CN106800603B

CN106800603B - 检测抗hiv抗体的adcc活性的方法

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Publication number: CN106800603B
Application number: CN201710055370.9A
Authority: CN
Inventors: 王佑春; 王萌; 聂建辉; 黄维金; 刘强
Original assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Current assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Priority date: 2017-01-24
Filing date: 2017-01-24
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2037-01-24
Also published as: CN106800603A

Abstract

本发明涉及分子病毒学和基因工程领域。具体地，本发明涉及一种HIV包膜蛋白，其编码序列，以及包含其的HIV假病毒，所述HIV假病毒可用于检测抗HIV抗体的ADCC活性。本发明还涉及一种用于检测抗HIV抗体ADCC活性的试剂盒。本发明还涉及一种使用HIV假病毒检测抗HIV抗体的ADCC活性的方法，其可快速、简单、高通量的实现对抗HIV抗体ADCC活性的检测，对分析疫苗免疫反应的保护效果、新疫苗的研制和质控具有重要意义。

Description

检测抗HIV抗体的ADCC活性的方法

技术领域

本发明涉及分子病毒学和基因工程领域。具体地，本发明涉及一种HIV包膜蛋白，其编码序列，以及包含其的HIV假病毒，所述HIV假病毒可用于检测抗HIV抗体的ADCC活性。本发明还涉及一种用于检测抗HIV抗体ADCC活性的试剂盒。本发明还涉及一种使用HIV假病毒检测抗HIV抗体的ADCC活性的方法。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)属于逆转录病毒科，为双股正链RNA囊膜病毒。HIV被发现初期，也曾被称为LAV(Lymphadenopathy AssociatedVirus)或HTLV-III(Human T Lymphotropic Virus III)。目前已经发现了2类HIV，HIV-1和HIV-2。其中HIV-1流行范围广泛，当前世界上大部分感染者是HIV-1感染；HIV-2由于相对感染能力和毒性较HIV-1低，流行区域主要集中在西非。全球共有约3000万HIV感染者，每年新发150万例，死亡130万例。HIV是血液和性传播疾病，也可通过母乳、精液、阴道分泌物等接触粘膜传播。部分HIV携带人群随时间进行性免疫功能降低，逐渐发展为艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome，AIDS)，临床表现为CD4+T细胞数量降低，机会感染和肿瘤发生几率显著增加。HIV感染目前还没有治愈手段，依靠抗逆转录酶药物联合用药，可以将CD4+T细胞数维持在正常范围，延长感染者存活时间。

自30年前HIV被成功分离，全世界共尝试了超过800次HIV疫苗临床试验，但目前尚未得到有足够保护效力的HIV疫苗。保护效力最佳的临床试验，是2009年在泰国进行的RV144实验，在低危人群疫苗接种第一年有31％的保护效果。有研究显示HIV疫苗的保护效力与疫苗诱导的具有ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，Antibody-Dependentcell-mediated Cytotoxicity)活性的抗体相关(Bonsignori，M.等人，J Virol，2012.86(21)：p.11521-32)。近年来的多篇报道也提出了具备ADCC活性的抗体在抗病毒感染和治疗方面具有潜在的积极作用(参见例如，Veillette，M.等人，Curr HIV Res，2016.14(1)：p.9-23.；Corti，D.等人，Science，2016.351(6279)：p.1339-42.；Jegaskanda，S.等人，J InfectDis，2016)。因此，建立稳定、有效的针对抗HIV抗体的ADCC活性评价系统，对分析疫苗免疫反应的保护效果、新疫苗的研制和质控具有重要意义。

HIV病毒是逆转录病毒，具有高变异率的特点。这是难以制备有效疫苗的主要障碍之一，也给疫苗效力评价带来了挑战。目前用于抗HIV抗体ADCC活性的评价方法，主要包括：

1)铬51(Cr⁵¹)释放试验：在待测抗体存在的情况下，检测效应细胞对Cr⁵¹标记的靶细胞的杀伤情况，通过检测培养上清中释放的Cr⁵¹，可以评价靶细胞的死亡比例，推断出抗体的ADCC活性。该试验操作复杂，操作周期长，一共需要约8天时间，对试验操作者的熟练程度要求较高，不适于大批量样本检测。另外该试验需要进行HIV活病毒培养，需要BSL-3级实验室的操作环境，对安全性要求高。此外，放射性同位素Cr⁵¹的使用，也加大了操作者的风险。废物处理成本也很难降低。

2)乳酸脱氢酶(Lactic Dehydrogenase，LDH)释放试验：LDH是正常人体细胞中代谢所必需的一种酶，在同类细胞中含量稳定，在被杀伤裂解时，释放到胞外。当HIV感染的靶细胞被具有ADCC活性的抗体识别，在效应细胞的杀伤作用下裂解，靶细胞内源LDH会释放到上清中。因此测量上清中LDH的含量，与阳性对照相比，可以评价细胞的裂解情况，推断出待测样品中ADCC抗体的效价。目前在该方法中，仍需要使用HIV活病毒感染靶细胞，因此同样需要HIV活病毒培养，周期长，操作复杂。

