CN101017140A

CN101017140A - 人肠道病毒(ev)荧光定量pcr检测技术

Info

Publication number: CN101017140A
Application number: CN 200610017403
Authority: CN
Inventors: 董晓敏; 李智涛; 董继华; 王云龙
Original assignee: HENAN BIOENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Current assignee: HENAN BIOENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Priority date: 2006-02-08
Filing date: 2006-02-08
Publication date: 2007-08-15

Abstract

人肠道病毒(EV)荧光定量PCR检测技术属于病毒核酸检测技术领域。该技术选用了针对EV各亚型的通用上游引物、通用下游引物及通用荧光探针，并用荧光探针PCR检测技术。该探针5’端标记荧光发射基团6－羧基荧光素(FAM)，3’端标记荧光淬灭基团6－羧基四甲基若丹明(TAMRA)。由该技术组成的检测试剂盒对各种EV亚型标准血清及临床血清进行检测，获得的各种参数为：特异性100％、敏感性95％、重复性CV值＜10％、EV检测的最低含量为500拷贝/ml。

Description

人肠道病毒(EV)荧光定量PCR检测技术

技术领域

本发明属于病毒核酸检测技术领域，具体涉及一种人肠道病毒(EV)荧光定量PCR检测技术，适用于人肠道病毒的定量检测、人肠道病毒感染性疾病的诊断、流行病学调查、以及对预防和治疗效果进行评价。

背景技术

人肠道病毒(enterovirus，EV)属于小RNA病毒科，包括小儿麻痹病毒(血清型1-3)，柯萨奇病毒A(血清型1-22，24)及柯萨奇病毒B(血清型1-6)，埃可病毒(血清型1-9，11-27，29-31)及新肠道病毒(血清型68-71)。

肠道病毒感染的最普遍症状是非特异性发热，有时伴随出疹。引发的急性病毒综合症主要包括脑炎，心肌炎(特别是柯萨奇B组病毒引起)，出血性结膜炎(特别是柯萨奇A24以及EV70血清型引起)，手足口综合症(主要由柯萨奇病毒A5、9、10、16、19型及EV71型和新肠道病毒引起，以A16多见)，流行性胸痛(胸膜痛/肋肌痛)，不可逆性新生儿脓血症、脓毒血症(特别是埃可病毒以及柯萨奇B组病毒引起)等。

EV可在肠道内高滴度复制，经血液传播到各器官，引发急性肠道病毒综合症，导致严重后果，但其诊断是临床的难题，由此导致治疗的困难和延误。对于脑膜炎患者，尽管80-92％的病毒性脑炎都是由肠道病毒感染引起，但还是需要明确区分为肠道病毒性、细菌性和单纯疱疹病毒性，以便对症治疗，避免使用非必要的抗生素、抗单纯疱疹病毒药物等引起的更严重的后果。急性心肌炎的诊断也是如此，大约36-65％为柯萨奇B组病毒感染引起，但其他病原体感染引起的病症也不在少数。

在EV疾病诊断中，诊断标准是细胞培养病毒分离法，但其存在较大弊病。其一是操作繁杂费时，报告结果需要数天至数周，而急性肠道病毒综合症发展甚速，可在数天内危及生命。其二是可能出现中和抗体作用或某些柯萨奇A血清型在细胞培养时丧失生长能力而产生假阴性结果，延误抢救和治疗时机。因此，需要发展与诊断标准接近的快速诊断试剂。

酶联免疫吸附实验(ELISA)是能够达到诊断标准的快速诊断方法之一，目前主要运用于EV血清型的鉴定。但是，由于EV血清型的种类很多，该方法难以全面评估。实际上，并没有一种肠道病毒综合症唯一地与肠道病毒某一血清型相对应，也没有一种血清型仅与某种疾病必然关联，EV临床综合症多为几种血清型相互叠加的结果。因此，在大多数的情况下，并没有必要鉴别感染的是肠病毒的何种血清型，仅需诊断出是否为肠道病毒感染即可。

反转录聚和酶链式反应(RT-PCR)是EV快速诊断方法之一。但是，普通的RT-PCR方法在进行电泳检测时需要对扩增产物敞开操作，存在产物污染的危险，因此被国家明令禁止在临床应用。同时，该方法不是定量检测，与临床需要有较大差距。

荧光定量PCR技术以灵敏度高、速度快、可定量、抗污染、特异性强等优点逐渐取代了传统PCR技术。发展的荧光探针使该技术具有了高度特异性，其利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。探针的5′端标记有报告基团FAM，3′端标记有荧光淬灭基团TAMRA。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。荧光定量技术正是基于这样的原理设计的，该技术为EV感染的诊断、大规模筛查、疗效动态分析、新药开发等提供良好的技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种人肠道病毒荧光定量PCR检测技术，能快速、灵敏、准确、定量的检测人肠道病毒。该技术选用了针对人肠道病毒各亚型特异、通用的引物及通用的荧光探针，通过检测各种人肠道病毒标准血清及临床血清，确定其检测人肠道病毒的各种检测指标：特异性100％、敏感性95％、重复性CV值＜10％，人肠道病毒检测的最低含量为500拷贝/ml，证实所采用的通用引物及通用荧光探针具有很好的敏感性、特异性及重复性。

