CN1861807A - 一种用于检测乙型肝炎病毒的生物用品 - Google Patents

Abstract

本发明是用于检测乙型肝炎病毒的生物用品，其为TagMan检测探针、一对针对乙型肝炎病毒C基因的特异性PCR引物和试剂盒，引物P1、P2和探针的核酸序列分别为5′－GGAGGC TGT AGG CAT AAA TTG GTC TG－3′、5′－CCA AGG CAC AGC TTG GAG GCT TGA A－3′、5′－GAG ATG ATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG－3′；试剂盒内装有所述探针和引物P1、P2。本发明可检测出低于30个病毒DNA的拷贝数的核酸，这有助于早期诊断和了解乙肝患者传染性，以及对临床HBV感染的诊断、治疗和疗效的观察。

Description

一种用于检测乙型肝炎病毒的生物用品

技术领域

本发明涉及一种用于检测乙型肝炎病毒的生物用品。

背景技术

目前定量检测HBV DNA的拷贝数(copy)是衡量乙肝传染性的最精确的指标，是确定HBV感染不同复制状态的非常有价值的检测手段。对于HBV DNA的检测方法主要有斑点杂交法、bDNA信号扩增技术、竞争PCR法、PCR-ELISA法等，但它们由于灵敏度低、试剂成本高或是易污染等原因，使其应用价值受到很大限制；而荧光定量PCR方法则由于其灵敏度高已广泛用于乙型肝炎病毒的定量检测，但现已开发的荧光定量PCR检测试剂盒绝大多数都是基因常规PCR加荧光染料的策略，在检测的灵敏度和特异性方面有很大的缺陷，本发明的荧光定量PCR检测中通过采用特异性的TaqMan荧光检测探针，使检测的灵敏度及特异性获得显著提高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种用于检测乙型肝炎病毒的生物用品，以便于对乙肝患者进行早期诊断和对临床HBV感染的诊断。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

本发明提供的用于检测乙型肝炎病毒的生物用品，具体是采用TagMan检测探针和一对针对乙型肝炎病毒C基因的特异性PCR引物，其中：采用一对针对乙型肝炎病毒C基因的特异性PCR引物，引物P1为5′-GGA GGC TGT AGG CAT AAA TTG GTC TG-3′，其核酸序列长度为26个碱基，引物P2为5′-CCA AGG CAC AGC TTG GAG GCT TGA A-3′，其核酸序列长度为25个碱基，扩增片断长度为112个碱基；采用的TagMan检测探针，其核酸序列为5′-GAG ATG ATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG-3′，其核酸序列长度为33个碱基。

本发明提供的用于检测乙型肝炎病毒的生物用品是试剂盒，该试剂盒内设有上述的检测乙型肝炎病毒的引物、探针。

本发明与现有技术相比，具有以下显著效果：对特异性PCR引物扩增出的产物通过特异性的TaqMan荧光探针进行检测，从而能够显著提高检测乙型肝炎病毒的灵敏度及特异性，其灵敏度可检测出低于30个病毒DNA的拷贝数的极微量的核酸，而常规方法的灵敏度则是约为数百个拷贝。这有助于对体检中乙肝大三阳、小三阳部分病人进行HBV DNA测定，并了解乙肝患者传染性及进行早期诊断，和对临床HBV感染的诊断，治疗方案的选择及疗效的观察。

附图说明

图1是重组质粒经EcoR I单酶切和PCR后，经0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测到约1.8Kb片段的示意图。

图2是用TaqMan探针进行荧光定量PCR检测的标准曲线。

图3是用EvaGreen荧光染料进行两对引物荧光定量PCR检测的标准曲线。

图4是用EvaGreen荧光染料进行单对引物荧光定量PCR检测的标准曲线。

具体实施方式

本发明利用TaqMan探针技术和荧光染料EvaGreen技术两种方法，分别建立了新的HBVDNA荧光实时定量PCR检测系统，由此提供一种用于检测乙型肝炎病毒的生物用品，该生物用品是一种用荧光定量检测乙型肝炎病毒的引物、探针及试剂盒。

