CN102534051A

CN102534051A - 一种肠道病毒检测试剂盒

Info

Publication number: CN102534051A
Application number: CN2012100479426A
Authority: CN
Inventors: 陈瑜; 李兰娟; 崔大伟; 谢国良
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-02-28
Filing date: 2012-02-28
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2032-02-28
Also published as: CN102534051B

Abstract

本发明提供一种肠道病毒检测试剂盒，包含定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品、阳性对照品、阴性对照品。本发明根据CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒的保守区序列设计特异性的引物和探针，采用一步法四重实时荧光定量RT-PCR技术，可快速、准确的从标本中同时检测出CoxB1、CoxB2、CoxB3和其他肠道病毒，并实时准确定量，尤其对属于肠道病毒属的CoxB1、CoxB2、CoxB3进行双重验证，使检测结果更为准确。

Description

一种肠道病毒检测试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种一种肠道病毒检测试剂盒，尤其涉及一步法四重荧光定量RT-PCR在同一个反应管内同时检测患者粪便或者咽拭子标本中CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒核酸检测方法，可应用于CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒引起的暴发疫情的实验室应急诊断及临床诊断。

背景技术

柯萨奇病毒(Coxsackie virus,CV)是由Dalldoff和Sickles于1948年首次从纽约市柯萨奇镇的一名类脊髓灰质炎患者的粪便中分离得到。它属小RNA病毒科的肠道病毒属（enteroviruses），对乳鼠的敏感性很高，根据它们感染乳鼠产生的病灶不同，柯萨奇病毒可以分为A、B两组。其中A组有23型病毒，B组有6型病毒。

1956年Javett首次报道病毒性心肌炎(viral myocardit,VMC)主要由柯萨奇病毒引起。心肌炎是一种心肌局灶性或弥漫性病变, 其特征为间质性炎性细胞浸润, 心肌坏死及变性。心肌炎与多种病毒及发病因素有关。病毒的直接作用和机体的免疫反应是病毒性心肌炎的主要发病机制，临床上以病毒性心肌炎最多见。临床上病毒性心肌炎最常见的发病方式为一般型，发病前l-2周常有肠道或呼吸道感染史，如腹泻、感冒等，然后出现乏力、面色苍白、精神不振、胸闷气短等症状，检查可发现心脏扩大，心律不齐或早搏等心脏异常体征。另外暴发型和隐匿型对患儿的威胁最大，必须引起重视。目前对病毒性心肌炎的临床诊断, 主要依靠临床症状及常规生化检查和心电图，血生化检查中最常用的指标是心肌酶谱和心肌肌钙蛋白。但是由于病毒性心肌炎发病初期的症状不典型，往往出现临床症状时已经累及心肌，引起心肌不可逆的损伤，造成严重后果。另外，医院内感染越来越受到重视，一巳发生院内感染的爆发，后果无疑是非常严重的。因此，早期、及时、准确的诊断病原刻不容缓。

传统的诊断病毒感染的方法主要是病毒分离和血清学方法。病毒分离操作复杂，耗费时间长，容易导致污染，不便于临床应用。在临床病原学诊断上，常规的血清学方法检测抗体仅是一个反映感染的间接指标，不能替代直接的病原学检测，无法明确诊断感染病毒的种类。

实时荧光定量PCR技术具有全封闭单管扩增、简便快捷、重复性好、可以实时定量，并且有效解决了扩增产物污染等优势，克服了以往临床传统诊断的缺陷，具有高度的特异性和敏感性，为临床病原诊断提供了一种有效、快速的检测手段。随着技术的改进及方法的不断完善，此技术已越来越多地应用于临床各科室，为临床诊断提供了准确、及时、高效的实验室依据。但是单管实时荧光定量RT-PCR检测一种病原，不仅耗时耗力，也浪费试剂耗材，因而建立可同时检测多种病原的多重实时荧光定量RT-PCR诊断方法与诊断试剂尤其重要。本发明采用的单管一步法四重荧光定量RT-PCR，不仅能够同时检测CoxB1、CoxB2、CoxB3以及其他肠道病毒，同样具备较高的特异性和灵敏度。