3)基于双色荧光的流式检测方法：碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)和羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl amino ester，CFSE)是2种荧光染料，分别在活、死细胞中表现出不同的渗透性。CFSE是一种酯类物质，可以自由穿透细胞膜。进入活细胞的CFSE在细胞酶解作用下，失去乙酸基团，不再具有穿透细胞膜的能力，同时可以被激发出绿色荧光。而PI则无法通过活细胞膜，当细胞死亡后，细胞膜通透性增加，PI才可以进入细胞，并与与核酸结合后，可以被激发出红色荧光。评价抗体ADCC活性时，先用CFSE染色HIV感染的靶细胞，然后加入一定比例的效应细胞和待测样品，杀伤靶细胞。在用流式检测前，加入PI，对死亡的细胞进行染色。CFSE阳性的细胞是靶细胞，PI阳性的细胞是效应细胞，双阳性的细胞就是死亡的靶细胞。通过计算死亡的靶细胞的比例，可以推算出抗体ADCC的活性。然而，该方法依然没有摆脱活病毒培养的限制。另外，由于BSL-3级实验室对设备的安全要求，需要专门为HIV病毒培养配备一台流式细胞仪，设备成本进一步提高。而且，该方法受限于流式细胞仪的检测速度，难以实现高通量检测。即使在同一块96孔板上的样品，也会因检测时间长，导致杀伤时间前后不一致，对结果产生不可忽略的影响。

4)转基因工程细胞模拟效应细胞的方法：ADCC效应的主要效应细胞之一为NK细胞，其通过激活CD16a受体，开启下游NFAT信号通路，启动相应的杀伤程序。通过改造Jurkat工程细胞，加入CD16a受体，同时在NFAT通路上构建Luciferase荧光素酶标签，可以模拟NK细胞的杀伤过程。当具有ADCC活性的抗体激活改造的Jurkat细胞后，即可表达Luciferase。使用荧光底物对Luciferase的表达进行定量检测，可以推算出NFAT通路被激活的程度，即具有ADCC活性的抗体激活CD16a受体的能力。然而该方法只是对效应细胞的改进，而对于靶细胞，依然需要HIV活病毒进行感染。同时，由于Jurkat工程细胞并不杀伤靶细胞，仅用已知的NFAT通路评价杀伤效果，评价方面局限。而且激活NFAT通路的上游受体也不仅仅是CD16a一个，如果待测样品是成分复杂的血清，则结果不一定完全是ADCC激活CD16a的作用。

5)瞬转细胞模拟被感染靶细胞：通过在靶细胞上过表达HIV包膜蛋白，并加入可溶性CD4蛋白与细胞表面包膜蛋白结合，形成特定的结构，类似被病毒感染的CD4+T细胞表面的CD4分子，以模拟被HIV感染的靶细胞，从而检测特定抗体的ADCC效果。但该方法属于非真实感染过程，真实状态下，被感染细胞表面不会表达如此多的包膜蛋白。周期长，重复性差，难以控制每批次抗原表达量相同。成本较高，需要事先表达纯化可溶性CD4蛋白。

综上所述，目前已有的抗HIV抗体ADCC活性检测方案均依赖于HIV活病毒培养，难以脱离BSL-3级实验室，受限于实验室安全等级和病毒毒株数量，现有检测方法难以满足大规模临床试验样本的评价，亟需开发一种简单、快速、高通量的抗HIV抗体的ADCC活性评价方法。

发明内容

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、细胞生物学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“GX-SF包膜蛋白”是指，包含AE型HIV病毒(例如，病毒株GX88)包膜蛋白的笫1-476位氨基酸残基以及B亚型HIV病毒(例如，病毒株SF162)包膜蛋白的笫463-847位氨基酸残基的一种重组包膜蛋白，其中，所述AE型HIV病毒包膜蛋白的笫1-476位氨基酸残基与B亚型HIV病毒包膜蛋白的笫463-847位氨基酸残基的N端相连接。通常可以通过将AE型HIV病毒(例如，病毒株GX88)包膜蛋白编码序列从1428bp位点处打断，并将该序列前1-1428bp连接到B亚型HIV病毒(例如，病毒株SF162)包膜蛋白编码序列的笫1387bp位点之前，从而获得编码所述GX-SF包膜蛋白的序列。病毒株GX88和病毒株SF162是本领域已知的HIV病毒株(参见例如，Nie，J.等人，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.53(4)，440-450(2010)；Cheng-Mayer，C.等人，J.Virol.71(2)，1657-1661(1997))。此外，病毒株GX88的包膜蛋白和病毒株SF162的包膜蛋白的氨基酸序列是本领域公知的，其分别可参见Genbank ID：GU475018.1和Genbank ID：EU123924.1。

在本发明中，表述“GX-SF假病毒”是指，包含上述GX-SF包膜蛋白的重组HIV假病毒。

如本文中所使用的，术语“假病毒”是指，由病毒衣壳蛋白或包膜蛋白所形成的病毒样颗粒，通常其不包裹核酸或包裹经基因删除或修饰后的病毒核酸。通常而言，由于假病毒内不包含核酸或所包含的病毒核酸基因组不完整，因此，假病毒只具有单轮感染的能力，而不具有产生子代病毒的复制能力，具有较高的生物安全性。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。

在本发明中，包装载体是指这样的载体，其能够表达除包膜蛋白以外的、形成HIV病毒样颗粒所必需的其他蛋白，例如HIV的gag、pol、tat和vpu蛋白等。通常可以通过将HIV完整基因组中的包膜蛋白编码基因和调控基因进行修饰或删除从而构建包装载体。此外，用于组装HIV病毒样颗粒/假病毒的包装载体以及构建此类包装载体的方法是本领域已知的，参见例如中国专利申请CN104830908A，其全文通过引用并入本文。

