CN111154779A - 一种mers rna核酸参考品的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，所述制备方法分别将MERS的upE基因和ORF1a基因串联以及ORF1b和N基因串联整合到慢病毒的表达质粒载体中，将构建的两个表达质粒与三个包装质粒分别在工程大肠杆菌菌株中扩增，得到大量的质粒后，再将构建的两个表达质粒分别和三个包装质粒共同转染至HEK293T细胞中，经细胞表达后得到大量的包装了MERS RNA的慢病毒颗粒，本发明涉及基因工程技术领域。该MERS RNA核酸参考品的制备方法，制备的颗粒作为MERS RNA检测的阳性参考品，能很好地模拟从实际样本中提取病毒核酸RNA到核酸检测的整个过程，此外，将该病毒颗粒通过冻干保护剂进行冻干后得到的冻干粉，非常稳定，在45℃放置四周拷贝数基本不变。

Description

一种MERS RNA核酸参考品的制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种慢病毒颗粒包装中东呼吸 综合征病毒(MERS)的upE、ORF1a以及ORF1b和N基因的RNA片段， 作为MERS RNA检测的阳性参考品的制备方法，并涉及使该阳性参考品的稳 定保存的方法。
背景技术
中东呼吸综合征病毒(MERS)自2012年在沙特被发现，而后在我国及 周边国家时有发生，其致死率高于SARS，能通过空气传播，因而是我国国门 生物安全保障监控的重要烈性病原，监控过程中采用的方法主要是RT-PCR， 而相应的试剂盒一定要匹配阳性质控物质，MERS的核酸检测试剂盒的阳性 参考物质一般为质粒DNA、反转录RNA或灭活的病毒，但这些阳性参考物 质目前都存在着不同的缺陷，如灭活病毒需要三级生物安全实验室，且灭活 病毒的安全性尚不能保证，反转录的RNA性质很不稳定，容易降解，保存困 难，而质粒DNA作为通用的阳性模板不能模拟样本从RNA提取到进行核酸 扩增检测的整个步骤，模拟性不足，这些原因都会导致检测反应的不准确甚 至是假阴性结果，因此，作为试剂盒的阳性参照，如何构建一种可以模拟病 毒从RNA提取至核酸扩增检测步骤全过程的阳性参考物质是一个急需解决的 问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种MERS RNA核酸参考品的制备 方法，本发明的MERS核酸阳性参考品能完全模拟病毒RNA提取和核酸检测 全过程，且稳定性高，可用于MERS核酸检测试剂盒的阳性参考，利用本发 明建立的制备方法可以得到高稳定性和高拷贝数的包装了MERS upE和ORF1a RNA以及MERS ORF1b和N基因的慢病毒颗粒。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种MERS RNA 核酸参考品的制备方法，具体步骤如下：
S1、将合成的带有XbaI和BamHI的MERS upE和ORF1a基因，以及 MERS ORF1a和N基因，和慢病毒质粒分别经XbaI和BamHI酶切；
S2、将步骤S1所得的两个MERS基因的核苷酸片段分别连接到慢病毒表 达载体中，构建重组表达质粒；
S3、将两个重组的表达质粒以及慢病毒的三个包装质粒分别转化到大肠 杆菌中，进行扩增并提取相应的质粒；
S4、将步骤S3得到的两个表达质粒分别与3个包装质粒转染至细胞后进 行假病毒颗粒的包装，得到分泌在上清中包装了MERS upE和ORF1a基因以 及包装了MERS ORF1b和N基因RNA的两种假病毒颗粒；
S5、分别收集步骤S4中的细胞培养液上清菌体，过滤，收集两种假病毒 颗粒的粗产物；
S6、将步骤S5得到的两个过滤液分别经PEG8000沉淀，并收集沉淀重 悬至缓冲液PBS中；
S7、将步骤S6得到的溶液经透析袋透析除去PEG8000；
S8、将步骤S7得到的溶液用DNaseI处理，并超离重悬沉淀在PBS中后， 再超离一次，重悬沉淀在PBS中；
S9、将步骤S8得到的溶液加入冻干保护剂后，冻干得到包装了MERS upE 和ORF1a基因RNA以及包装了MERS ORF1b和N基因的两种假病毒颗粒冻 干粉。
优选的，所述步骤S1中所使用的慢病毒表达质粒载体为 pEB-copGFP(T2A)PURO。
优选的，所述步骤S2中三个包装质粒分别为VSV-G、PLP1和PLP2。
优选的，所述步骤S3中大肠杆菌为DH5α。
优选的，所述步骤S4中所转染的细胞为HEK293T细胞。
优选的，所述步骤S4中将慢病毒表达载体质粒连同三个包装质粒转化进 HEK293T的具体步骤为：
T1、分别取所需量的无血清细胞培养基(DMEM)、30μL lipofectamine 3000细胞转染试剂盒中的P3000TM试剂、3～15μg的PLP1、3～15μg的PLP2、 3～15μg的VSVG和3～15μg的pEB-copGFP(T2A)PURO-EBOV，再用无血清 细胞培养基定容至650μL，轻轻混匀；
T2、另取575μL无血清细胞培养基，稀释75μL lipofectamine 3000试剂， 加完后轻轻混匀；
T3、将步骤T1中的650μL混合液加入步骤T2中的650μL混合液，轻 轻混匀，室温孵育5min；
T4、用移液器吸净细胞培养盘中的培养基，并用D-Hanks缓冲液1-5mL 清洗细胞，将孵育完成的步骤T3中的脂质体溶液均匀的加入至25cm2的细胞 培养盘中，在37℃孵育15min；
T5、细胞培养盘中再加入5mL含有10％的胎牛血清的细胞培养液，置 于37℃含有5％的二氧化碳的细胞培养箱中培养，6h后更换新鲜的细胞培养 液，于24～120h收集上清液两次，并合并两次收集的上清。