发明内容

本发明的目的是提供一种肠道病毒检测试剂盒，是一种一步法四重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本试剂盒包含定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品（CoxB1、CoxB2、CoxB3、肠道病毒）、阳性对照品（CoxB1、CoxB2、CoxB3、肠道病毒）、阴性对照品，盒体设有容器孔，分别放置定量RT-PCR反应液管、酶混合液管、引物探针混合液管、标准品管（CoxB1、CoxB2、CoxB3、肠道病毒）、阳性对照品管（CoxB1、CoxB2、CoxB3、肠道病毒）、阴性对照品管。

其中定量RT-PCR反应液含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶等、引物探针混合液含四种病毒的特异性引物和相应的四种不同荧光标记的探针，且引物探针混合液管为棕色管，阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，阳性对照为CoxB1、CoxB2、CoxB3及肠道病毒的阳性质粒样品。

上述标准品包括CoxB1、CoxB2、CoxB3及肠道病毒标准品，其保守区基因序列如下：

本发明提供的荧光定量试剂盒需于-20℃储存，尽量减少反复冻融；引物探针混合液需避光条件保存。

本发明的另一个目的是提供上述的一种肠道病毒检测试剂盒在检测CoxB1、CoxB2、CoxB3以及其他肠道病毒中的应用。

本发明试剂盒的使用方法：在每次标本检测中均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用高温高压灭菌的DEPC水稀释为1×10³-1×10⁸ Copies/ml。

粪便样品核酸的提取：取0.2g或200

粪便样本加到EP管中，加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，然后室温静置10min，以8000r/min离心5min。吸取200

上清加入到EP管中，采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acid extraction Kit II或QIAGEN公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit，按照试剂盒说明书进行提取, 取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。

核酸的检测：取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。反应总体积为25

，其中定量RT-PCR反应液12.5

，酶混合液1

，引物探针混合液(20μmol/l，包含四种病毒的特异性引物和相应的四种种荧光探针)共6，模板5

，加水补足至25 。在ABI7500荧光定量PCR仪（或者其他四色荧光以上的PCR仪）上进行检测，反应参数为：反转录50℃，30min；95℃ 5min热启动，然后95℃ 15s，55℃ 45s，在55℃进行四重荧光检测，共进行40个循环。

荧光定量结果报告：① CoxB1、CoxB2、CoxB3及肠道病毒检测的各自C_T值对应相应的荧光标记的病毒，检测样本C_T值为40、0和无数值时，报告为阴性。② 检测样本C_T值≤35时：若肠道病毒C_T值≤35，同时CoxB1或CoxB2或CoxB3病毒的C_T值≤35，报告为CoxB1或CoxB2或CoxB3阳性；单独肠道病毒C_T值≤35，报告为肠道病毒阳性。③ 检测样本C_T值≥35且小于40的样本，建议复检，复检结果C_T值≤37者，依据②的判断标准报告为相应病毒阳性。根据所获得的标准曲线，计算待测标本各种病毒的量( Copies/ml)。

本发明的有益之处是：运用一步法四重荧光定量RT-PCR技术，采用CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒高度特异的引物和荧光标记探针，开发研制用于CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒四重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该发明是通过一个PCR反应，可以从标本中同时检测出CoxB1、CoxB2、CoxB3和其他肠道病毒的存在，比传统的普通PCR和单重荧光定量PCR方法更简便、快速；尤其对属于肠道病毒属的CoxB1、CoxB2、CoxB3进行双重验证，使检测结果更为准确。同时，对检测的病毒进行实时准确定量，对临床上疑似肠道病毒感染的患儿，特别是小儿病毒性心肌炎患儿提供早期明确诊断，区分病毒感染的种类及滴度，为临床治疗方案的制定提供参考依据。