如本文中所使用的，gag、pol、tat和vpu蛋白，分别是指HIV核酸保护蛋白(gag)、复制所需所有酶类蛋白(pol)、转录激活因子(tat)和病毒装配成熟所需蛋白(vpu)。关于这些蛋白的详细描述可参见例如Cloyd，M.W.等人，Virology 174(1)，103-116(1990)，并且它们的氨基酸序列可分别参见例如Genbank ID：BAA12988.1、Genbank ID：BAA12989.1、GenbankID：BAA12992.1和Genbank ID：BAA12994.1。

如本文中所使用的，术语“env基因”是指，编码HIV病毒的包膜蛋白的基因。

如本文中所使用的，术语“能够检测细胞存活率的试剂”是指，能够鉴别细胞存活与死亡的试剂或试剂盒。这类试剂或试剂盒是本领域公知的，包括但不限于MTT检测法试剂、XTT检测法试剂、MTS检测法试剂、WST-1检测法试剂、WST-8检测法试剂、LDH检测法试剂或细胞凋亡检测试剂(例如CFSE/PI染色试剂、Annexin V/PI染色试剂)。

本发明至少部分基于发明人的下述出人意料的发现：包含本发明的重组包膜蛋白的HIV假病毒能够用于对抗HIV抗体的ADCC活性进行检测，具有良好的特异性和广谱性，并且其检测灵敏度显著高于其他HIV假病毒；其中，所述重组包膜蛋白包含AE型HIV病毒包膜蛋白的第1-476位氨基酸残基以及B亚型HIV病毒包膜蛋白的第463-847位氨基酸残基。基于这一发现，本发明人首次开发了使用HIV假病毒检测抗HIV抗体的ADCC活性的方法。

因此，在一个方面，本发明提供了一种重组包膜蛋白，其包含AE型HIV病毒包膜蛋白的笫1-476位氨基酸残基以及B亚型HIV病毒包膜蛋白的笫463-847位氨基酸残基，其中所述AE型HIV病毒包膜蛋白的笫1-476位氨基酸残基与所述B亚型HIV病毒包膜蛋白的笫463-847位氨基酸残基的N端连接。

在某些优选的实施方式中，所述AE型HIV病毒包膜蛋白为病毒株GX88的包膜蛋白。进一步，在某些优选的实施方式中，所述AE型HIV病毒包膜蛋白具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

在某些优选的实施方式中，所述B亚型HIV病毒包膜蛋白为病毒株SF162的包膜蛋白。进一步，在某些优选的实施方式中，所述AE型HIV病毒包膜蛋白具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在某些优选的实施方式中，所述重组包膜蛋白具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码如上所述的重组包膜蛋白。在某些优选的实施方案中，本发明的分离的核酸具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含如上所述的分离的核酸。可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在某些优选的实施方案中，所述载体为表达载体。在某些优选的实施方案中，所述载体为真核表达载体。

在另一个方面，本发明提供了一种用于组装HIV假病毒的系统，其包含表达上述重组包膜蛋白的表达载体和包装载体。在某些优选的实施方案中，所述包装载体能够表达gag、pol、tat和vpu蛋白。在某些优选的实施方案中，所述包装载体为包含缺失了env基因的HIV基因组的载体。在某些优选的实施方案中，所述包装载体为质粒。可用于组装HIV假病毒的包装载体是本领域公知的，例如详细描述于中国专利申请CN104830908A中的HIV骨架质粒(如pSG3.Δenv、pSG3.Δenv.Flue或pSC3.Δenv.cmvFluc)，其全部通过引用并入本文。

在另一个方面，本发明还涉及包含上述分离的核酸、载体或用于组装HIV假病毒的系统的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如灵长类动物细胞、人类细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如HEK293、HEK293T或HEK293FT细胞。

在另一个方面，本发明提供了一种HIV假病毒，其包含本发明的重组包膜蛋白。

在另一个方面，本发明提供了一种制备本发明的HIV假病毒的方法，其包括在宿主细胞中表达本发明的重组包膜蛋白的步骤。

在某些优选的实施方案中，所述方法包括下述步骤：(1)将表达本发明的重组包膜蛋白的表达载体和包装载体共转染宿主细胞；(2)在宿主细胞中表达所述表达载体和包装载体所编码的蛋白，所述蛋白能够自发组装成HIV假病毒；和(3)收集HIV假病毒。在某些优选的实施方案中，所述包装载体能够表达gag、pol、tat和vpu蛋白。

在某些优选的实施方案中，所述包装载体为包含缺失了env基因的HIV基因组的载体。

在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞为真核细胞，例如哺乳动物细胞，例如灵长类动物细胞，例如人类细胞。在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞选自HEK293、HEK293T或HEK293FT细胞。

