CN105543409A - 一种中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光pcr检测方法 - Google Patents

一种中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速、灵敏的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的双靶基因实时荧光PCR检测方法。本发明的检测方法针对中东呼吸综合征冠状病毒的E基因和N基因作为双靶基因进行扩增，本发明检测方法包括：标本处理，RNA核酸提取，RT-PCR扩增反应及荧光信号检测，其中RT-PCR扩增反应的特异性引物和探针是针对N基因和E基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计、能够区别其他病毒株。本发明采用PCR及TaqMan荧光探针技术能对疑似中东呼吸综合征感染者标本中MERS-CoV的特异性核酸序列进行双靶基因扩增并检测，从而判断MERS-CoV的感染情况。通过本发明可大幅度提高出入境口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止重大中东呼吸综合征冠状病毒的输入。

Description

一种中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法。
背景介绍
当今呼吸道传染病在全球范围内广泛传播与流行，新的病种不断被发现，流行地域不断扩展，流行的频率不断增强，对国境口岸的卫生安全造成了严重威胁，因此对呼吸道传染病的监测是国境口岸卫生检疫的重要工作。对国境口岸来说，不仅要求对病原体“检得出”，还要求能够“检得准、检得快”，才能满足口岸现场快速处置疫情的需要。
中东呼吸综合征是由一种新型冠状病毒(MERS-CoV)感染而引起的病毒性呼吸道疾病，2012年在沙特阿拉伯首次被发现。冠状病毒是一组能够导致人类和动物感染发病的病毒，能够引起人类发生从普通感冒到严重急性呼吸综合征(SARS)的多种疾病。MERS-CoV经空气飞沫传播、通过呼吸道侵入并能引起易感人群感染和流行的呼吸道传染病，因其传染性强，易在短时间内迅速传播，造成疫情暴发、流行或大流行，为世界卫生组织(WHO)所关注。2015年6月广州出现中国第一例输入性MERS病例，因此对MERS的监测是全国各口岸传染病监测的工作重点。针对口岸入境发热人员的流行病学特征，加强口岸重点人群的体温监测和医学巡查，加大对旅行者的宣传力度，能有效防止MERS经口岸传播，保护人群健康安全。
随着我国商贸、旅游业的快速发展,境内外人员交往日益密切,以及动物的进口等影响,中东呼吸综合征冠状病毒输入的危险性日益增高。因此,尽快建立快速简便、特异敏感的检测方法对防范中东呼吸综合征冠状病毒的输入具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏的中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法。
本发明的中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法，包括如下检测步骤：
(1)标本处理：标本混匀后用于下一步核酸提取。
(2)RNA核酸提取：利用裂解法裂解病毒，利用离心柱吸附进行核酸提取。
(3)RT-PCR扩增反应：
a.RT-PCR反应体系包括：RT-PCR反应液,两对特异性正、反向引物和两条特异性探针混合液，逆转录酶/DNA聚合酶，RNase抑制剂，DEPC水,RT-PCR质控品,标本RNA核酸；其中，所述的特异性引物和探针是针对N基因和E基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计、能够区别其他病毒株。
所述的特异性引物探针特异性引物和探针为：
E-Forward5’-GCAACGCGCGATTCAGTT-3’SEQIDNO1；
E-Reverse5’-GCCTCTACACGGGACCCATA-3’SEQIDNO2；
E-Probe5’-FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA-3’SEQIDNO3；
N-Forward5’-GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC-3’SEQIDNO4；
N-Reverse5’-TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT-3’SEQIDNO5；
N-Probe5’-VIC-ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG-TAMRA-3’SEQIDNO6。
b.将上述混合好的反应液放入ABI7500Fast仪器内进行PCR扩增及荧光信号检测；
(4)结果判定：根据扩增结果，判定感染情况。
步骤(2)中所述的RNA提取为病毒RNA提取试剂盒提取，取140ul咽拭子标本，裂解后，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取RNA。
步骤(3)中所述的RT-PCR反应体系为：2XRT-PCR反应液10.0ul,引物探针混合液1.8ul，逆转录酶/DNA聚合酶0.2ul,RNase抑制剂0.4ul，DEPCH2O3.6ul,标本核酸4.0ul。
步骤(3)中所述的RT-PCR扩增的反应条件是：45℃逆转录10min，95℃变性2min，95℃变性5s，60℃退火和延伸26s，40个循环。
步骤(3)中所述的探针N-Probe的荧光标记为HEX。
本发明针对MERS-CoV病毒的双靶基因，利用以抗体介导的热启动和快速酶扩增，实现快速循环，极大缩短了循环延伸时间，整个检测在78分钟内完成。通过本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止外来输入性传染病的发生。
附图说明
图1实施例1中东呼吸综合征冠状病毒E、N双靶基因实时荧光PCR检测阳性样本梯度稀释结果。
图2a-d实施例1中东呼吸综合征冠状病毒E、N双靶基因实时荧光PCR检测灵敏限。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1中东呼吸综合征冠状病毒标本双靶基因实时荧光PCR检测
实验步骤
1.材料、试剂、仪器
引物探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成，PCR反应液购自BiolineReagentsLimited公司，荧光PCR仪为ABI7500Fast，病毒RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司。
2.标本准备
阳性标本为MERS-CoV(hCoV-EMC毒株)滴定后灭活病毒，由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所赠送，阴性对照标本为健康人的咽拭子，由本实验室保存。
3.RNA的提取
使用病毒RNA提取试剂盒(离心柱型)提取标本RNA。取140ul标本，按照试剂盒说明书中的操作步骤提取RNA，最后用60ul洗脱液洗脱RNA。
4.靶基因的扩增
4.1引物和探针的设计
特异性引物和探针是针对N基因和E基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计、能够区别其他病毒株，分别为两对特异性引物和两条特异性探针，特异性引物和探针为：
E-Forward5’-GCAACGCGCGATTCAGTT-3’SEQIDNO1；
E-Reverse5’-GCCTCTACACGGGACCCATA-3’SEQIDNO2；
E-Probe5’-FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA-3’SEQIDNO3；
N-Forward5’-GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC-3’SEQIDNO4；
N-Reverse5’-TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT-3’SEQIDNO5；
N-Probe5’-VIC-ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG-TAMRA-3’SEQIDNO6。
4.2RT-PCR反应平台
RT-PCR反应体系为：2XRT-PCR反应液10.0ul,引物探针混合液1.8ul，逆转录酶/DNA聚合酶0.2ul,RNase抑制剂0.4ul，DEPCH2O3.6ul,标本核酸4.0ul，具体如表1所示：
表1MERS-CoVPCR反应体系
RT-PCR扩增的反应条件是：45℃逆转录10min；95℃变性2min；95℃变性5s，60℃退火和延伸26s，40个循环。
5.结果判断
1)如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为空白，则判样品为阴性；
2)如果增长曲线呈S型曲线且Ct值≤35，则判样品为阳性；
3)如果增长曲线呈S型曲线且35<Ct值<40，重复做一次实验，如果结果增长曲线呈S型曲线且Ct值<40，判为阳性，否则判为阴性。
6.实验结果
单管双色MERS-CoV分子检测试剂盒针对N和E基因两个靶标，具有较好的扩增动力学与线性关系(R2值>0.99)，并且具有较低病毒检测限(200pfu/反应)。该检测试剂盒可以用于MERS-CoV分子检测。对H1N1，H3N2，H5N1，FluB，HCoV，PIV1，PIV2，PIV3，HRV，HMPV，RSVA，RSVB等病毒均无特异性反应，阳性和阴性符合率均达到100％，说明试剂盒灵敏性较好。
1)E和N双靶基因检测
将hCoV-EMC核酸RNA进行4个梯度不同倍数稀释，先分别单独对靶标E、N基因进行扩增，结果见表2和3，再对阳性稀释样本进行E和N双靶基因扩增，结果如图1所示。
表2靶标E基因实时荧光PCR检测阳性样本梯度稀释结果
注：1为原倍样本，2，3，4，5为对hCoV-EMC核酸RNA进行不同倍数稀释
表3靶标N基因实时荧光PCR检测阳性样本梯度稀释结果
注：1为原倍样本，2，3，4，5为对hCoV-EMC核酸RNA进行不同倍数稀释
2)MERS病毒检测限
采用4个不同10倍梯度MERS-CoV阳性样本RNA进行检测限分析，结果如图2所示，E和N基因两个靶标的检出下限为200pfu/反应左右。
本实施例中测检测结果显示本MERS-CoV病毒培养物在利用本检测方法时显示为阳性。