附图说明

图1为本试剂盒结构示意图。

图2为本试剂盒同时检测四种病毒阳性的实例。

图3为本试剂盒检测CoxB1病毒的灵敏度，从左到右（1-6）依次为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³Copies/ml。

图4为本试剂盒CoxB1病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线，其中横坐标为标准品浓度（Copies/ml）的对数值，纵坐标为C_T值。

图5为本试剂盒检测CoxB2病毒的灵敏度，从左到右（1-6）依次为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³Copies/ml。

图6为本试剂盒CoxB2病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线，其中横坐标为标准品浓度（Copies/ml）的对数值，纵坐标为C_T值。

图7为本试剂盒检测CoxB3病毒的灵敏度，从左到右（1-6）依次为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³Copies/ml。

图8为本试剂盒CoxB3病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线，其中横坐标为标准品浓度（Copies/ml）的对数值，纵坐标为C_T值。

图9为本试剂盒检测肠道病毒的灵敏度，从左到右（1-6）依次为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³Copies/ml。

图10为本试剂盒肠道病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线，其中横坐标为标准品浓度（Copies/ml）的对数值，纵坐标为C_T值。

具体实施方式

下面具体实施例结合附图对本发明进行进一步阐述本发明，但这些实施例仅限于说明本发明而不限制本发明的范围。

实施例1

参见图1，一种肠道病毒检测试剂盒，包含：定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品（CoxB1、CoxB2、CoxB3、肠道病毒）、阳性对照品（CoxB1、CoxB2、CoxB3、肠道病毒）、阴性对照品，盒体7设有容器孔，分别放置定量RT-PCR反应液管1、酶混合液管2、引物探针混合液管3、阴性对照品管4、标准品管5（包括CoxB1、CoxB2、CoxB3、肠道病毒标准品，共4管）、阳性对照品管6（包括CoxB1、CoxB2、CoxB3、肠道病毒阳性标准品，共4管）。

实施例2

1．材料与方法

1.1临床标本与病毒核酸：

CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒的临床样本来源于浙江大学医学院附属第一医院、浙江大学医学院附属儿童医院、湖州市中心医院以及浙江省内其他几家医院近期患者的粪便或咽拭子标本，样本采集后运送到实验室。阳性核酸均通过基因测序确认。

1.2引物与探针

从美国的NCBI基因库下载了涵盖国内外CoxB1、CoxB2、CoxB3以及肠道病毒的多条基因序列。利用DNAMAN软件对其进行了同源性比较，确定以上病毒基因组的保守区。使用Primer Express 3.0软件在其保守区设计高度特异性的引物与Taqman探针、引物和探针序列均通过Blast验证，具有较好特异性。引物和探针序列如下，：

以上引物和探针委托上海辉睿生物科技有限公司和上海生工生物工程有限公司合成。

1.3病毒核酸的提取与标准品定量标准：

取0.2g或200

粪便样本加到EP管中，加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，然后室温静置10min，以8000r/min离心5min。吸取200 上清加入到EP管中，采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acid extraction Kit II或QIAGEN公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit，按照试剂盒说明书进行提取，取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。

合成各病毒基因标准品片段，将其连接到质粒载体pMD19-T Simple Vector（TaKaRa公司）。转化后培养。鉴定后提取质粒DNA，利用NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer测量质粒DNA的浓度，确定DNA的拷贝数作为标准品定量母液。根据实验需要，将标准品定量母液稀释至所需最高浓度，并做十倍稀释至最低浓度，低温保存备用。

1.4四重荧光定量RT-PCR反应体系和条件的优化：

反应总体积为25

，其中定量RT-PCR反应液12.5 ，酶混合液1

，DEPC水补足至25

。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为：反转录50℃，30min；95℃ 5min热启动，然后95℃ 15s，55℃ 45s，在55℃进行四重荧光检测，共进行40个循环。结果判断：选择荧光检测模式FAM、HEX、ROX、CY5荧光基线选取3-15个循环时的荧光信号，以阈值线稍高于阴性对照品的最高点作为阈值，若样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性；若无典型的扩增曲线，则判断为阴性。体系的优化试验，在以同一浓度阳性核酸作为模板的反应体系中，引物浓度从1～20μmol/l，探针浓度从1～20μmol/l，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低C_T值和最高荧光强度增加值（ΔRn）选择最佳引物和探针浓度。