下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。

一.用荧光定量检测乙型肝炎病毒的引物、探针

1.采用一对针对乙肝病毒C基因的特异性PCR引物：

引物P1为5′-GGA GGC TGT AGG CAT AAA TTG GTC TG-3′，其核酸序列长度为26个碱基，引物P2为5′-CCA AGG CAC AGC TTG GAG GCT TGA A-3′，其核酸序列长度为25个碱基，扩增片断长度为112个碱基；采用的TagMan检测探针，其核酸序列为5′-GAG ATGATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG-3′，其核酸序列长度为33个碱基。

上述的引物中，可选取引物P1核酸序列中的5′-GGA GGC TGT AGG CAT AAA TTG G-3′作为引物P3，该序列长度为22个碱基(22bp)；可选取引物P2核酸序列中的5′-GCA CAGCTT GGA GGC TTG A-3′作为引物P4，该序列长度为19个碱基(19bp)，扩增片断长度为107个碱基(107bp)。荧光染料技术的引物有两对，分别为针对S区(P5、P6)和C区基因(P7、P8)，P5：5′-TGC TGG TGG CTC CAG TTC AGG-3′(21bp)，P6：5′-GAA GAT GAG GCA TAG CAGCAG G-3′(22bp)，P7：5′-ACT TCG CTT CAC CTC TGC ACG-3′(21bp)，P8：5′-AAG GCACAG CTT GGA GGC TTG-3′(21bp)；扩增及克隆标准品所用的引物为P5和P8。

上述的TagMan检测探针，其核酸序列为5′-ATG ATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG-3′，该序列长度为30个碱基(30bp)。

上述引物及探针的设计原理为：经过对Genbank中已有的乙肝病毒基因组序列进行序列比对之后，确定序列保守区域，然后用Primer Express 2.0软件在这些保守区域中确定前述“一.用荧光定量检测乙型肝炎病毒的引物、探针”中所列的引物及探针序列。本实例中所用的探针和引物可由上海基康生物工程技术有限公司合成。

2.相关试剂：

质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自武汉博大泰克公司；Taq DNA聚合酶、dNTP及10xbuffer购自Biostar公司；高保真KOD酶购自ToYoBo公司；pGEM-T Easy载体克隆试剂盒购自Promega公司；20xEvaGreen购自Biotium公司；乙肝病毒ELISA检测试剂盒和乙肝病毒荧光定量试剂盒分别由上海科华公司和深圳匹基公司提供，实验操作和判断结果严格按厂家提供的说明书进行。

3.所用仪器：

荧光定量PCR扩增仪型CFD-3200，采用option监控软件，冷冻离心机，37℃恒温培养箱，振荡培养箱等。

4.标准品的制备及检测方法：

血清HBV DNA的提取：采用直接煮沸法，具体为直接取50ul血清入1.5ml Eppendorf管中煮沸10分钟，取出放置4℃ 10小时，10000r/min离心5分钟，取上清液2ul于PCR反应管内，瞬时离心后即可上机扩增。

标准品的克隆：用高保真KOD酶扩增目的PCR产物，经胶回收试剂盒回收，用TaqDNA聚合酶与pGEM-T Easy载体经T4DNA连接酶连接，电转入大肠杆菌DH5α，在含X-gal，IPTG，氨苄青霉素的LB平板上挑选白斑，接入液体LB培养基过夜培养后用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，经EcoR I酶切电泳，PCR鉴定和DNA测序证实目的DNA片段后确定为阳性质粒。

荧光定量PCR反应条件的探讨：对PCR反应参数及引物和探针、染料浓度进行探讨，以期找到曲线形状好、无非特异性扩增、检测灵敏度高、重复性好的最佳反应条件。

定量标准曲线的建立：将鉴定好的阳性质粒测定吸光值，计算拷贝数/ml，方法为拷贝数＝(质量÷分子量)×6.0×10²³，然后进行10倍倍比稀释成10¹⁰-10⁰拷贝数/ml浓度梯度，在最佳反应条件下上定量PCR仪扩增，反应结束后仪器会自动绘制标准曲线。