Claims (7)

1.一种中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法，其特征在于：包括以下检测步骤：
(1)标本处理：标本混匀后用于下一步核酸提取；
(2)RNA核酸提取：利用裂解法裂解病毒，利用离心柱吸附进行核酸提取；
(3)RT-PCR扩增反应：
a.RT-PCR反应体系包括：RT-PCR反应液,两对特异性正、反向引物和两条特异性探针混合液，逆转录酶/DNA聚合酶，RNase抑制剂，DEPC水,RT-PCR质控品,标本RNA核酸；其中，所述的特异性引物和探针是针对N基因和E基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计、能够区别其他病毒株。
所述的特异性引物探针特异性引物和探针为：
E-Forward5’-GCAACGCGCGATTCAGTT-3’SEQIDNO1；
E-Reverse5’-GCCTCTACACGGGACCCATA-3’SEQIDNO2；
E-Probe5’-FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA-3’SEQIDNO3；
N-Forward5’-GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC-3’SEQIDNO4；
N-Reverse5’-TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT-3’SEQIDNO5；
N-Probe5’-VIC-ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG-TAMRA-3’SEQIDNO6；
b.将上述混合好的反应液进行PCR扩增及荧光信号检测；
(4)结果判定：根据扩增结果，判定感染情况。
2.根据权利要求1所述的中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的RNA提取为病毒RNA提取试剂盒提取，取140ul血液标本，裂解后，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取RNA。
3.根据权利要求1所述的中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述的PCR反应体系为：2XRT-PCR反应液10.0ul,引物探针混合液1.8ul，逆转录酶/DNA聚合酶0.2ul,RNase抑制剂0.4ul，DEPCH2O3.6ul,标本核酸4.0ul。
4.根据权利要求1所述的中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述的PCR反应体系中，特异性正、反向引物和探针的浓度为10uM。
5.根据权利要求1所述的中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述的RT-PCR扩增的反应条件是：45℃逆转录10min；95℃变性2min；95℃变性5s，60℃退火和延伸26s，40个循环。
6.根据权利要求1所述的中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述的探针N-Probe的荧光标记为HEX。
7.根据权利要求1所述的中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法，其特征在于：E和N基因两个靶标的检出下限为200pfu/反应。
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