CN102816866B

CN102816866B - 一种检测肠道病毒rna的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN102816866B
Application number: CN201210315930.7A
Authority: CN
Inventors: 戴立忠; 邓中平; 黄河
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2032-08-30
Also published as: CN102816866A

Abstract

本发明提供一种提取纯化和检测EV RNA（肠道病毒RNA）的方法，并提供一种相应的检测EV RNA的试剂盒。本发明提供的试剂盒中包括含磁珠的RNA提取溶液、和含用于靶多核苷酸扩增的上游引物EV-F、下游引物EV-R和用于靶多核苷酸检测的探针EV-P的PCR反应液。本发明提供的试剂盒可检测出EV RNA，包括EV71、CA16及其他常见肠道病毒类型，但不能检测出非EV病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性；另外，本发明选择了吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性，其检测下限即灵敏度可达200copies/ml，检测范围（试剂盒的定量线性范围）为2.00E+02~2.00E+08copies/ml。

Description

一种检测肠道病毒RNA的方法及试剂盒

技术领域

本发明提供一种提取纯化和检测肠道病毒（Enterovirus，EV）RNA的方法，本发明中EV RNA包括肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）、柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus A16，CA16）及其他常见肠道病毒类型，并提供一种相应的检测EV RNA的试剂盒。

背景技术

实时荧光PCR技术（FQ-PCR）把PCR、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行。实时荧光PCR技术与其它检测技术相比具有以下优势：（1）与免疫学检测比较，其具有更高的灵敏度，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以检测出来。（2）根据各种病原体独特的保守基因序列设计引物，能够保证PCR反应的高度特异性，避免交叉反应。（3）能对病毒进行定量检测，可反映出患者体内病原体拷贝数的高低和复制情况。定量检测有助于判断病原体感染与疾病发生和发展的关系，探讨药物对病原体的作用，了解感染疾病病人用药后病情的变化情况。这对理解发病机制和预测抗病毒治疗的有效性十分关键。（4）可扩大检测人群的范围，适用于大规模的流行病调查。对如手足口病这类自然感染率极高的病原微生物尤其适用。（5）将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤。（6）全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染。（7）实时检测技术可连续不断的检测PCR过程中荣耀信号的变化，避免了传统PCR的“平台期效应”，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值算出，准确性和灵敏性都有提高。

目前，国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术检测EV-RNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的EV-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒存在很多不足之处：1）检测灵敏度低，约在1000copie/ml左右；检测范围窄，一般在1.00E+03copie/ml~1.00E+07copie/ml之间，对于临床高值（大于5.00E+07copie/ml）和低值（小于1.00E+03copie/ml）的样本无法检测；2）无法覆盖肠道病毒的所有病毒类型，存在一定的漏检现象；3）酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；4）无法有效去除样本中的PCR抑制物（如全血、痰液等），体系中一般没有阳性内对照（即内标），无法预防假阴性；5）国外试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。

磁珠（免疫磁珠）法是近年发展迅速且被广泛应用的一种核酸提取方法，其优于传统方法的特点可以总结为以下几点：其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂；提取纯化的核酸质量好、产量高；提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化；这些优点使其有替代其它核酸提取和纯化方法的发展趋势。但在现有技术中，并未见有磁珠法用于提取纯化和检测EV RNA的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于解决现有肠道病毒荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种RNA提取得率高、检测灵敏度高、检测范围宽而准确的EV核酸荧光PCR检测试剂盒，可以对咽拭子、粪便等未知样本中的EV-RNA进行快速、准确检测，检测结果可用于EV感染的辅助诊断。

本发明用磁珠法提取样本核酸，采用实时荧光定量PCR技术，以EV基因组的高度保守区域为扩增靶目标，设计特异性引物及TaqMan探针，在实时荧光PCR仪上通过PCR扩增对EV RNA进行定性检测。

本发明提供一种检测EV RNA的方法，其中使用磁珠法提取和纯化EV RNA。

在本发明中，所述磁珠是生物科学和纳米材料科学二者结合的产品。它运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠；该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。它利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能将血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的DNA和RNA分离出来，可应用于临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。在本发明中，所述磁珠可经商购获取。