在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的重组包膜蛋白、分离的核酸、载体、用于组装HIV假病毒的系统、宿主细胞或HIV假病毒。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括能够检测细胞存活率的试剂。这类试剂是本领域公知的，包括但不限于用于实施MTT检测法的试剂、用于实施XTT检测法的试剂、用于实施MTS检测法的试剂、用于实施WST-1检测法的试剂、用于实施WST-8检测法的试剂、用于实施LDH检测法的试剂或用于检测细胞凋亡的试剂(例如用于实施Annexin V/PI检测法的试剂)。在某些优选的实施方案中，所述能够检测细胞存活率的试剂通过测定LDH水平来测定细胞存活率。进一步，在某些优选的实施方案中，所述能够检测细胞存活率的试剂包括乳酸和四唑鎓化合物(例如，INT)。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含靶细胞和/或效应细胞。在某些优选的实施方案中，所述靶细胞为哺乳动物细胞，例如灵长类动物细胞，例如人类细胞。进一步，在某些优选的实施方式中，所述靶细胞为人淋巴细胞，例如人CD4阳性T淋巴细胞。在本发明中，所述靶细胞为能够被HIV病毒感染的细胞，这类细胞是本领域公知的，例如能够表达CD4受体及辅助受体CCR5/CXCR4的细胞。因此，本发明的靶细胞还可以是细胞系，例如人类嗜淋巴细胞病毒I型(HTLV-1)转化的T细胞系(如MT-4和MT-2细胞系)、HIV-1慢性感染的细胞系(如CD4 T淋巴细胞系CEM×174、人类组织细胞淋巴瘤细胞系U937、人T型类淋巴母细胞系C8166、人T淋巴细胞体外传代株的H9细胞系)、经过改造后能够表达CD4蛋白和CCR5/CXCR4辅助受体的细胞系(如TZM-BL细胞系)。在一个特别优选的实施方案中，所述靶细胞为具有抵抗NK细胞非特异性杀伤能力的细胞，例如CEM-NKr。在某些优选的实施方式中，所述效应细胞选自PBMC、NK细胞、单核细胞、细胞毒T细胞或中性粒细胞。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒用于检测抗HIV抗体的ADCC活性。进一步，在某些优选的实施方案中，所述试剂盒用于检测抗HIV-1抗体的ADCC活性。

在另一个方面，还涉及根据本发明的重组包膜蛋白、分离的核酸、载体、用于组装HIV假病毒的系统、宿主细胞或HIV假病毒用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测抗HIV抗体的ADCC活性。在某些优选的实施方式中，所述试剂盒用于检测抗HIV-1抗体的ADCC活性。

在另一个方面，本发明提供了检测包含抗HIV抗体的待测样品的ADCC活性的方法，其包括下述步骤：

(1)使用HIV假病毒感染靶细胞；

(2)将步骤(1)中的靶细胞与效应细胞和待测样品接触；和

(3)检测靶细胞的细胞存活率，从而确定待测样品的ADCC活性。

在某些优选的实施方式中，在步骤(1)中，所述HIV假病毒包含本发明的包膜蛋白。在某些优选的实施方式中，在步骤(1)中，所述HIV假病毒通过本发明的制备HIV假病毒的方法制备得到。

在某些优选的实施方式中，在步骤(1)中，所述靶细胞为哺乳动物细胞，例如灵长类动物细胞，例如人类细胞。进一步，在某些优选的实施方式中，所述靶细胞为人淋巴细胞，例如人CD4阳性T淋巴细胞。在本发明中，所述靶细胞为能够被HIV病毒感染的细胞，这类细胞是本领域公知的，例如能够表达CD4受体及辅助受体CCR5/CXCR4的细胞。因此，本发明的靶细胞还可以是细胞系，例如人类嗜淋巴细胞病毒I型(HTLV-1)转化的T细胞系(如MT-4和MT-2细胞系)、HIV-1慢性感染的细胞系(如CD4 T淋巴细胞系CEM×174、人类组织细胞淋巴瘤细胞系U937、人T型类淋巴母细胞系C8166、人T淋巴细胞体外传代株的H9细胞系)、经过改造后能够表达CD4蛋白和CCR5/CXCR4辅助受体的细胞系(如TZM-BL细胞系)。在一个特别优选的实施方案中，所述靶细胞为具有抵抗NK细胞非特异性杀伤能力的细胞，例如CEM-NKr。

在某些优选的实施方式中，在步骤(2)中，所述效应细胞选自PBMC、NK细胞、单核细胞、细胞毒T细胞或中性粒细胞。

用于检测细胞存活率的方法本领域公知的，包括但不限于MTT检测法、XTT检测法、MTS检测法、WST-1检测法、WST-8检测法、LDH检测法或细胞凋亡检测(例如Annexin V/PI检测法)。在某些优选的实施方式中，在步骤(3)中，通过测定LDH水平来测定细胞存活率。

在某些优选的实施方式中，所述抗HIV抗体为抗HIV-1抗体。

在某些优选的实施方式中，所述抗HIV抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

在某些优选的实施方式中，所述待测样品为来自受试者的抗血清。进一步，在某些优选的实施方式中，所述受试者为哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。

发明的有益效果

目前抗HIV抗体的ADCC活性检测方法均需要使用活病毒，而HIV活病毒的培养无论从实验室安全等级还是从病毒毒株数量上，都难以满足大规模临床试验和复杂多变的HIV毒株变异。

本发明提供了一种HIV重组包膜蛋白、包含该包膜蛋白的HIV假病毒以及基于该假病毒建立的检测抗HIV抗体ADCC活性的方法，与传统的基于活病毒的抗HIV抗体的ADCC活性检测手段相比，对于多种HIV抗体的检测具有较高的灵敏度和特异性，同时大大降低了HIV培养的生物安全风险，使得抗HIV抗体的ADCC活性检测在BSL-2实验室即可进行。并且，本发明的方法在12个小时内即可完成，大大缩短了传统ADCC活性检测所需的时间；在整个操作过程中对实验条件、人员的技术能力、设备和环境的要求不高，无需高成本设备、耗材和同位素，可以在常规实验室内完成全部，使用范围较广。因此，本发明的基于HIV假病毒的ADCC检测方法能够安全快速地检测抗HIV抗体的ADCC活性，具有显著的有利技术效果。这在大规模临床样本筛查(例如HIV疫苗ADCC抗体的评价、HIV治疗效果评价)等方面具有特别显著的优势。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了实施例1中，编码GX-SF重组包膜蛋白的核酸序列的改造流程示意图。