优选的，所述步骤S6中PEG8000沉淀慢病毒颗粒的具体步骤为：在过 滤后的细胞培养液上清中加入固体NaCl至浓度为1M，溶解后加入固体PEG 8000至终浓度10％(w/v)，充分振荡溶解，四度冰箱放置过夜，使慢病毒颗 粒形成沉淀，在4℃10,000rpm离心15min，弃上清，用500μL PBS缓冲液 重悬沉淀，并转移至干净的2mL ep管。
优选的，所述步骤S7中所用到的除去PEG8000的方法是透析法，用7K 的透析袋低温透析6小时，换液3次。
优选的，所述步骤S8中DNaseI的处理浓度、温度和时间分别为0.5～2 mg/mL、37℃和1h，且步骤S8中去除DNaseI的方法为：20,000～40,000rpm 超离2～4h，并重复超离一次，收集沉淀，用PBS溶解，分装冻存。
优选的，所述步骤S9中的冻干保护剂成分为：10～30％的海藻糖和1～3％ 的BSA，且步骤S9中的冻干保护程序为：
E1、Freeze-30℃,1h 30min；
E2、Freeze-30℃,2h；
E3、Condenser preparation,15min；
E4、Chamber vacuum,400μbar；
E5、Primary drying,-40℃,200μbar,1h；
E6、Primary drying,-40℃,200μbar,17h；
E7、Secondary drying 4℃,1h；
E8、Secondary drying 4℃,4h；
E9、End of cycle。
优选的，慢病毒颗粒包装的MERS upE和ORF1a基因的cDNA序列如SEQ ID No.1所示，MERS ORF1b和N基因的cDNA如SEQ ID No.2所示。
(三)有益效果
本发明提供了一种MERS RNA核酸参考品的制备方法。与现有技术相比 具备以下有益效果：
(1)、该MERS RNA核酸参考品的制备方法，通过慢病毒包装MERS upE 和ORF1a RNA以及包装了MERS ORF1b和N基因RNA从而得到MERS RNA 核酸参考物质，该参考物质能真实模拟MERS检测过程中从样本中的RNA提 取到核酸检测的全过程。
(2)、该MERS RNA核酸参考品的制备方法，通过提供的MERS RNA 核酸参考物质，因为采用了第三代慢病毒包装系统，通过该系统得到的慢病 毒安全性高，用于核酸检测参考物质无需生物安全实验室。
(3)、该MERS RNA核酸参考品的制备方法，通过提供的通过冻干工艺 得到的包装了MERS upE和ORF1a RNA以及包装了MERS ORF1b和N基因 RNA的慢病毒颗粒稳定性高，作为MERS核酸检测的阳性参考品无需低温运 输，无需低温保存，大大节约了使用成本。
附图说明
图1为本发明实施例3制得的包装了MERS upE和ORF1a RNA的慢病毒 颗粒的TEM图；
图2为本发明实施例3中典型的qPCR检测曲线图，1为MERS-1a基因， 2为MERS-1b基因；
图3为本发明实施例3中ddPCR退火温度的示意图，设置退火温度从60℃、 59.2℃、58.0℃、56.1℃、53.8℃、51.9℃、50.7℃、50℃。在退火温度为53.8℃ 时，信号值高且区分度很好；
图4为本发明实施例5中包装了MERS upE和ORF1a RNA的慢病毒颗粒 冻干管的均匀性检测示意图，测试了15管；
图5为本发明实施例5中包装了MERS upE和ORF1a RNA的慢病毒颗粒 冻干粉在不同温度下放置两周和四周的ddPCR结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的以下实施例不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内 容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本 发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售 商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。下列实施例中未 注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人编著的《分 子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
由于常用的MERS的核酸检测阳性参考物质(质粒DNA、反转录RNA、 或灭活的病毒)存在着模拟性不足、不稳定或有安全隐患等缺点。因此，本 发明提供一种安全稳定的MERS核酸参考物质的制备方法，用慢病毒颗粒包 裹了MERS upE和ORF1a RNA或MERS ORF1b和N基因RNA，该核酸参考 物质能真实模拟病毒RNA的提取至检测的全过程，且稳定性好，安全性高， 在MERS的核酸检测试剂盒中有着很好的应用前景。
本发明的MERS核酸参考物质，是将MERS的upE和ORF1a的RNA或 MERS ORF1b和N基因RNA包装在慢病毒颗粒中，两种核酸参考物质的 MERS的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示。
一般的，通过序列组合得到的MERS的序列，通过载体包装后得到的包 装了MERSRNA的假病毒颗粒，都是基于类似的原理得到相应的阳性参考物 质，因此，由上述方法得到的包装了病毒MERS RNA的假病毒颗粒具有类似 的功能和应用，也包括在本发明的范围内
请参阅图1-5，本发明实施例提供六种技术方案：一种MERS RNA核酸 参考品的制备方法，具体包括以下实施例：
实施例1：慢病毒表达载体pEB-copGFP(T2A)PURO-upE-1a或 pEB-copGFP(T2A)PURO-1bN的构建
本实施例中，慢病毒颗粒包装MERS upE和ORF1a RNA及ORF1b和N 基因RNA采用如下方法制得：