灵敏度检测：选择1份强阳性样本含量为10⁸拷贝数/ml，按5倍倍比稀释并检测，确定灵敏度，并与匹基试剂盒检测结果对比。

重复性实验：选3份不同含量的样本，每份样本从提取开始重复3次，计算各个检测方法的重复性，并与匹基试剂盒检测结果对比。

质量控制：为增加数据的可信度，每次实验均设置空白对照管，已知样本量靶序列的阳性对照管及阴性对照管。

结果处理：调整基线以试剂空白和阴性管不出现阳性为准，与基线的交点的循环次数(Ct)值为横坐标，HBV DNA浓度的对数值为纵坐标，制作标准曲线，利用待测标本的Ct值求出相应的HBV DNA含量。

数据分析：定量结果对数值计算HBV DNA平均拷贝数(均数±标准差)，阴性结果不参与平均值计算。采用几何均数t检验分析差异的显著性，以P＜0.05差异具有显著意义，P＜0.01差异具有高度显著意义。

5.检测原理

TaqMan探针荧光定量PCR原理：TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，探针的5′端标记有报告基团(Reporter，R)-FAM，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。

EvaGreen荧光定量PCR原理：EvaGreen是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱，引物二聚体的荧光信号可以通过熔解曲线来消除。因此，荧光信号强度与不断生成的产物成正比。

6.检测结果

重组质粒的鉴定：重组质粒经EcoR I单酶切和PCR后，经0.7％的琼脂糖凝胶电泳得到约1.8Kb的片断(图1)，测序结果也显示插入片断与预期序列完全一致。图1中：①重组质粒用EcoR I单酶切鉴定。②DNA maker ③ 2000 DNA maker。④重组质粒PCR鉴定。⑤乙肝病毒基因组PCR扩增产物。⑥阴性对照。

TaqMan探针荧光定量PCR体系：经多组试验确定最佳反应体系为50ul，包括0.4uM引物P3、P4，0.12uM TaqMan探针，2ul模板提取液。扩增条件为50℃×2min；95℃×2min；95℃×15sec、60℃×1min，45个循环；荧光信号收集设在60℃。

EvaGreen荧光定量PCR体系：两对引物(P5+P6+P7+P8)最佳反应体系为50ul，0.32uM引物P5、P6，0.20uM引物P7、P8和0.02xEva Green；单对引物(P7+P8)最佳反应体系为50ul，包括0.24uM引物P5、P6和0.02xEva Green。扩增条件均为94℃×2min；94℃×15sec、58℃×15sec、72℃×20sec、82℃×3sec、读板，45个循环；72℃×5min；16℃×5sec；熔解曲线绘制从16℃到94℃之间，每隔0.2℃读板一次，每次持续2sec。荧光信号收集设在82℃，因产物的熔解度约为81℃。

定量标准曲线的建立：图2、图3和图4分别为TaqMan探针、EvaGreen双对引物和单对引物荧光定量PCR体系的标准曲线，起始模板分别在10¹⁰-10³、10¹⁰-10⁵和10¹⁰-10⁴拷贝数/ml时线性较好，相关系数分别为0.997、0.999和0.996。

7.方法学评价：

(1)灵敏度分析：见表1，不难看出，TaqMan探针的灵敏度最高(28拷贝数/ml)，EvaGreen灵敏度较低(10³拷贝数/ml)，匹基试剂盒的灵敏度为10²拷贝数/ml。

(2)重复性分析：据3次结果计算出均数、标准差S及变异系数CV(见表2)，TaqMan探针、EvaGreen双对引物、单对引物及匹基试剂盒的平均变异系数分别为2.57％、0.77％、1.23％和1.33％。

(3)临床检测：共检测标本30例，结果见表3和表4。从表3可以看出只有新建立的TaqMan探针技术可以检出极微量的HBV DNA含量(＜100拷贝数/ml)。

表4中：①sAg(+)eAg(+)cAb(+)8例；②sAg(+)eAb(+)cAb(+)7例；③对照7例；*和#分别组内两两比较，P＞0.05；*和#作组间两两比较，P＜0.01。