图2显示了实施例1中，编码GX-SF重组包膜蛋白的核酸序列的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的结果。

图3显示了实施例4中，感染复数(MOI)对GX-SF假病毒ADCC检测法的影响。其中，图3A的横坐标表示A32抗体对不同MOI条件下的病毒感染的靶细胞的结合强度，纵坐标表示相对细胞数，其中N表示未经病毒感染的正常靶细胞；图3B的横坐标表示病毒的感染复数(MOI)，左侧纵坐标表示A32抗体的识别比值(A32抗体结合病毒感染后的靶细胞的平均荧光强度与未感染病毒的正常靶细胞本底平均荧光强度的比值)，右侧纵坐标表示抗体的ADCC最大杀伤比例。

图4显示了实施例4中，病毒孵育时间对GX-SF假病毒ADCC检测法的影响。其中，图4A的横坐标表示A32抗体对不同病毒孵育时间条件下的病毒感染的靶细胞的结合强度，纵坐标表示相对细胞数，其中N 表示未经病毒感染的正常靶细胞；图4B的横坐标表示病毒孵育时间(单位为小时，hrs)，左侧纵坐标表示A32抗体的识别比值(A32抗体结合病毒感染后的靶细胞的平均荧光强度与未感染病毒的正常靶细胞本底平均荧光强度的比值)，右侧纵坐标表示抗体的ADCC最大杀伤比例。

图5显示了实施例4中，效靶比(ETR)对GX-SF假病毒ADCC检测法的影响。其中，图5为不同ETR条件下获得的ADCC杀伤拟合曲线，横坐标表示A32抗体浓度的Log值，纵坐标表示抗体的ADCC杀伤比例。

图6显示了实施例4中，杀伤时间对GX-SF假病毒ADCC检测法的影响。其中，图6为不同杀伤时间条件下获得的ADCC杀伤拟合曲线，横坐标表示A32抗体浓度的Log值，纵坐标表示抗体的ADCC杀伤比例。

图7A-7B显示了实施例5中，GX-SF假病毒ADCC检测法的特异性评价结果。其中，图7A显示了使用GX-SF假病毒ADCC检测法测定HIV-1阴性样品的ADCC活性的检测结果，横坐标表示稀释度(倍数)，纵坐标表示样品的ADCC最大杀伤比例；图7B显示了使用GX-SF假病毒ADCC检测法测定HIV-1阳性样品的ADCC活性的检测结果，横坐标表示稀释度(倍数)，纵坐标表示样品的ADCC最大杀伤比例。

图8显示了实施例6中，GX-SF假病毒ADCC检测法与瞬时转染ADCC检测法的比较结果。其中，图8A的横坐标表示A32抗体对靶细胞的结合强度，纵坐标表示相对细胞数，其中Transfected Cells表示采用瞬时转染法获得的靶细胞，Infected Cells表示采用GX-SF假病毒法获得的靶细胞，N表示未经瞬时转染或病毒感染的正常靶细胞；图8B的横坐标表示瞬时转染法的转染拷贝数，纵坐标表示A32抗体的识别比值(A32抗体结合瞬时转染后的靶细胞的平均荧光强度与靶细胞本底平均荧光强度的比值)；图8C为采用瞬时转染法(Transfected)和GX-SF假病毒法(Infected)分别获得的ADCC杀伤拟合曲线，横坐标表示A32抗体浓度的Log值，纵坐标表示抗体的ADCC杀伤比例。

图9显示了实施例7中，GX-SF假病毒ADCC检测法对多种抗HIV 抗体ADCC活性的检测结果以及与基于其他假病毒的ADCC检测模型的结果比较。

序列信息

本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

SEQ ID NO：	描述
		1	GX88包膜蛋白的氨基酸序列
2	SF162包膜蛋白的氨基酸序列
		3	GX-SF重组包膜蛋白的氨基酸序列
4	编码SEQ ID NO：3的DNA序列
		5	引物
6	引物
		7	引物
8	引物
		9	引物
10	引物

序列1(SEQ ID NO：1)：

MRVRETQMNWPNLWKWGTLILGLVIMCSASNNLWVTVYYGVPVWRDADTTLFCASDAKAHETEVHNVWATHACVPTDPNPQEIYLANVTENFNMWKNNMAEQMQEDVISLWDQSLKPCVKLTPLCVTLNCTNANWTNVTRTNDPIGNITDEVKNCTFNMTTDLRDKNQQVHALFDTLDIVHMTNKEYRLINCNTSVIKQACPKISFDPIPIHYCTPAGYVILKCNDKNFNGTGPCKNVSSVQCTHGIKPVVSTQLLLNGSLAEEEIIIRSENLTNNAKTIIVHLNESVEINCTRPSNRTRTRMTMGLGHVFYKTEIITGDIRKAYCKINATKWYKVLGQVTGKLKERFNKTTITFKPHSGGDLEIKTHHFNCRGEFFYCNTSKLFTCIGNTSRGECNDTIILPCRIKQIINMWQGVGQAMYAPPISGAINCVSNITGILLTRDGENNTSNETFRPEGGNIKDNWRNELYKYKVVEIEPLGIAPTRAKRRVVEREKRAVGIGALIFGFLGAAGSTMGAASITLTVQARKLLSGIVQQQSNLLRAIEAQQHMLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQEFLGLWGCSGKIICTTAVPWNSSWSNKSYDEIWYNMTWVEWEREISNYTGLIYGILTKSQNQQDQNEKDLLELDQWASLWNWFSITKWLWYIKIFIIIVGSLIGLRIVFAVLSIVNRVRQGYSPLSFQTPTRPQREPDRLEEIGEEGGEQGKARSIRLVSGFLALTWDDLRSLCLFSYHLLRDFILIAARTVELLGHSSLKGLRRGWEGLKYLGNLLLYWGQELKISAISLLNATAITVAGWTDRVIEVAQRAWRAFIHIPRRIRQGLERALL