1.5四重荧光定量RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验

选择CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒的阳性核酸（均通过基因测序鉴定）和近期来源于浙江大学医学院附属第一医院、浙江大学医学院附属儿童医院、湖州市中心医院以及浙江省内其他几家医院的临床样本提取核酸，用CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒四重荧光定量RT-PCR方法进行检测，验证方法的特异性；对已标定拷贝数（ Copies/ml）的CoxB1（10⁸ Copies/ml）、CoxB2（10⁸ Copies/ml）、CoxB3（10⁸ Copies/ml）和肠道病毒（10⁸ Copies/ml）分别稀释后，平行进行荧光PCR反应，比较其灵敏度。此外，对每一个浓度的阳性核酸稀释液作6次重复检测，得到的C_T值计算其标准差和变异系数，验证该方法的重复性。

2结果

2.1四重荧光定量RT-PCR反应体系及条件

该方法的反应总体积为25

，其中其中定量RT-PCR反应液12.5

，酶混合液1 ，引物探针混合液(20μmol/l，包含四种病毒的特异性引物和相应的四种荧光探针)共6

，模板5

，DEPC水补足至25

。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为：反转录50℃，30min；95℃ 5min热启动，然后95℃ 15s，55℃ 45s，在55℃进行四重荧光检测，共进行40个循环。可获得最低C_T值和最高荧光强度。

2.2特异性试验

本发明建立的一步法四重荧光定量RT-PCR方法对CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒具有较好的特异性，近期采集的临床标本也检测出阳性反应。CoxB1、CoxB2、CoxB3引物探针与其他病毒如轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、腺病毒、EV71、CoxA16、呼吸道合胞病毒、博卡病毒等均无交叉反应，肠道病毒通用引物探针与以上除EV71、CoxA16肠道病毒的其他病毒均无交叉反应。该方法同时检测四种病毒阳性的结果参见图2，其中1为肠道病毒，2为CoxB2，3为CoxB1，4为CoxB3。

2.3 敏感性试验

对CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒敏感性检测试验，将已标定拷贝数（ Copies/ml）的CoxB1（10⁸ Copies/ml）、CoxB2（10⁸ Copies/ml）、CoxB3（10⁸ Copies/ml）和肠道病毒（10⁸ Copies/ml）分别十倍梯度稀释后，用本试剂盒进行检测。结果显示该方法检测CoxB1病毒敏感性为10³ Copies/ml，结果参见图3，其标准曲线参见图4；CoxB2病毒敏感性为10³ Copies/ml，结果参见图5，其标准曲线参见图6；CoxB3病毒敏感性为10³ Copies/ml，结果参见图7，其标准曲线参见图8；肠道病毒敏感性为10³ Copies/ml，结果参见图9，其标准曲线参见图10。

2.4重复性试验

分别取CoxB1（终浓度为10⁶ Copies/ml）、CoxB2（10⁶ Copies/ml）、CoxB3（10⁶ Copies/ml）和肠道病毒（10⁶ Copies/ml），按10倍梯度稀释成3个不同的浓度，对每一个浓度的样本作6个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.09～0.28之间，变异系数均低于1.0%，具有较好的重复性（结果见表1）。

2.5临床样本的检测

依托“十二五”重大专项-传染病病原监测技术平台，采集的包含CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒的临床样本主要来源于浙江大学医学院附属第一医院、浙江大学医学院附属儿童医院、湖州市中心医院以及浙江省内其他几家医院近期患者的粪便标本（535份）或咽拭子标本（43份）。我们对采集到的共578份标本提取核酸，使用四重荧光定量RT-PCR进行检测，共检测到肠道病毒153份，其中CoxB1病毒69份，CoxB2病毒18份，CoxB3病毒27份，其他类型肠道病毒39份。阳性检测结果进一步测序，均与该方法的检测结果一致，符合率达100%。