在优选的情况下，本发明结合使用磁珠法和实时荧光PCR技术提取纯化和检测EVRNA。

具体的，在一个实施方式中，本发明所述方法包括如下步骤，步骤A，裂解病毒：每支离心管加入含磁珠的RNA提取溶液和待测样本，混匀后离心；EV阴性对照和EV阳性对照参照与待测样本相同的方法作RNA提取和纯化处理；步骤B，磁珠吸附核酸：每管加入含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠的RNA提取溶液Ⅱ，混匀后静置；步骤C，去除杂质：经离心后将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，再缓慢将溶液吸出；步骤D，洗涤：每管加入含曲拉通和氯化钠的RNA提取溶液Ⅲ和含矿物油的RNA提取溶液Ⅳ，混匀后离心，将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，静置分层后将液体吸出丢弃；步骤E，RNA洗脱：加入含Tris-HCl和EDTA的RNA洗脱液将离心管壁上的磁珠洗脱到管底，混匀并静置后将离心管再次置于磁珠分离器上，然后将从磁珠上洗脱下来的RNA吸至新的灭菌离心管中；步骤F，荧光PCR分析：将洗脱磁珠后的待测样本RNA、EV阴性对照、EV阳性对照中均加入含PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物、探针的PCR反应液和含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶的EV酶混合液，在荧光定量PCR扩增仪上进行PCR反应，并分析结果。

本发明还提供一种检测EV RNA的试剂盒，包括含磁珠的RNA提取溶液、和含用于靶多核苷酸扩增的上游引物EV-F、下游引物EV-R和用于靶多核苷酸检测的探针EV-P的PCR反应液；其中，上游引物EV-F的碱基序列为5’-CCC TGA ATG CGG CTA ATC CTA-3’；下游引物EV-R的碱基序列为5’-CAC GGA CAC CCA AAG TAG TCG G-3’；探针EV-P的碱基序列为5’FAM-CGC TGC AGA GTT GCC CGT TAC GAC-BHQ13’。

本发明中EV RNA包括EV71、CA16及其他常见肠道病毒类型，在本发明的试剂盒中，发明人寻找出EV基因组的通用、保守序列而设计出用于靶多核苷酸扩增和检测的引物和探针序列，为EV RNA的实时荧光PCR检测检测提供了保障。

在本发明所述试剂盒中，优选的是，所述试剂盒中还包括内标，所述内标即为一段长为92碱基对的人工合成DNA序列插入pUC18T载体的重组体，即质粒，其碱基序列为5’-ATCTTGCCACGAACGCTAAACGGCACTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGATCAACGCTCGAGTGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。

在本发明一个具体实施方式中，所述试剂盒中包括如下组分，①RNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和100~400μg/ml的磁珠；②RNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠；③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化钠；④RNA提取溶液Ⅳ：含矿物油；⑤RNA洗脱液：含Tris-HCl和EDTA；⑥内标：如上所述的可选择使用的内标；⑦PCR反应液：包括5×PCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物EV-F与EV-R，用于靶多核苷酸检测的探针EV-P，用于内标扩增和检测的上、下游引物IC-F与IC-R和探针IC-P；⑧EV酶混合液：含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶；⑨EV阳性对照：标定已知浓度的慢病毒，其浓度为1.00~5.00E+05 copie/ml；和⑩EV阴性对照：灭菌生理盐水。

在本发明的上述试剂盒中，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物EV-F与EV-R和用于靶多核苷酸检测的探针EV-P的序列是本发明的核心；而用于内标扩增的上、下游引物IC-F与IC-R和用于内标检测的探针IC-P均可以据内标的碱基序列而任意选择。在本发明中，例如，上游引物IC-F为：5’-ATCTTGCCACGAACGCTAAACGGCA-3’；下游引物IC-R为：5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’；探针IC-P为：5’HEX-CTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGATC-BHQ13’。

在上述试剂盒中，更为优选的是，①RNA提取溶液Ⅰ：由十二烷基硫酸钠0.2～1.0%（质量/体积）、曲拉通1.0~4.0%（体积/体积），异硫氰酸胍0.2～1.0mol/L和100~400μg/ml的磁珠组成。②RNA提取溶液Ⅱ：包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸100~300mmol/L、氯化钠100~300mmol/L，溶液Ⅱ的pH为6.5±0.2；③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通0.1~1.0%（体积/体积）和氯化钠100~300mmol/L。⑤RNA洗脱液：含Tris-HCl0.8～1.2mol/L和EDTA0.1~1.0mol/L；⑦PC R反应液：包括5×PCR反应缓冲液10μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2~0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物EV-F与EV-R，0.2~0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针EV-P，0.1~0.2μmol/L的用于内标扩增的上、下游引物IC-F与IC-R，0.05~0.2μmol/L的用于内标检测的探针IC-P；⑧EV酶混合液：包括mMLV酶10~150U/μl和1~10U/μl的H-TaqDNA聚合酶。

本发明在对EV所有已知基因型的基因组序列进行比对的基础上，在EV的最保守区域设计了两对引物和探针，经定量PCR优化，筛选出扩增效果最好的一对引物和探针，可检测出EV所有已知基因型，但不能检测出非EV病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。另外，本发明对EV-RNA的提取方法进行了比较和优化，选择了吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性，其检测下限即灵敏度可达200copie/ml，检测范围（试剂盒的定量线性范围）为2.00E+02~2.00E+08copies/ml。