本发明组成试剂包括：样品RNA裂解液、逆转录酶、RNA酶抑制剂、逆转录反应液、阳性对照、Taq DNA聚合酶、荧光定量反应液和阴性对照。

根据本发明提供的试剂，使用步骤如下：

(1)RNA的提取：200ul血清+400ul RNA裂解液，振荡15S；混匀60℃水浴15min；离心数秒；加入600ul异丙醇，室温5min；600ul 75％乙醇洗涤沉淀，吸水纸洗干，37℃晾干10min，备用(如需保存RNA，则加入DEPC处理水，一20℃(保存)。

(2)逆转录合成cDNA：加入28ul逆转录反应液(内含0.2uM通用下游引物，1.8mM Mg²⁺，50mM Tris-HCl(pH8.5)，50mM KCl)及10U AMV酶，12000r/min离心10s，42℃水浴45min。

(3)PCR扩增：取Taq酶2.5U加入荧光定量PCR反应液管内(荧光定量PCR反应液：0.4uM通用上游引物，0.4uM通用下游引物，0.2uM通用荧光探针，5.0mM Mg²⁺，50mM Tris-HCl(pH8.5)，50mM KCl)，然后将样本、阴性对照或阳性对照的反转录液各5μl分别加入反应液管内，混匀后10000r/min离心10s上机(ABI PRISM 7700)扩增和检测分析。PCR扩增参数：37℃，2min；94℃，3min；94℃15sec，60℃30sec，40个循环。荧光信号的收集定为FAM(激发波长480nm，发射波长520nm)，数据的采集定在60℃。

(4)结果分析：使用PE 7700荧光PCR检测仪进行结果分析时，基线取3-10或3-15个循环的荧光信号。阈值设定原则以阴性对照扩增曲线的最高点Ct值＝40为准(其它仪器基线和阈值设定根据仪器可作相应调整)。

(5)质量控制：①系统阳性对照：CT值＜35。②阴性对照：CT值为40。③全程系统参照物：CT值＜38。若对照样品检测结果不符合上述条件，认为实验不成立，全部试验重做。

(6)结果判断：若检测样本的CT值＜38，则判该样本为阳性。若检测样本的CT值＝40，则判该样本为阴性。若检测样本的CT值38-40之间，为实验灰区，需重复实验一次，若重复实验结果样本＞38，判为阳性，否则判为阴性。

具体实施方式

实施：人肠道病毒荧光定量PCR检测技术检测人肠道病毒。

(1)RNA的提取：200ul血清+400ul RNA裂解液，振荡15S；混匀60℃水浴15min；离心数秒；加入600ul异丙醇，室温5min；600ul 75％乙醇洗涤沉淀，吸水纸洗千，37℃晾干10min，备用(如需保存RNA，则加入DEPC处理水，一20℃(保存)。

(2)逆转录合成cDNA：加入28ul逆转录反应液(内含0.2uM通用下游引物，1.8mM Mg²⁺，50mM Tris-HCl(pH8.5)，50mM KCl)及10UAMV酶，12000r/min离心10s，42℃水浴45min。

(3)PCR扩增：取Taq酶2.5U加入荧光定量PCR反应液管内(荧光定量PCR反应液：0.4uM通用上游引物，0.4uM通用下游引物，0.2uM通用荧光探针，5.0mM Mg²⁺，50mM Tris-HCl(pH8.5)，50mM KCl)，然后将样本、阴性对照或阳性对照的反转录液各5μl分别加入反应液管内，混匀后10000r/min离心10s上机(ABI PRISM 7700)扩增和检测分析。PCR扩增参数：37℃，2min；94℃，3min；94℃ 15sec，60℃ 30sec，40个循环。荧光信号的收集定为FAM(激发波长480nm，发射波长520nm)，数据的采集定在60℃。

Claims

1、人肠道病毒(EV)荧光定量PCR检测技术，其特征是根据人肠道病毒基因组设计了PCR通用上游引物(2)、通用下游引物(3)及通用探针(4)。

2、根据权利要求1所述的人肠道病毒荧光定量PCR检测技术，其特征在于，用于核酸检测的通用上游引物选取于人肠道病毒基因组TCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTA序列或GCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTT序列，其它类似该序列制备的引物及探针的方法也要求保护。

3、根据权利要求1所述的人肠道病毒荧光定量PCR检测技术，其特征在于，用于核酸检测的通用下游引物选取于人肠道病毒基因组TGGCTGCTTATGGTGACAAT序列或TTGGATTGGCCATCCGGTGA序列，其它类似该序列制备的引物及探针的方法也要求保护。

4、根据权利要求1所述的人肠道病毒荧光定量PCR检测技术，其特征在于，用于检测的通用探针选取于人肠道病毒基因组GCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTT序列或TGGCTGCTTATGGTGACAAT序列，其反义链为AAAGGAAACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTCCGC或ATTGTCACCATAAGCAGCCA，其它类似该序列制备的探针或引物的方法也要求保护。