本发明涉及的序列

<110> 浙江大学

<120> 一种肠道病毒检测试剂盒

<160> 16

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据CoxB1病毒VP1基因设计的PCR检测上游引物序列

<400> 1

CACTCACGGTCCGAATCRTCCA 22

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据CoxB1病毒VP1基因设计的PCR检测下游引物序列

<400> 2

TTTYTGAGTTRTTRGTGTATGTGGCAT 27

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据CoxB1病毒VP1基因设计的TaqMan荧光定量检测探针序列

<400> 3

TTCCTGTGCCGGTCTGCCTGTGT 23

<210> 4

<211> 120

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据CoxB1病毒VP1基因设计的荧光定量检测标准品序列

<400> 4

ACGTGAAAAA CTACCACTCA CGGTCCGAAT CGTCCATTGA AAATTTCCTG TGCCGGTCTG CCTGTGTATA CTATGCCACA TACACCAATA ACTCAGAAAA GGGGTTTGCA GAGTGGGTTA 120

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据CoxB2病毒VP1基因设计的PCR检测上游引物序列

<400> 5

GATCAGCATGTGTGTTTTACACGA 24

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据CoxB2病毒VP1基因设计的PCR检测下游引物序列

<400> 6

GCCTGTCTAACACTCACCTTCCA 23

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据CoxB2病毒VP1基因设计的TaqMan荧光定量检测探针序列

<400> 7

TACACCAACAGCAAAAATGCAGCCAA- 26

<210> 8

<211> 117

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据CoxB2病毒VP1基因设计的荧光定量检测标准品序列

<400> 8

ATTTCCTTGC ACGATCAGCA TGTGTGTTTT ACACGACATA CACCAACAGC AAAAATGCAG CCAAAGAAAA GAAGTTTGCG ACATGGAAGG TGAGTGTTAG ACAGGCTGCA CAACTGA 117

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据CoxB3病毒VP1基因设计的PCR检测上游引物序列

<400> 9

CCAGTAMCAGATAAAGTGGATTCRTA 26

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据CoxB3病毒VP1基因设计的PCR检测下游引物序列

<400> 10

AGGAARGGTATRGACATGCGTG 22

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据CoxB3病毒VP1基因设计的TaqMan荧光定量检测探针序列

<400> 11

CCAAGTGTGTTCTGGACAGAGGGTAATGC 29

<210> 12

<211> 123

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据CoxB3病毒VP1基因设计的荧光定量检测标准品序列

<400> 12

ACCAGGGGGT CCAGTACCAG ATAAAGTGGA TTCATATGTA TGGCAAACTT CCACGAACCC AAGTGTGTTC TGGACAGAGG GTAATGCACC ACCACGCATG TCCATACCTT TCCTGAGCAT TGG 123

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据肠道病毒polyprotein基因设计的PCR检测上游引物序列

<400> 13

CCCTGAATGCGGCTAATCC 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据肠道病毒polyprotein基因设计的PCR检测下游引物序列

<400> 14

ATTGTCACCATAAGCAGCCA 20

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据肠道病毒polyprotein基因设计的TaqMan荧光定量检测探针序列

<400> 15

AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC 28

<210> 16

<211> 166

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据肠道病毒polyprotein基因设计的荧光定量检测标准品序列

<400> 16

AGTCCTCCGG CCCCTGAATG CGGCTAATCC CAACTGCGGA GCACACGCCC ACAAGCCAGC GGGTAGTGTG TCGTAACGGG TAACTCTGCA GCGGAACCGA CTACTTTGGG TGTCCGTGTT TCCTTTTATC TTTATATTGG CTGCTTATGG TGACAATTAA AGAATT 166