S1、获得SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，克隆两个序 列。
S2、选取常用于核酸检测MERS的基因upE和ORF1a，以及ORF1b和N 基因，委托某基因合成公司合成，两端加上XbaI和BamHI的限制性内切酶 的位点。
S3、四质粒(包括慢病毒表达载体：pEB-copGFP(T2A)PURO和三个包装 质粒：VSV-G，PLP1，PLP2)的慢病毒包装载体购自某基因公司。将合成的 MERS upE和ORF1a基因以及ORF1b和N基因连接至慢病毒表达载体 pEB-copGFP(T2A)PURO上。具体的酶切连接过程如下：
T1、采用限制性核酸内切酶XbaI和BamH I对MERS的upE和ORF1a 序列以及ORF1b和N基因与pEB-copGFP(T2A)PURO质粒进行双酶切，双酶 切体系：5μL 10×酶切缓冲液，MERSupE和ORF1a基因的序列10μL(约1μg 片段或1μg质粒)，1μL的XbaI，1μL的BamHI，无菌水补齐至50μL，在 37℃水浴中酶切30-40min，目的片段或pEB-copGFP(T2A)PURO质粒经过双 酶切后跑胶纯化去除小片段后回收，后使用Nanodrop 2000进行浓度的测定。
T2、将酶切后的目的片段分别与表达载体，按1:10～20的摩尔比使用T4 连接酶连接，将连接产物进行大肠杆菌DH5α的转化，完成阳性克隆的筛选， 其中连接体系如下：
1μL的T4DNA连接酶，1μL的T4DNA连接缓冲液，酶切后的MERS upE和ORF1a片段或ORF1b和N基因片段和酶切后的载体 pEB-copGFP(T2A)PURO按1:10～20的摩尔比体积适量，加入无菌水将总体积 补齐至10μL，在16℃连接过夜。
T3、将连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α中，具体步骤如下：
a1、从-80℃取出感受态细胞DH5α，冰上放置5-10min。
a2、将10μL的连接产物加入已经融化的感受态细胞DH5α，并用移液器 轻轻混匀后，冰浴30min。
a3、冰浴后的感受态细胞与连接产物混合物42℃水浴90s，迅速将混合 物放至冰上，冰浴1-2min。
a4、向混合物中加入800μL无抗性的LB液体培养基，37℃，150r/min， 培养1h。
a5、4500r/min，5min离心收集菌体，弃上清，并留100μL于管内，用 移液器轻轻混匀菌体。
a6、将混匀的感受态转移到含有100μg/mL氨苄抗性的LB固体平板上， 并用无菌的涂布棒涂抹均匀。
a7、将LB固体平板在37℃恒温培养箱中培养12-16h后，挑取单克隆。
单克隆进行质粒提取后用双酶切验证，将条带正确的克隆送测序公司进 行测序验证，得到两种慢病毒表达载体质粒pEB-copGFP(T2A)PURO-upE-1a 或pEB-copGFP(T2A)PURO-1bN。
实施例2：包装了MERS upE和ORF1a RNA以及ORF1b和N基因RNA 的两种假病毒颗粒的表达
本发明中采用的慢病毒包装系统为第三代四质粒包装系统，拥有一个表 达载体以及三个包装质粒：包装系统将Rev基因单独放在一个质粒上为了阻 止同源重组产生有自我复制能力的病毒；第二个质粒表达Gag和Pol结构蛋 白；第三个质粒采用疱疹性口炎病毒糖蛋白VSV-G取代了自身的包膜蛋白 Env，相较于第一代双质粒包装系统和第二代三质粒包装系统其拥有更高的安 全性，假病毒颗粒的构建过程为：将外源基因构建入慢病毒表达载体内，连 同三个包装质粒VSV-G，PLP1，PLP2转染细胞后进行假病毒颗粒的包装， 包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，可通过PEG8000沉淀或超速 离心对假病毒颗粒进行浓缩富集，本实施例中包装了MERS upE和ORF1a RNA的假病毒颗粒的表达的具体方法如下：
首先分别将实施例1中构建的两个表达载体连同三个包装质粒转染至细 胞中。转染采用23cm2细胞培养盘，细胞为HEK293T，细胞量大约为8×106。 转染使用lipofectamine3000细胞转染试剂盒，步骤如下：
b1、取650μL无血清细胞培养基(DMEM)，用于稀释30μL的p3000TM试剂3～15μg的PLP1，3～15μg的PLP2，3～15μg的VSVG，3～15μg的 pEB-copGFP(T2A)PURO-MERS-upE-1a或pEB-copGFP(T2A)PURO-1bN，加 完后轻轻混匀。
b2、取另外的650μL无血清细胞培养基，用于稀释75μL lipofectamine 3000试剂，加完后轻轻混匀。
b3、将用于稀释质粒的650μL无血清细胞培养基加入稀释lipofectamine 3000试剂的650μL无血清细胞培养基后，轻轻混匀，室温孵育5min。
b4、用移液器吸净细胞培养盘中的培养基，并用D-Hanks缓冲液1mL清 洗一次，将孵育完成的脂质体溶液均匀的加入25cm2的细胞培养盘中。
b5、细胞培养盘中再加入5mL含有10％的胎牛血清的细胞培养液，置于 37℃，含有5％的二氧化碳的细胞培养箱中培养，6h后更换新鲜的细胞培养 液，于24～120h收集两次上清液。
接着进行假病毒颗粒的富集：将转染48h与96h后的细胞上清液收集合 并，3000rpm离心10min后使用0.45μm无菌滤膜过滤去除细胞碎片，向过 滤后的细胞上清液中加入浓度DNA酶使其终浓度为1mg/mL，消化过夜，消 化后的细胞上清液用PEG8000富集假病毒颗粒，具体过程如下：加入固体NaCl 至浓度为1M(如100mL溶液中加入5.85g NaCl)，再加入固体PEG 8000至 终浓度10％(w/v，30mL溶液加入3g PEG)，充分振荡溶解，四度冰箱放置过夜，使噬菌体颗粒形成沉淀，4℃10,000rpm离心15-20min，尽量弃尽上 清，再用500μLPBS重悬沉淀，并转移至干净的2mL ep管，20μL分装后 于-80℃保存。