8.结论

乙肝病毒的定性和定量检测是病毒复制最直接和可信的指标，特别是定量检测血清中HBV DNA含量对乙型肝炎的诊断，特别是监测患者病情、评价抗病毒疗效以及指导用药方面具有重要意义。本文建立了两种检测HBV DNA的荧光定量PCR方法，并通过与匹基公司现有的乙肝荧光定量诊断试剂盒检测结果对比和实验室方法学评价，充分证明了其检测的可信度。同时，使用重组HBV质粒作为定量标准品具有稳定性好、重复性好和扩增效率高等优点。本发明建立的TaqMan探针技术具有线性范围宽(10¹⁰-10³拷贝数/ml)、相关性好(相关系数为0.997)、重复性好(平均变异系数分别为2.57％)、特别是灵敏度高(28拷贝数/ml)。EvaGreen是荧光定量PCR的专用荧光指示剂，其荧光信号强于SYRB Green I，且可用于任何一台荧光定量PCR仪上进行PCR反应可兼容原有SYRB Green I的条件设置。为提高其检测的准确度，我们特意设计了两对引物在同一个PCR体系中反应，并作了单引物的对比。EvaGreen双对引物体系的标准曲线起始模板在10¹⁰-10⁵拷贝数/ml时线性较好，相关系数为0.999；单对引物体系的标准曲线起始模板在10¹⁰-10⁴拷贝数/ml时线性较好，相关系数为0.996。重复性均较好，平均变异系数分别为0.77％和1.23％；但灵敏度相对较低，仅为10³拷贝数/ml。通过对比分析，可以看出TaqMan探针技术特异性好；循环条件简单，只需两温PCR循环即变性，退火、延伸及检测可一步完成(温度为60℃)；特别是灵敏度高，可检测到极微量的HBV DNA，更有利于进行早期诊断及了解乙肝患者传染性，和对临床HBV感染的诊断，治疗方案的选择及疗效的观察。与TaqMan探针技术相比，EvaGreen的灵敏度较低，循环条件更复杂，需采用四温PCR循环即变性、退火、延伸及检测四个温度，为减少引物二聚体的产生和影响，还须根据熔解曲线进行分析，但其引物设计较简单，成本也相对较低。通过对临床标本的检测比较，TaqMan探针具有更高的检测水平，而EvaGreen双对引物体系和单对引物体系之间则没有显著性差异(P＞0.05)。所以，对于HBV DNA的检测最好采用TaqMan探针法。当然，对乙肝的诊断最好结合ELISA法和TaqMan探针法同时作定性和定量检测。

二.用荧光定量方法检测乙型肝炎病毒的试剂盒

1.在乙型肝炎病毒检测试剂盒内，设有上述的“用荧光定量检测乙型肝炎病毒的引物、探针”。

2.乙型肝炎病毒检测试剂盒的制备及试剂盒的使用：可采用或参考现有的其它乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒的方法进行制备和使用。

试剂盒使用的简要步骤包括：1).乙型肝炎病毒核酸的提取；2).用实例中所描述的TaqMan探针荧光定量PCR体系进行扩增，荧光定量检测的结果用荧光定量PCR仪直接读出。

三.附表：

表1                                 灵敏度分析

稀释度	TaqMan探针	EvaGreen双对引物	EvaGreen单对引物	匹基试剂盒
					1∶1	2.72×108	1.09×108	1.23×108	1.67×108
1∶5	3.15×107	5.70×107	1.96×107	6.00×107
					1∶25	6.70×106	7.91×106	9.32×106	9.46×106
1∶125	1.28×106	1.09×106	2.76×106	1.55×106
					1∶625	2.56×105	4.49×105	5.65×105	2.76×105
1∶3125	4.35×104	4.90×104	6.38×104	8.42×104
					1∶15625	1.01×104	1.07×104	5.11×104	1.90×104
1∶78125	2.14×103	4.65×103	1.26×103	9.92×103
					1∶390625	4.19×102	None	None	3.25×102
1∶1953125	8.94×101	None	None	None
					1∶3906250	3.70×101	None	None	None
1∶7812500	2.81×101	None	None	None
					1∶9765625	None	None	None	None

表2                        重复性分析

方法	样本	均数(log)	S(log)	CV(log)
					TaqMan探针	1	7.33	0.25	0.034
2	6.09	0.09	0.014
				3		5.76	0.17	0.029
EvaGreen双对引物	1	7.81	0.15						0.019
				2	6.87	0.01	0.001
	3	5.40	0.02					0.003
				EvaGreen单对引物	1	7.95	0.02		0.003
2	6.33	0.15	0.023
					3	5.79	0.06	0.011
匹基试剂盒	1	7.53	0.10						0.014
				2	6.39	0.09	0.014
	3	5.92	0.07					0.012