另外，在本发明的一种优选实施方式中，在样本提取过程中增加了内标，利用内标监控RNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性。

本发明中，在荧光PCR扩增结束后，经仪器自带软件自动分析样本的Ct值，可为灵敏、早期诊断肠道病毒感染提供可靠的实验证据。

附图说明

图1A示出了本发明提供的一个EV阳性对照和一个EV阴性对照其本身的扩增曲线图；

图1B示出了本发明提供的一个加在EV阳性对照中的内标和一个加在EV阴性对照中的内标的内标扩增曲线图；

图2A示出了本发明提供的十个EV阳性样本的扩增曲线图；

图2B示出了本发明提供的十个EV近似病原体（分别为：腺病毒、流感病毒、EB病毒、巨细胞病毒、肺炎支原体、解脲脲原体、结核杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念球菌）的扩增曲线图。

具体实施方式

以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。

实施例1

本实施例提供一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒（检测EV RNA的试剂盒），它包括如下组分：

①RNA提取溶液Ⅰ：由十二烷基硫酸钠0.2~1.0%（质量/体积）、曲拉通1.0~4.0%（体积/体积），异硫氰酸胍0.2~1.0mol/L和100~400μg/ml的磁珠组成；

②RNA提取溶液Ⅱ：包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸100~300mmol/L、氯化钠100~300mmol/L，溶液ⅡpH值为6.5±0.2；

③RNA提取溶液Ⅲ：曲拉通0.1~1.0%（体积/体积）、氯化钠100~300mmol/L；

④RNA提取溶液Ⅳ：矿物油；

⑤RNA洗脱液：Tris-HCl0.8~1.2mol/L、EDTA0.1~1.0mol/L；

⑥内标（阳性内对照）：一段长为92碱基对的人工合成DNA序列插入pUC18T载体的重组体，即质粒，浓度为1.00E+03~1.00E+06copies/ml；其碱基序列为：5’-ATCTTGCCACGAACGCTAAACGGCACTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGATCAACGCTCGAGTGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’

⑦PCR反应液：5×PCR反应缓冲液10μl（购买mMLV酶时附带的），0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2~0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物EV-F与EV-R，0.2~0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针EV-P，0.1~0.2μmol/L的用于内标扩增的上、下游引物IC-F与IC-R，0.05~0.2μmol/L的用于内标检测的探针IC-P，

所述用于靶多核苷酸扩增和检测的上下游引物及探针，其碱基序列分别为：

上游引物EV-F：5’-CCC TGA ATG CGG CTA ATC CTA-3’；

下游引物EV-R：5’-CAC GGA CAC CCA AAG TAG TCG G-3’；

探针EV-P：5’FAM-CGC TGC AGA GTT GCC CGT TAC GAC-BHQ13’；

针对92碱基的序列设计了非竞争性内标的引物及探针，其碱基序列分别为：

上游引物IC-F：5’-ATCTTGCCACGAACGCTAAACGGCA-3’；

下游引物IC-R：5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’；

探针IC-P：5’HEX-CTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGATC-BHQ13’；

⑧EV酶混合液：mMLV酶10~150U/μl，1~10U/μl H-Taq DNA聚合酶；

⑨EV阳性对照：标定已知浓度的慢病毒，其浓度为1.00~5.00E+05 copie/ml。

⑩EV阴性对照：灭菌生理盐水。

从附图1A、1B可以看出，EV阳性对照本身有S型扩增曲线，可明显判为阳性；而EV阴性对照本身扩增曲线平直，与阈值线无交点，没有Ct值（No Ct），可明显判为阴性。加入EV阳性对照中的内标和加入EV阴性对照中的内标的内标扩增曲线均为S型，可明显判为阳性。说明本试剂盒阴、阳性对照和内标可以监测提取过程和反应体系，避免假阴性结果。

实施例2

本实施例提供上述实施例1所述试剂盒用于检测咽拭子等未知样本中EV-RNA的操作步骤：

一、试剂准备

1）按比例取相应量的RNA提取溶液Ⅰ（200μl~1ml/人份）及内标（1μl/人份）充分混匀成RNA提取溶液1-mix，瞬时离心后备用。

2）根据待测样本、EV阴性对照、EV阳性对照的数量，按比例取相应量的PCR反应液（43μl/人份）及EV酶混合液（2μl/人份），充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。

二、RNA提取操作

1）裂解病毒：每管加入200μl~1ml RNA提取溶液1-mix，然后加入100μl~1ml待测样本（如咽拭子），盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；EV阴性对照和EV阳性对照参照与待测样本相同方法作RNA提取和纯化处理；