实施例3：包装了MERS upE和ORF1a RNA的假病毒颗粒的验证
首先将假病毒颗粒制样后进行透射电镜TEM的观察。具体过程如下：
P1、将铜网置于20μL的包装了MERS upE和ORF1a RNA的假病毒颗粒 的微滴内，吸附10min后，取出铜网并用20μL的2％的磷钨酸(phosphotungstic acid PTA pH 6.8)进行负染固定样品30s，之后将铜网取出，置于滤纸片上晾 干过夜后进行透射电镜观察。结果如图1所示。
P2、接着用荧光定量PCR验证包装了MERS upE和ORF1a RNA的假病 毒颗粒。
P3、取30μL浓缩后的假病毒颗粒加110μL无菌水补齐至140μL，进行 假病毒颗粒的RNA提取(提取步骤参考试剂盒说明书QIAamp viral RNA minikit)，提取RNA后，利用合成的MERS的引物和探针进行荧光定量PCR (Taqman探针法)验证。采用的MERS的引物探针序列如下：
upE引物探针序列：
正向：5’-GCAACGCGCGATTCAGTT-3’
反向：5’-GCCTCTACACGGGACCCATA-3’
探针：5’-FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-BHQ-1-3’；
ORF1a引物探针序列：
正向：5’-CCACTACTCCCATTTCGTCAG-3’
反向：5’-CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA-3’
探针：5’-FAM-TTGCAAATTGGCTTGCCCCCACT-BHQ-1-3’
ORF1b引物探针序列：
正向：5’-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3’
反向：5’-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3’
探针：5’-HEX-CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT-BHQ-1-3’；
N基因引物探针序列：
正向：5’-GGCACTGAGGACCCACGTT-3’
反向：5’-TTGCGACATACCCATAAAAGCA-3’
探针：5’-FAM-CCCCAAATTGCTGAGCTTGCTCCTACA-BHQ-1-3’；
荧光定量PCR体系为(20μL体系)：10μL 2×RT qPCR mix，正向引物 和反向各0.8μL，探针(10μM)0.8μL，2μL RT-PCR酶，5μL模板，DEPC 处理过的水补齐至20μL。
荧光定量PCR扩增程序为：37℃，15min；95℃，15min；再按95℃， 15s，60℃，60s循环40次；FAM荧光检测在60℃。
P4、最后利用数字PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)对包装了MERS upE 和ORF1aRNA以及MERS ORF1b和N基因RNA的假病毒颗粒进行绝对定 量表征验证。
定量表征前对退火温度进行了优化，设置退火温度从60℃、59.2℃、58.0℃、 56.1℃、53.8℃、51.9℃、50.7℃、50℃，ddPCR检测ORF1a基因的结果如图 3所示。可以看出，退火温度为53.8℃时阳性信号与阴性信号区分最大，因此， 后续实验中采用54℃的退火温度。
按前述方法提取病毒RNA后，用BioRad一步法试剂盒One-Step RT-ddPCR kit forprobes(Bio-Rad)进行ddPCR表征。一步法RT ddPCR体系(21 μL)：5μL Supermix，2μL RT，1μL 300mM DTT，0.9μL 20μM MERS-1a 正向引物，0.9μL 20μM MERS-1a反向引物，0.5μL 10μMMERS-1a或 MERS-1b探针，2μL提取的包装了MERS upE和ORF1a RNA慢病毒的RNA 或包装了MERS ORF1b和N基因RNA慢病毒的RNA，DCEP处理的水补齐 至21μL，轻轻混匀并离心10s后，自动分液滴后进行PCR扩增。PCR扩增 程序为：46℃60min；95℃10min；再按95℃30s，54℃60s，循环 40次；98℃10min。反应完成后使用数字PCR微滴检测仪进行信号检测， 如图1所示，制得的包装了MERS upE和ORF1a RNA的慢病毒颗粒的大小在80-120nm范围内，图2的qPCR检测曲线图中，1为MERS-1a基因，2为 MERS-1b基因，图3ddPCR退火温度的示意图，设置退火温度从60℃、59.2℃、 58.0℃、56.1℃、53.8℃、51.9℃、50.7℃、50℃，在退火温度为53.8℃时，信 号值高且区分度很好。
实施例4：慢病毒颗粒冻干粉的制备
在分装的20μL假病毒颗粒溶液中加入20μL 20～60％海藻糖，2～6％BSA 的假病毒冻干保护剂，轻轻混匀后，置于冷冻干燥仪(Telstar，LYOBETA 3PS， 西班牙)，设置冻干工艺如下：
E1、Freeze-30℃,1h 30min；
E2、Freeze-30℃,2h；
E3、Condenser preparation,15min；
E4、Chamber vacuum,400μbar；
E5、Primary drying,-40℃,200μbar,1h；
E6、Primary drying,-40℃,200μbar,17h；
E7、Secondary drying 4℃,1h；
E8、Secondary drying 4℃,4h；
E9、End of cycle。