序列2(SEQ ID NO：2)：

MRVKGIRKNYQHLWRGGTLLLGMLMICSAVEKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEIVLENVTENFNMWKNNMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVTLHCTNLKNATNTKSSNWKEMDRGEIKNCSFKVTTSIRNKMQKEYALFYKLDVVPIDNDNTSYKLINCNTSVITQACPKVSFEPIPIHYCAPAGFAILKCNDKKFNGSGPCTNVSTVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEGVVIRSENFTDNAKTIIVQLKESVEINCTRPNNNTRKSITIGPGRAFYATGDIIGDIRQAHCNISGEKWNNTLKQIVTKLQAQFGNKTIVFKQSSGGDPEIVMHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTWNNTIGPNNTNGTITLPCRIKQIINRWQEVGKAMYAPPIRGQIRCSSNITGLLLTRDGGKEISNTTEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKRAVTLGAMFLGFLGAAGSTMGAASLTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLDQIWNNMTWMEWER EIDNYTNLIYTLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFDISKWLWYIKIFIMIVGGLVGLRIVFTVLSIVNRVRQGYSPLSFQTRFPAPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSSPLVHGLLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLILIAARIVELLGRRGWEALKYWGNLLQYWIQELKNSAVSLFDAIAIAVAEGTDRIIEVAQRIGRAFLHIPRRIRQGFERALL

序列3(SEQ ID NO：3)：

MRVRETQMNWPNLWKWGTLILGLVIMCSASNNLWVTVYYGVPVWRDADTTLFCASDAKAHETEVHNVWATHACVPTDPNPQEIYLANVTENFNMWKNNMAEQMQEDVISLWDQSLKPCVKLTPLCVTLNCTNANWTNVTRTNDPIGNITDEVKNCTFNMTTDLRDKNQQVHALFDTLDIVHMTNKEYRLINCNTSVIKQACPKISFDPIPIHYCTPAGYVILKCNDKNFNGTGPCKNVSSVQCTHGIKPVVSTQLLLNGSLAEEEIIIRSENLTNNAKTIIVHLNESVEINCTRPSNRTRTRMTMGLGHVFYKTEIITGDIRKAYCKINATKWYKVLGQVTGKLKERFNKTTITFKPHSGGDLEIKTHHFNCRGEFFYCNTSKLFTCIGNTSRGECNDTIILPCRIKQIINMWQGVGQAMYAPPISGAINCVSNITGILLTRDGENNTSNETFRPEGGNIKDNWRNELYKYKVVEIGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKRAVTLGAMFLGFLGAAGSTMGAASLTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLDQIWNNMTWMEWEREIDNYTNLIYTLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFDISKWLWYIKIFIMIVGGLVGLRIVFTVLSIVNRVRQGYSPLSFQTRFPAPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSSPLVHGLLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLILIAARIVELLGRRGWEALKYWGNLLQYWIQELKNSAVSLFDAIAIAVAEGTDRIIEVAQRIGRAFLHIPRRIRQGFERALL