                                                   表3：部分血清HBV DNA检测结果

样本	ELISA					HBV DNA(拷贝数/ml)
										sAg	sAb	eAg	eAb	cAb	TaqMan探针	EvaGreen双对引物	EvaGreen单对引物	匹基试剂盒
	1	弱阳	阴性	阴性	阴性	阴性	0	0	0										0
2										弱阳	阴性	阴性	阴性	阴性	68.98	0	0	0
	3	阳性	阴性	阴性	阴性	阳性	88.29	0	0										0
4										弱阳	阴性	阴性	阴性	阳性	9.97×102	0	0	0
	5	阳性	阴性	阳性	阴性	阴性	9.34×107	6.72×105	4.18×106										2.14×106
6										阴性	阳性	阴性	阴性	阴性	0	0	0	0
	7	阴性	阴性	阴性	阴性	阳性	0	0	0										0
8										阴性	弱阳	阴性	阴性	阳性	2.65×105	9.91×103	3.60×104	3.27×104

                 表4：荧光定量PCR与ELISA法检测结果比较

ELISA		①	②	③
					TaqMan探针	阳性率(％)	100	42.9	0
DNA拷贝对数	6.98±0.82*	3.26±1.37#	-
				EvaGreen双对引物		阳性率(％)	87.5	28.6	0
DNA拷贝对数	5.16±1.25*	3.56±0.20#	-
					EvaGreen单对引物	阳性率(％)	87.5	28.6	0
DNA拷贝对数	6.71±1.08*	3.65±0.32#	-
				匹基试剂盒		阳性率(％)	100	28.6	0
DNA拷贝对数	6.18±0.83*	3.57±0.47#	-

Claims (6)

1.一种用于检测乙型肝炎病毒的生物用品，其特征在于该生物用品是采用TagMan检测探针和一对针对乙型肝炎病毒C基因的特异性PCR引物，其中：引物P1为5′-GGA GGC TGTAGG CAT AAA TTG GTC TG-3′，其核酸序列长度为26个碱基，引物P2为5′-CCA AGG CACAGC TTG GAG GCT TGA A-3′，其核酸序列长度为25个碱基，扩增片断长度为112个碱基；采用的TagMan检测探针，其核酸序列为5′-GAG ATG ATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG-3′，其核酸序列长度为33个碱基。

2.根据权利要求1所述的生物用品，其特征在于：选取引物P1核酸序列中的5′-GGA GGCTGT AGG CAT AAA TTG G-3′作为引物P3，该序列长度为22个碱基；选取引物P2核酸序列中的5′-GCA CAG CTT GGA GGC TTG A-3′作为引物P4，该序列长度为19个碱基，扩增片断长度为107个碱基。

3.根据权利要求1所述的生物用品，其特征在于：TagMan检测探针的核酸序列为5′-ATG ATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG-3′，该序列长度为30个碱基。

4.一种用于检测乙型肝炎病毒的生物用品，其特征在于：生物用品是试剂盒，该试剂盒内设有TagMan检测探针和一对针对乙型肝炎病毒C基因的特异性PCR引物；特异性PCR引物中，引物P1为5′-GGA GGC TGT AGG CAT AAA TTG GTC TG-3′，其核酸序列长度为26个碱基，引物P2为5′-CCA AGG CAC AGC TTG GAG GCT TGA A-3′，其核酸序列长度为25个碱基，扩增片断长度为112个碱基；采用的TagMan检测探针，其核酸序列为5′-GAG ATGATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG-3′，其核酸序列长度为33个碱基。一种用荧光定量检测乙型肝炎病毒的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的生物用品，其特征在于：特异性PCR引物中，选取引物P1核酸序列中的5′-GGA GGC TGT AGG CAT AAA TTG G-3′作为引物P3，该序列长度为22个碱基；选取引物P2核酸序列中的5′-GCA CAG CTT GGA GGC TTG A-3′作为引物P4，该序列长度为19个碱基，扩增片断长度为107个碱基。

6.根据权利要求4所述的生物用品，其特征在于：采用的TagMan检测探针，其核酸序列为5′-ATG ATT AGG CAG AGG TGA AAA AGT TGC ATG-3′，该序列长度为30个碱基。

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