运行结束后，制成假病毒颗粒冻干粉，置于4℃保存。
实施例5：慢病毒颗粒作为MERS病毒核酸检测阳性参考物质的质量评 估
慢病毒颗粒冻干粉中加入140μL PBS复溶，涡旋混匀，首先进行定值。 取三管MERSupE和ORF1a的慢病毒冻干粉或三管MERS ORF1b和N基因 的慢病毒冻干粉进行定值，结果如表1和表2所示。
表1.MERS upE和ORF1a的假病毒颗粒冻干管的定值(20倍稀释进行ddPCR检测)
Figure BDA0002234302240000131
表2.MERS ORF1b和N假病毒颗粒冻干管的定值(20倍稀释进行ddPCR检测)
Figure BDA0002234302240000132
接着进行慢病毒颗粒的均一性表征，从包装了MERS upE和ORF1a RNA 的慢病毒颗粒冻干粉300份中随机抽取15份，利用ddPCR一步法进行均一性 测试。MERS upE和ORF1aRNA的结果如表3所示。可以得到，均值的95％ 置信区间为7.01-7.07。
表3.包装了MERS upE和ORF1a RNA的假病毒颗粒的均匀性表征
Figure BDA0002234302240000133
Figure BDA0002234302240000141
然后测试了假病毒颗粒在不同温度下的稳定性，假病毒颗粒的稳定性与 衣壳蛋白的稳定性直接相关，与内部包装的基因序列无关，因此以包装了 MERS upE和ORF1a的慢病毒颗粒为研究对象，将假病毒颗粒冻干粉管分别 置于-80℃，-20℃，4℃，20℃，37℃，45℃和56℃放置两周和四周，提取RNA 进行qPCR和ddPCR的表征，测试假病毒颗粒溶液在不同温度下的稳定性。 相应的结果如图4和图5所示。从两个图均可以看出，从-80℃-45℃的条件下， 两周和四周的qPCR的Ct值以及ddPCR的copies/μL变化不明显，因此包装 了MERSupE和ORF1a RNA的慢病毒颗粒在温度高至45℃均有很好的稳定 性，图4中，测试了15管。
实施例6：慢病毒颗粒阳性参考品的应用验证
为了验证本实验所制备出的假病毒颗粒作为标准参考物质的可靠性，本 实验通过将假病毒溶液样本进行随机排布，制成样品板，每块样品板含有4 个待测样本，其中24块样品板中含有2个不同浓度的阳性样本，2个阴性样 本；另外25块板中含有全部3个不同浓度阳性样本，1个阴性样本。将样品 板编号后记录后快递寄送至全国49家参与本实验测评的检测机构，各机构通 过自己不同的RNA提取方法，不同的荧光定量检测方法(包括不同的引物以 及检测仪器)对样品板进行检测，每个样品至少检测两种靶标基因。最后将 各实验室检测结果回收统计进行分析。回收各实验室检测结果并整理如表4 所示。由检测结果可见，大部分检测试剂盒检测MERS病毒所用的靶标基因 为upE(46.5％)与ORF1b(41.6％)，而使用N基因(11.7％)的比例较小。 检测回收结果显示各种试剂盒都达到了100％的检测准确率，证明本研究包装 的假病毒颗粒可以作为MERS病毒检测的阳性参考物质。
表4 49家实验室RT-PCR测定结果统计
Figure BDA0002234302240000151
本发明的方法可以用于其它烈性病毒RNA阳性参考物的构建，只需要将 MERS病毒核酸替换为其他烈性病毒常用的检测靶标核酸，包装出安全性高 的假病毒颗粒，即可用于制备其他烈性病毒阳性参考品。
Seq No.1：包装的MERS upE和ORF1a基因的cDNA序列
TCTAGATAATGGTACACATACCGGTTCAGCATTTGATGGTACTATGTA TGGTGCCTTTATGGATAAACAAGTGCACCAAGTTCAGTTAACAGACAAA TACTGCAGTGTTAATGTAGTAGCTTGGCTTTACGCAGCAATACTTAATGG TTGCGCTTGGTTTGTAAAACCTAATCGCACTAGTGTTGTTTCTTTTAATGA ATGGGCTCTTGCCAACCAATTCACTGAATTTGTTGGCACTCAATCCGTTG ACATGTTAGCTGTCAAAACAGGCGTTGCTATTGAACAGCTGCTTTATGCG ATCCAACAACTTTATACTGGGTTCCAGGGAAAGCAAATCCTTGGCAGTA CTATGTTGGAAGATTAATTCACACCTGAGGATGTTAATATGCAGATTATGG GTGTGGTTATGCAGAGTGGTGTGAGAAAAGTTACATATGGTACTGCGCAT TGGTTGTTCGCGACCCTTGTTTCAACCTATGTGATAATCTTACAAGCCAC TAAATTTACTTTGTGGAACTACTTGTTTGAGACTATTCCCACACAGTTGT TCCCACTCTTATTTGTGACTATGGCCTTCGTTATGTTGTTGGTTAAACACA AACACACCTTTTTGACACTTTTCTTGTTGCCTGTGGCTATTTGTTTGACTT ATGCAAACATAGTCTACGAGCCCACTACTCCCATTTCGTCAGCGCTGATT GCAGTTGCAAATTGGCTTGCCCCCACTAATGCTTATATGCGCACTACACA TACTGATATTGGTGTCTACATTAGTATGTCACTTGTATTAGTCATTGTAGTG AAGAGATTGTACAACCCATCACTTTCTAACTTTGCGTTAGCATTGTGCAG TGGTGTAATGTGGTTGTACACTTATAGCATTGGAGAAGCCTCAAGCCCCA TTGCCTATCTGGTTTTTGTCACTACACTCACTAGTGATTATACGATTACAG TCTTTGTTACTGTCAACCTTGCAAAAGTTTGCACTTATGCCATCTTTGCTT