Claims

1.一种肠道病毒检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、CoxB1标准品、CoxB2标准品、CoxB3标准品、肠道病毒标准品、CoxB1阳性对照品、CoxB2阳性对照品、CoxB3阳性对照品、肠道病毒阳性对照品、阴性对照品，盒体(7)设有容器孔，分别放置定量RT-PCR反应液管(1)、酶混合液管(2)、引物探针混合液管(3)、阴性对照品管(4)、标准品管(5)、阳性对照品管(6)，标准品管(5)有4管，分别放置CoxB1标准品、CoxB2标准品、CoxB3标准品、肠道病毒标准品，阳性对照品管(6)有4管，分别放置CoxB1阳性对照品、CoxB2阳性对照品、CoxB3阳性对照品、肠道病毒阳性对照品；

其中定量RT-PCR反应液含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液含四种病毒的特异性引物和相应的四种不同荧光标记的探针，引物探针混合液管需为棕色管，阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为CoxB1、CoxB2、CoxB3及肠道病毒的阳性质粒样品；

检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列为：

上游引物CoxB1-F：5’-CACTCACGGTCCGAATCRTCCA-3’

下游引物CoxB1-R：5’-TTTYTGAGTTRTTRGTGTATGTGGCAT-3’

特异性探针CoxB1-P：5’-FAM-TTCCTGTGCCGGTCTGCCTGTGT-BHQ1-3’

上游引物CoxB2-F：5’-GATCAGCATGTGTGTTTTACACGA-3’

下游引物CoxB2-R：5’-GCCTGTCTAACACTCACCTTCCA-3’

特异性探针CoxB2-P：5’-CY5-TACACCAACAGCAAAAATGCAGCCAA-BHQ2-3’

上游引物CoxB3-F：5’-CCAGTAMCAGATAAAGTGGATTCRTA-3’

下游引物CoxB3-R：5-AGGAARGGTATRGACATGCGTG-3’

特异性探针CoxB3-P：5’-HEX-CCAAGTGTGTTCTGGACAGAGGGTAATGC-BHQ1-3’

上游引物肠道病毒-F：5’-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3’

下游引物肠道病毒-R：5’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’

特异性探针肠道病毒-P：5’-ROX-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQ2-3’

CoxB1标准品序列为：

ACGTGAAAAA CTACCACTCA CGGTCCGAAT CGTCCATTGA AAATTTCCTG

TGCCGGTCTG CCTGTGTATA CTATGCCACA TACACCAATA ACTCAGAAAA

GGGGTTTGCA GAGTGGGTTA

CoxB2标准品序列为：

ATTTCCTTGC ACGATCAGCA TGTGTGTTTT ACACGACATA CACCAACAGC

AAAAATGCAG CCAAAGAAAA GAAGTTTGCG ACATGGAAGG TGAGTGTTAG

ACAGGCTGCA CAACTGA

CoxB3标准品序列为：

ACCAGGGGGT CCAGTAGCAG ATAAAGTGGA TTCATATGTA TGGCAAACTT

CCACGAACCC AAGTGTGTTC TGGACAGAGG GTAATGCACC ACCACGCATG

TCCATACCTT TCCTGAGCAT TGG

肠道病毒标准品序列为：

AGTCCTCCGG CCCCTGAATG CGGCTAATCC CAACTGCGGA GCACACGCCC

ACAAGCCAGC GGGTAGTGTG TCGTAACGGG TAACTCTGCA GCGGAACCGA

CTACTTTGGG TGTCCGTGTT TCCTTTTATC TTTATATTGG CTGCTTATGG

TGACAATTAA AGAATT。

2.根据权利要求1所述的一种肠道病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒保存于-20℃，引物探针混合液需避光条件保存。

3.权利要求1所述的一种肠道病毒检测试剂盒在检测CoxB1、CoxB2、CoxB3以及其他肠道病毒中的应用。