表型特征上与人黄病毒和瘟病毒相类似，将其归为黄病毒科HCV。丙型肝炎的传染源主要为急性临床型和无症状的亚临床病人，慢性病人和病毒携带者。一般病人发病前12天，其血液即有感染性，并可带毒12年以上。HCV主要血源传播，国外30-90％输血后肝炎为丙型肝炎，我国输血后肝炎中丙型肝炎占1/3。此外还可通过其他方式如母婴垂直传播，家庭日常接触和性传播等。临床丙型肝炎病人50％可发展为慢性肝炎，甚至部分病人会导致肝硬及肝细胞癌。其余约半数病人为自限性，可自动康复。目前针对丙型肝炎病毒缺乏简单、快速、便于使用和成本低廉的检测方法。

三、发明内容

本发明的目的是提出一种用纳米金颗粒检测丙型肝炎病毒经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，从而判定丙型肝炎病毒的存在与否。本发明试剂盒结合环介导等温核酸扩增技术和生物纳米技术，提高生物分子检测的灵敏度，是一种操作简单、快速、准确、成本低廉、不需要专业仪器设备的方法，可以广泛应用于家庭诊断、临床诊断、传染病控制、环境监测、检验检疫，生物技术等领域的高灵敏度的丙型肝炎病毒病毒检测。

本发明试剂盒包括两部分：

1.标记有可以识别丙型肝炎病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒；

2.可以扩增待检测样品中的丙型肝炎病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的丙型肝炎病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。

该试剂盒的工作原理为：

1.纳米金颗粒标记有能识别丙型肝炎病毒特定序列的分子探针，分子探针被固定在纳米金颗粒的表面。

2.待检测样品中的丙型肝炎病毒DNA分子或丙型肝炎病毒RNA经环介导等温核酸扩增技术大量复制或先经逆转录过程后大量复制，丙型肝炎病毒的目标片段被放大10⁹倍，产生的扩增产物DNA具有多重重复序列。

3.混合纳米金颗粒和环介导等温核酸扩增体系，丙型肝炎病毒经环介导等温核酸扩增技术以后的产物DNA与纳米金颗粒上能识别丙型肝炎病毒特定序列的分子探针杂交。

4.纳米金颗粒沿环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子链形成聚集体(如附图所示)，进而引发纳米金颗粒聚集处(例如溶液中、固体表面等)的颜色变化，依据颜色变化可以判断待测样品是否具有丙型肝炎病毒DNA或RNA。

四、附图说明

标记有分子探针的纳米金颗粒与丙型肝炎病毒经环介导等温核酸扩增技术以后的产物DNA杂交示意图，纳米金颗粒沿环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子链形成聚集体。

五、具体实施方式

本发明试剂盒包括2管溶液，一管中是标记有可以识别丙型肝炎病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒溶液50μl，一管中是250μl可以扩增待检测样品中的丙型肝炎病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的丙型肝炎病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。

纳米金颗粒溶液中含有直径为20nm的纳米金颗粒，浓度为1.2nM，纳米金颗粒表面标记有巯基修饰的DNA探针。

环介导等温核酸扩增体系成分如下：0.2μM F3和B3引物，1.6μM FIP和BIP引物，0.4Mbetaine(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，10mM MgSO₄，1.4mM dNTPs，1×ThermoPol reactionbuffer(New England Biolabs，Ipswich，MA)，80 U Bst DNA polymerase(New England Biolabs)，6.25 U AMV逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)。

巯基修饰的DNA探针序列

5′-GCTGTTTGCCGGCGTCAAAAAAAA-SH-3′

引物序列

丙型肝炎病毒的F3引物

5′-GGACATGATCGCTGGTGC-3′

丙型肝炎病毒的B3引物

5′-CTGCCGTTGGTGTTGACC-3′

丙型肝炎病毒的FIP引物

5′-ACCACTAGGACCTTCGCCCAGGAGTCTTAGCGGGCATAGC-3′

丙型肝炎病毒的BIP引物

5′-CGGGGGCATAGTCAGCAAGACGCTGGACATCCTGCTTGG-3′

操作过程如下

1.向装有环介导等温核酸扩增体系的管中加入10μl提取的核酸或者血液样品。

2.将装有混合物的管放入60℃的水浴中30分钟。

3.再向步骤2中的管中加入纳米金颗粒溶液，此时混合后的溶液为红色。

4.60℃水浴反应15分钟。

观察反应后管中溶液的颜色，溶液保持红色不变则不含有丙型肝炎病毒感染特异性RNA或丙型肝炎病毒DNA；如果溶液变为浅紫色，则判定样本中含有丙型肝炎病毒感染特异性的RNA或丙型肝炎病毒DNA。此种情况下，如果样品是血液样品，那么提供血样的人已经被丙型肝炎病毒所感染。

序列表

<110>天津朝海科技有限公司

<120>一种检测丙型肝炎病毒的试剂盒

<130>Demo

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>Hepatitis C virus

<400>1

gctgtttgcc ggcgtcaaaa aaaa 24

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>Hepatitis C virus

<400>2

ggacatgatc gctggtgc 18

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>Hepatitis C virus

<400>3

ctgccgttgg tgttgacc 18

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>Hepatitis C virus

<400>4

accactagga ccttcgccca ggagtcttag cgggcatagc 40

<210>5

<211>39

<212>DNA

<213>Hepatitis C virus

<400>5

cgggggcata gtcagcaaga cgctggacat cctgcttgg 39

Claims

1.一种用纳米金颗粒检测丙型肝炎病毒经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下部分：(1)标记有可以识别丙型肝炎病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒；(2)可以扩增待检测样品中的丙型肝炎病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的丙型肝炎病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。

2.根据权利要求1，该试剂盒的工作原理为(1)用环介导等温核酸扩增技术扩增待检测样品中的丙型肝炎病毒DNA或先经过逆转录过程后用环介导等温核酸扩增技术扩增待检测样品中的丙型肝炎病毒RNA；(2)纳米金颗粒探针与环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交；(3)杂交引发纳米金颗粒聚集，导致纳米金颗粒聚集处颜色改变，以此判断待检测样品是否含有丙型肝炎病毒DNA或RNA。

3.根据权利要求1，纳米金颗粒探针包括两个部分，一是纳米尺度的金颗粒，另一部分是固定在纳米金颗粒表面的分子探针，该探针可以识别丙型肝炎病毒的特定序列。

4.根据权利要求2，待检测样品中环介导等温核酸扩增技术的扩增对象可以是丙型肝炎病毒DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。

5.根据权利要求2，纳米金颗粒探针和环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交可以和环介导等温核酸扩增反应在相同反应条件下、相同反应容器中同时进行。

6.根据权利要求2，纳米金颗粒探针和环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交可以发生在溶液中或者固体表面。

7.根据权利要求2，纳米金颗粒探针与环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交引发溶液或固体表面颜色改变，这种变化可由肉眼直接判断，也可利用分光光度计等光学仪器检测。

8.根据权利要求3，分子探针是指可以识别环介导等温核酸扩增技术产物DNA的功能分子，这些分子包括DNA，RNA，PNA，蛋白质，化学分子。

9.根据权利要求4，相同反应条件包括但不限于：溶液组成，成分浓度，PH值，温度，反应时间等。