ACTCACCACAGCTTACACTTGTGTTTCCGGAAGTGAAGATGATACTTTTA TTATACACATGTTTAGGTTTCATGTGTACTTGCTATTTTGGTGTCTTCTCTT TTTTGAACCTTAAGCTTAGAGCACCTATGGGTGTCTATGACTTTAAGGTC TCAACACAAGAGTTCAGATTCATGACTGCTAACAATCTAACTGCACCTA GAAATTCTTGGGAGGCTATGGCTCTGAACTTTAAGTTAATAGGTATTGGC GGTACACCTTGTATAAAGGTTGCTGCTATGCAGTCTAAACTTACAGATCT TAAATGCACATCTGTGGTTCTCCTCTCTGTGCTCCAACAGTTACACTTAG AGGCTAATAGTAGGGCCTGGGCTTTCTGTGTTAAATGACATAATGACATA TTGGCAGCAACAGACCCCAGTGAGGCTTTCGAGAAATTCGTAAGTCTCT TTGCCACTTTAATGACTTTTTCGACAAAGCGTAACGTCATTCCTACCATG ACTCAAATGAATCTAAAATATGCTATTAGTGCTAAGAATAGAGCTCGCAC TGTTGCAGGCGTGTCCATACTTAGCACAATGACTAATCGCCAGTACCATC AGAAAATGCTTAAGTCCATGGCTGCAACTCGTGGAGCGACTTGCGTCAT TGGTACTACAAAGTTCTATGGTGGCTGGGATTTCATGCTTAAAACATTGT ACAAAGATGTTGATAATCCGCATCTTATGGGTTGGGATTACCCTAAGTGT GATAGAGCTATGCCTAATATGTGTAGAATCTTCGCTTCACTCATATTAGCT CGTAAACATGGCACTTGTTGTACTACAAGGGACAGATTTTATCGCTTGGC AAATGAGTGTGCTCAGGTGCTAAGCGAATATGTTCTATGTGGTGGTGGTT ACTACGTCAAACCTGGAGGTACCAGTAGCGGAGATGCCACCACTGCATA AGCCAATAGTGTCTTTAACATTTTGCAGGCGACAACTGCTAATGTCAGTG CACTTATGGGTGCTAATGGCAACAAGATTGTTGACAAAGAAGTTAAAGA CATGCAGTTTGATTTGTATGTCAAGAATTCGAATTCGAATTCCTACATTCC ACTGTTTGACATGCGTTCCCACTTTATTCGTGTTAGTACAGTTTCTTCTCATGGTATGGTCCCTG
TAATACACACCAAACCATTATTTATTAGAAACTTCGATCAGCGTTGC AGCTGTTCTCGTTGTTTTTATTTGCACTCTTCCACTTATATAGAGTGCACT TATATTAGCCGTTTTAGTAAGATTAGCCTAGTTTCTGTAACTGACTTCTCC TTAAACGGCAATGTTTCCACTGTTTTCGTGCCTGCAACGCGCGATTCAGT TCCTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCGCTTATCGTTTAAGCAGCTCTGC GCTACTATGGGTCCCGTGTAGAGGCTAATCCATTAGTCTCTCTTTGGACAT ATGGAAAACGAACTATGTTACCCTTTGTCCAAGAACGAATAGGGTTGTT CATAGTAAACTTTTTCATTTTTACCGTAGTATGTGCTATAACACTCTTGGT GTGTATGGCTTTCCTTACGGCTACTAGATTATGTGTGCAATGTATGACAGG CTTCAATACCCTGTTAGTTCAGCCCGCATTATACTTGTATAATACTGGACG TTCAGTCTATGTAAAATTCCAGGATAGTAAACCCCCTCT。
Seq No.2：包装的MERS ORF1b和N基因的cDNA序列
ATTTTATTACTGCCAATCCGGCATGGAGTAAGGCAGTCTTTATTTCGC CTTACAATTCACAGAATGCTGTGTCTCGTTCAATGCTGGGTCTTACCACT CAGACTGTTGATTCCTCACAGGGTTCAGAATACCAGTACGTTATCTTCTG TCAAACAGCAGATACGGCACATGCTAACAACATTAACAGATTTAATGTTG CAATCACTCGTGCCCAAAAAGGTATTCTTTGTGTTATGACATCTCAGGCA CTCTTTGAGTCCTTAGAGTTTACTGAATTGTCTTTTACTAATTACAAGCTC CAGTCTCAGATTGTAACTGGCCTTTTTAAAGATTGCTCTAGAGAAACTTC TGGCCTCTCACCTGCTTATGCACCAACATATGTTAGTGTTGATGACAAGT ATAAGACGAGTGATGAGCTTTGCGTGAATCTTAATTTACCCGCAAATGTC CCATACTCTCGTGTTATTTCCAGGATGGGCTTTAAACTCGATGCAACAGT TCCTGGATATCCTAAGCTTTTCATTACTCGTGAAGAGGCTGTAAGGCAAG TTCGAAGCTGGATAGGCTTCGATGTTGAGGGTGCTCATGCTTCCCGTAAT GCATGTGGCACCAATGTGCCTCTACAATTAGGATTTTCAACTGGTGTGAA CTTTGTTGTTCAGCCAGTTGGTGTTGTAGACACTGAGTGGGGTAACATG