2）磁珠吸附核酸：每管加入50~400μl RNA提取溶液Ⅱ，震荡混匀10秒钟后，室温静置10~30分钟；

3)去除杂质：瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，2~5分钟后缓慢将溶液吸出；

4）洗涤：每管加入400μl～1ml RNA提取溶液Ⅲ和100~500μl RNA提取溶液Ⅳ，震荡混匀3~7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于磁珠分离器上进行磁珠分离；

5）2~5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1~3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃；

6）加入10~100ul RNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3~4次，室温静置5~30分钟后将离心管再次置于磁珠分离器上2~5分钟，然后将从磁珠上洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；

7）每个反应管加入45μl的PCR-mix，吸取已经洗脱磁珠后的待测样本RNA、EV阴性对照、EV阳性对照各5μl加入PCR-mix中，盖好管盖。

三、荧光PCR反应与结果分析（在荧光定量PCR扩增仪上进行）

1）将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。

2）荧光检测通道选择：选择FAM通道（Reportere:FAM,Quencher:None）检测EV；选择HEX或VIC通道（Reporter:VIC,Quencher:None）检测内标。

3）荧光定量PCR反应条件见表1：

表1

4）结果分析

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析，也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值进行分析，然后记录样本Ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct值（即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值）；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果。对于测定Ct值≤36（Ct值＞0）的样本，报告为EV RNA阳性；对于测定显示无Ct值的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤36），报告为EV RNA阴性；对于测定Ct值>36的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤36），报告为低于检测下限。若内标Ct值>36或内标显示无Ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。

从附图2A、2B可以看出，十个CA16阳性样本均有S型扩增曲线，可明显判为阳性；而十个CA16近似病原体：腺病毒、流感病毒、EB病毒、巨细胞病毒、肺炎支原体、解脲脲原体、结核杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念球菌的扩增曲线都平直，与阈值线无交点，没有Ct值（No Ct），均可明显判为阴性。说明本试剂盒的特异性好，可以检出CA16基因型样本，而非CA16样本均检测为阴性。

Claims

1.一种检测CA16RNA的试剂盒，包括含磁珠的RNA提取溶液、和含用于靶多核苷酸扩增的上游引物EV-F、下游引物EV-R和用于靶多核苷酸检测的探针EV-P的PCR反应液；其中，上游引物EV-F的碱基序列为5’-CCC TGA ATG CGG CTA ATC CTA-3’；下游引物EV-R的碱基序列为5’-CAC GGA CAC CCA AAG TAG TCG G-3’；探针EV-P的碱基序列为5’FAM-CGC TGC AGA GTT GCC CGT TAC GAC-BHQ13’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括内标，所述内标为一段长为92碱基对的人工合成DNA序列插入pUC18T载体的重组体，即质粒，所述人工合成DNA的碱基序列为：5’-ATCTTGCCACGAACGCTAAACGGCACTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGATCAACGCTCGAGTGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括如下组分，

①RNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠；

②RNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠；

③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化钠；

④RNA提取溶液Ⅳ：含矿物油；

⑤RNA洗脱液：含Tris-HCl和EDTA；

⑥内标：如权利要求2所述的内标；

⑦PCR反应液：包括5×PCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物EV-F与EV-R，用于靶多核苷酸检测的探针EV-P，用于内标扩增和检测的上、下游引物IC-F与IC-R和探针IC-P；

且IC-F的序列为5’-ATCTTGCCACGAACGCTAAACGGCA-3’，

IC-R的序列为5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’，

IC-P的序列为5’HEX-CTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGATC-BHQ13’；

⑧EV酶混合液：含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶；

⑨EV阳性对照：标定已知浓度的慢病毒，其浓度为1.00E+05～5.00E+05copies/ml；

⑩EV阴性对照：灭菌生理盐水。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，在试剂盒中，

①RNA提取溶液Ⅰ：包含质量/体积比为0.2～1.0%的十二烷基硫酸钠、体积/体积比为1.0～4.0%的曲拉通，异硫氰酸胍0.2～1.0mol/L和100～400μg/ml的磁珠。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，在试剂盒中，

②RNA提取溶液Ⅱ：包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸100～300mmol/L、氯化钠100～300mmol/L，溶液Ⅱ的pH为6.5±0.2；

③RNA提取溶液Ⅲ：含体积/体积比为0.1～1.0%的曲拉通和氯化钠100～300mmol/L。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，在试剂盒中，

⑤RNA洗脱液：含Tris-HCl0.8～1.2mol/L和EDTA0.1～1.0mol/L；

⑦PCR反应液：包括5×PCR反应缓冲液10μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物EV-F与EV-R，0.2～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针EV-P，0.1～0.2μmol/L的用于内标扩增的上、下游引物IC-F与IC-R，0.05～0.2μmol/L的用于内标检测的探针IC-P；

⑧EV酶混合液：包括mMLV酶10～150U/μl和1～10U/μl的H-Taq DNA聚合酶。