序列4(SEQ ID NO：4)：

ATGAGAGTGAGGGAGACACAGATGAATTGGCCAAACTTGTGGAAATGGGGGACTTTGATCCTTGGGTTGGTGATAATGTGTAGTGCCTCAAACAACTTGTGGGTTACAGTTTATTATGGGGTTCCTGTGTGGAGAGATGCAGATACCACCCTATTTTGTGCATCAGATGCCAAAGCACATGAGACAGAAGTACACAATGTCTGGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAGACCCCAACCCACAAGAAATATACCTGGCAAATGTAACAGAAAATTTTAACATGTGGAAAAATAACATGGCAGAGCAGATGCAGGAGGATGTAATTAGTTTATGGGATCAAAGTCTAAAGCCATGTGTAAAGTTAACTCCTCTCTGCGTTACTTTAAATTGTACCAATGCTAATTGGACCAATGTTACTCGGACAAATGACCCTATAGGAAATATAACAGATGAAGTAAAAAACTGCACTTTTAATATGACCACAGACCTAAGAGATAAGAACCAGCAGGTCCATGCACTGTTTGATACGCTTGATATAGTACACATGACTAATAAGGAGTATAGGTTAATAAATTGTAATACTTCAGTCATTAAGCAGGCTTGTCCAAAGATATCCTTTGATCCAATTCCTATACATTATTGTACTCCAGCTGGTTATGTGATTTTAAAGTGTAATGATAAAAATTTCAATGGGACAGGGCCATGTAAAAATGTTAGCTCAGTACAATGCACACATGGAATTAAGCCAGTGGTGTCAACTCAACTGCTGTTAAATGGCAGTCTCGCAGAAGAAGAGATAATAATCAGATCTGAAAATCTCACAAACAATGCCAAAACCATAATAGTGCACCTTAATGAATCTGTAGAAATCAATTGTACCAGACCCTCCAACAGGACAAGAACACGTATGACTATGGGACTAGGACACGTATTCTATAAAACAGAAATAATAACAGGAGATATAAGAAAAGCATATTGTAAAATTAATGCAACAAAATGGTATAAAGTTTTAGGACAGGTAACTGGAAAACTAAAAGAGCGCTTTAATAAGACAACAATAACCTTTAAACCACATTCAGGAGGAGATCTAGAAATTAAAACACATCATTTCAATTGTAGAGGGGAATTTTTCTATTGCAATACATCAAAACTGTTTACTTGCATAGGAAATACAAGCAGGGGGGAGTGTAATGACACTATCATACTTCCATGCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGCAAGGAGTAGGACAAGCAATGTATGCTCCTCCCATCAGTGGAGCAATTAATTGTGTATCAAATATTACAGGAATACTATTGACAAGAGATGGTGAGAATAACACGAGTAATGAGACCTTCAGACCTGAAGGAGGAAATATAAAGGACAATTGGAGAAATGAATTGTATAAATATAAAGTAGTAGAAATTGGTGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAGCCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGACGCTAGGAGCTATGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCACTGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAACAGCAGAACAATTTGCTGAGAGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAGTCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTAGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGATCAGATTTGGAATAACATGACCTGGATGGAGTGGGAGAGAGAAATTGACAATTACACAAACTTAATATACACCTTAATTGAAGAATCGCAGAACCAACAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTAGAATTGGATAAGTGGGCAAGTTTGTGGAAT TGGTTTGACATATCAAAATGGCTGTGGTATATAAAAATATTCATAATGATAGTAGGAGGTTTAGTAGGTTTAAGGATAGTTTTTACTGTGCTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATACTCACCATTATCATTTCAGACCCGCTTCCCAGCCCCAAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATCGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCAGTCCATTAGTGCATGGATTATTAGCACTCATCTGGGACGATCTACGGAGCCTGTGCCTCTTCAGCTACCACCGCTTGAGAGACTTAATCTTGATTGCAGCGAGGATTGTGGAACTTCTGGGACGCAGGGGGTGGGAAGCCCTCAAGTATTGGGGGAATCTCCTGCAGTATTGGATTCAGGAACTAAAGAATAGTGCTGTTAGTTTGTTTGATGCCATAGCTATAGCAGTAGCTGAGGGGACAGATAGGATTATAGAAGTAGCACAAAGAATTGGTAGAGCTTTTCTCCACATACCTAGAAGAATAAGACAGGGCTTTGAAAGGGCTTTGCTATAA

引物(5’-3’)(SEQ ID NO：5～10)：

SF-F：GTGGAGATATGAGGGACAAT(SEQ ID NO：5)

SF-R：TTATAGCAAAGCCCTTTCAAAGCC(SEQ ID NO：6)

GX-F：ATGAGAGTGAGGGAGACACA(SEQ ID NO：7)

GX-R：CAATTTCTACTACTTTATATTTATAC(SEQ ID NO：8)

GX-SF-F：TAAAGTAGTAGAAATTGGTGGAGATATGAGGGACA(SEQ ID NO：9)

GX-SF-R：TGTCCCTCATATCTCCACCAATTTCTACTACTTTA(SEQ ID NO：10)

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，笫2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1.GX-SF表达质粒的构建与鉴定

CX-SF重组包膜蛋白，来自于对pcDNA3.1-SF162和pcDNA3.1-GX88的改造。pcDNA3.1-SF162来自美国NIH AIDS Reagent；pcDNA3.1-GX88来自我实验室从病人血清的分离株。分离株是通过Qiagen病毒RNA提取试剂盒，从血浆中提取HIV RNA，反转录成cDNA，通过PCR扩增膜区片段，连接T载体，挑取单克隆，测序，最终得到的单克隆分离株的膜蛋白GX88。GX-SF包膜蛋白改造流程如图1所示，具体步骤包括：

1)以pcDNA3.1-SF162为模板，设计引物：

SF-F：5’-GTGGAGATATGAGGGACAAT-3’

SF-R：5’-TTATAGCAAAGCCCTTTCAAAGCC-3’

序列扩增1386-2544bp，得到片段SF-S1。再以片段SF-S1为模板，设计引物：

GX-SF-F：5’-TAAAGTAGTAGAAATTGGTGGAGATATGAGGGACA-3’

和SF-R引物进行PCR，得到过渡片段SF-S2。

2)以pcDNA3.1-GX88模板，设计引物序列：

GX-F：5’-ATGAGAGTGAGGGAGACACA-3’

GX-R：5’-CAATTTCTACTACTTTATATTTATAC-3’

扩增1-1428bp，得到片段GX-S1。再以片段GX-S1为模板，设计引物：

GX-SF-R：5’-TGTCCCTCATATCTCCACCAATTTCTACTACTTTA-3’

和GX-R引物进行PCR，得到过渡片段GX-S2。

3)以GX-S2和SF-S2为混合模板，以GX-F和SF-R为引物，扩增得到混合产物，并进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图2所示，胶回收最长的一条产物(即GX-SF，约2.5kbp)，通过T载体连接克隆到 pcDNA3.1载体上。

4)通过测序，比对序列，得到最终GX-SF全长核苷酸序列。测序结果显示，所构建的GX-SF质粒中插入的目的片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：4，其编码的氨基酸序列为SEQID NO：3(所对应的蛋白分别命名为GX-SF)。