TTAACGGGCATTGCTGCACGTCCTCCACCAGGTGAACAGTTTAAGCACC TCGTGCCTCTTATGCATAAGGGGGCTGCGTGGCCTATTGTTAGACGACGT ATAGTGCAAATGTTGTCAGACACTTTAGACAAATTGTCTGATTACTGTAC GTTTGTTTGTTGGGCTCATGGCTTTGAATTAACGTCTGCATCATACTTTTG CAAGATAGGTAAGGAACAGAAGTGTTGCATGTGCAATAGACGCGCTGCA GCGTACTCTTCACCTCTGCAATCTTATGCCTGCTGGACTCATTCCTGCGG TTATGATTATGTCTACAACCCTTTCTTTGTCGATGTTCAACAGTGGGGTTA TGTAGGCAATCTTGCTACTAATCACGATCGTTATTGCTCTGTCCATCAAGG AGCTCATGTGGCTTCTAATGATGCAATAATGACTCGTTGTTTAGCTATTCA TTCTTGTTTTATAGAACGTGTGGATTGGGATATAGAGTATCCTTATATCTC ACATGAAAAGAAATTGAATTCCTGTTGTAGAATCGTTGAGCGCAACGTC GTACGTGCTGCTCTTCTTGCCGGTTCATTTGACAAAGTCTATGATATTGG CGCTTCGAGCTTAGGCTCTTTAGTAAGAGTATCTTAATTGATTTTAACGAA TCTCAATTTCATTGTTATGGCATCCCCTGCTGCACCTCGTGCTGTTTCCTT TGCCGATAACAATGATATAACAAATACAAACCTATCTCGAGGTAGAGGAC GTAATCCAAAACCACGAGCTGCACCAAATAACACTGTCTCTTGGTACAC TGGGCTTACCCAACACGGGAAAGTCCCTCTTACCTTTCCACCTGGGCAG GGTGTACCTCTTAATGCCAATTCTACCCCTGCGCAAAATGCTGGGTATTG GCGGAGACAGGACAGAAAAATTAATACCGGGAATGGAATTAAGCAACT GGCTCCCAGGTGGTACTTCTACTACACTGGAACTGGACCCGAAGCAGCA CTCCCATTCCGGGCTGTTAAGGATGGCATCGTTTGGGTCCATGAAGATGG CGCCACTGATGCTCCTTCAACTTTTGGGACGCGGAACCCTAACAATGAT TCAGCTATTGTTACACAATTCGCGCCCGGTACTAAGCTTCCTAAAAACTT CCACATTGAGGGGACTGGAGGCAATAGTCAATCATCTTCAAGAGCCTCT AGCTTAAGCAGAAACTCTTCCAGATCTAGTTCACAAGGTTCAAGATCAG GAAACTCTACCCGCGGCACTTCTCCAGGTCCATCTGGAATCGGAGCAGT AGGAGGTGATCTACTTTACCTTGATCTTCTGAACAGACTACAAGCCCTTG AGTCTGGCAAAGTAAAGCAATCGCAGCCAAAAGTAATCACTAAGAAAG ATGCTGCTGCTGCTAAAAATAAGATGCGCCACAAGCGCACTTCCACCAA AAGTTTCAACATGGTGCAAGCTTTTGGTCTTCGCGGACCAGGAGACCTC CAGGGAAACTTTGGTGATCTTCAATTGAATAAACTCGGCACTGAGGACC CACGTTGGCCCCAAATTGCTGAGCTTGCTCCTACAGCCAGTGCTTTTATG GGTATGTCGCAATTTAAACTTACCCATCAGAACAATGATGATCATGGCAA CCCTGTGTACTTCCTTCGGTACAGTGGAGCCATTAAACTTGACCCAAAG AATCCCAACTACAATAAGTGGTTGGAGCTTCTTGAGCAAAATATTGATGC CTACAAAACCTTCCCTAAGAAGGAAAAGAAACAAAAGGCACCAAAAG AAGAATCAACAGACCAAATGTCTGAACCTCCAAAGGAGCAGCGTGTGC AAGGTAGCATCACTCAGCGCACTCGCACCCGTCCAAGTGTTCAGCCTGG TCCAATGATTGATGTTAACACTGATTAGTGTCACTCAAAGTAACAAGATC GCGGCAATCGTTTGTGTTTGGCAACCCCATCTCACCATCGCTTGTCCACT CTTGCACAGAATGGAATCATGTTGTAATTACAGTGCAATAAGGTAATTAT AACCCATTTAATTGATAGCTATGCTTTATTAAAGTGTGTAGCTGTAGAGAG AATGTTAAAGACTGTCACCT。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来 将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示 这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、 “包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系 列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明 确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有 的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而 言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行 多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限 定。

Claims (10)

1.一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
S1、将合成的带有XbaI和BamHI的MERS upE和ORF1a基因，以及MERS ORF1a和N基因，和慢病毒质粒分别经XbaI和BamHI酶切；
S2、将步骤S1所得的两个MERS基因的核苷酸片段分别连接到慢病毒表达载体中，构建重组表达质粒；
S3、将两个重组的表达质粒以及慢病毒的三个包装质粒分别转化到大肠杆菌中，进行扩增并提取相应的质粒；
S4、将步骤S3得到的两个表达质粒分别与3个包装质粒转染至细胞后进行假病毒颗粒的包装，得到分泌在上清中包装了MERS upE和ORF1a基因以及包装了MERS ORF1b和N基因RNA的两种假病毒颗粒；
S5、分别收集步骤S4中的细胞培养液上清菌体，过滤，收集两种假病毒颗粒的粗产物；
S6、将步骤S5得到的两个过滤液分别经PEG8000沉淀，并收集沉淀重悬至缓冲液PBS中；
S7、将步骤S6得到的溶液经透析袋透析除去PEG8000；
S8、将步骤S7得到的溶液用DNaseI处理，并超离重悬沉淀在PBS中后，再超离一次，重悬沉淀在PBS中；
S9、将步骤S8得到的溶液加入冻干保护剂后，冻干得到包装了MERS upE和ORF1a基因RNA以及包装了MERS ORF1b和N基因的两种假病毒颗粒冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中所使用的慢病毒表达质粒载体为pEB-copGFP(T2A)PURO。
3.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中三个包装质粒分别为VSV-G、PLP1和PLP2。
4.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中大肠杆菌为DH5α。
5.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中所转染的细胞为HEK293T细胞。
6.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中将慢病毒表达载体质粒连同三个包装质粒转化进HEK293T的具体步骤为：
T1、分别取所需量的无血清细胞培养基、30μL lipofectamine 3000细胞转染试剂盒中的P3000TM试剂、3～15μg的PLP1、3～15μg的PLP2、3～15μg的VSVG和3～15μg的pEB-copGFP(T2A)PURO-EBOV，再用无血清细胞培养基定容至650μL，轻轻混匀；
T2、另取575μL无血清细胞培养基，稀释75μL lipofectamine 3000试剂，加完后轻轻混匀；
T3、将步骤T1中的650μL混合液加入步骤T2中的650μL混合液，轻轻混匀，室温孵育5min；
T4、用移液器吸净细胞培养盘中的培养基，并用D-Hanks缓冲液1-5mL清洗细胞，将孵育完成的步骤T3中的脂质体溶液均匀的加入至25cm2的细胞培养盘中，在37℃孵育15min；
T5、细胞培养盘中再加入5mL含有10％的胎牛血清的细胞培养液，置于37℃含有5％的二氧化碳的细胞培养箱中培养，6h后更换新鲜的细胞培养液，于24～120h收集上清液两次，并合并两次收集的上清。
7.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S6中PEG8000沉淀慢病毒颗粒的具体步骤为：在过滤后的细胞培养液上清中加入固体NaCl至浓度为1M，溶解后加入固体PEG8000至终浓度10％，充分振荡溶解，四度冰箱放置过夜，使慢病毒颗粒形成沉淀，在4℃10,000rpm离心15min，弃上清，用500μL PBS缓冲液重悬沉淀，并转移至干净的2mL ep管。
8.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S7中所用到的除去PEG8000的方法是透析法，用7K的透析袋低温透析6小时，换液3次。
9.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S8中DNaseI的处理浓度、温度和时间分别为0.5～2mg/mL、37℃和1h，且步骤S8中去除DNaseI的方法为：20,000～40,000rpm超离2～4h，并重复超离一次，收集沉淀，用PBS溶解，分装冻存。
10.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S9中的冻干保护剂成分为：10～30％的海藻糖和1～3％的BSA，且步骤S9中的冻干保护程序为：
E1、Freeze-30℃,1h 30min；
E2、Freeze-30℃,2h；
E3、Condenser preparation,15min；
E4、Chamber vacuum,400μbar；
E5、Primary drying,-40℃,200μbar,1h；
E6、Primary drying,-40℃,200μbar,17h；
E7、Secondary drying 4℃,1h；
E8、Secondary drying 4℃,4h；
E9、End of cycle。
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