实施例2.HIV假病毒的制备

2.1 HIV假病毒包装系统

采用将包膜蛋白表达质粒和骨架质粒共转染真核细胞的方法制备假病毒。其中，所使用的HIV骨架质粒及共转染真核细胞的具体条件详细描述于“中国专利申请CN104830908A”中，其全文通过引用并入本文。在本实施例中，采用示例性包膜蛋白表达质粒(pcDNA3.1)和骨架质粒(pSG3.Aenv.cmvFluc，简称为pSG3-Fluc)制备HIV假病毒。

2.2包膜蛋白表达质粒和骨架质粒在真核细胞中的表达

使用胰酶消化293FT细胞，计数，将6×10⁶个细胞/15ml接种于75cm²细胞培养瓶中，37℃，5％CO₂的孵箱中培养。待细胞汇合率达50％左右时，利用Lipofectamine2000将分别表达以下所列的HIV病毒株的包膜蛋白的包膜蛋白表达质粒分别与骨架质粒共转染293FT细胞，同时设单独转染骨架质粒的阴性对照，其中，所述HIV病毒株包括：B亚型SF162/102-14/Z20-11/11018/11022/11036/11058、BC亚型161-5、AE亚型YN192/GX88和新型重组GX-SF。取包膜蛋白表达质粒和骨架质粒各15μg溶于1.875ml无抗性、无牛血清的培养基中，轻柔混匀。将15μg骨架质粒溶于相同体积培养基中作为阴性对照。取75μlLipofectamine2000，溶于1.875ml无抗性、无牛血清的培养基中，轻柔混匀，室温静置5min，此过程不宜超过25min。将脂质体混合液加入质粒混合液中，轻柔混匀，室温孵育20min，此时溶液可能出现轻微浑浊。将孵育好的混合液加入已接种好细胞的培养瓶中，轻柔的前后左右混匀。将细胞培养瓶重新置于细胞培养箱中，37℃、5％CO₂，孵育6小时后为细胞换液。转染48小时后收集培养上清，用0.22μm滤器过滤上清。取滤出液，即得到假病毒，分装后-70℃冻存。

2.2假病毒的滴定

预先6小时铺293TT细胞于96孔细胞培养板中，每孔细胞数为1.5×10⁴个/100μl，37℃，5％CO₂孵箱中培养。将各型假病毒分别进行起始稀释度为5倍的倍比稀释，共9个稀释度。在96孔细胞培养板中，每孔加入25μl假病毒稀释液，每型假病毒每种稀释度4个复孔。将细胞培养板置于37℃，5％CO₂的孵箱中培养48小时。每孔加入100μL Luciferase底物，避光反应2分钟，读取荧光度数。计算组织细胞培养半数感染量(TCID50)，即病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度，用Reed-Muench方法计算：

①计算各病毒稀释度阳性孔数目(a)和阴性孔数目(b)；

②计算阳性和阴性孔的累积数：阳性孔累积数由下向上累计(c)，阴性孔累积数由上向下累计(d)；

③计算阳性孔的百分比：比率＝(c)/〔(c)+(d)〕×100；

④计算距离比例：距离比例＝(大于50％的阳性百分比-50)/(大数于50％的阳性百分比-小于50％的阳性百分比)；

⑤TCID50的对数＝大于50％的阳性百分比的最高稀释倍数的对数+距离比例×稀释系数的对数。

得到TCID50数值后，计算感染复数(MOI)，即平均每个细胞感染假病毒的活性单位数：感染复数＝0.7×TCID50×0.025mL/靶细胞数。

实施例3.GX-SF假病毒ADCC检测法

使用CEM-NKr细胞作为靶细胞，细胞计数后，稀释细胞数至1E6/mL，取1mL细胞。根据计算结果稀释所需毒株的病毒至MOI＝1.0，放入T25培养瓶，补齐培养基体积至5mL。加入5μL 15mg/mL DEAE，均匀混合。1200g室温离心120min。在37℃5％CO₂孵箱培养2小时。将制备的靶细胞用PBS洗3遍。按照每孔1×10⁴个/50μL，将细胞接种于U型96孔板中，板四周孔空余留作对照。对照孔设置如下：Ee孔只有效应细胞(NK92-6DF5细胞)，Te和Tm只有靶细胞(CEM-NKr细胞)，P和V只有150μL培养基，空孔用150μL PBS填充。将NK92-6DF5细胞稀释至1×10⁵个/50μL，将细胞接种于96孔板中。轻拍培养板四周，使2种细胞充分混匀。将待测样品分别进行起始稀释度为33.3倍的3倍倍比稀释，共9个稀释度，2个复孔。从稀释板各孔中吸取50μl的待测样品稀释液(或培养基)贴壁缓缓加入预先已铺好细胞的培养板对应孔中，轻拍培养板四周混匀。250g室温离心5min，将细胞培养板置于37℃，5％CO₂的孵箱中培养4小时。在培养结束前45min，在V、Tm孔中加入15uL TritonX-100，向P孔中加入1∶5000 倍稀释的LDH阳性对照，充分混匀。培养6小时完成后，250g室温离心5min，小心吸取50uL上清至酶标板中。向各个孔中加入50μL LDH显色底物，室温避光反应30min。向各孔中中加入50μL 2M乙酸终止反应。用注射器针头戳破大的气泡，终止反应后1小时内在490或492nm测量吸光值。每一实验孔的ADCC杀伤比例计算公式如下：

①实验孔，实验’＝实验-B

②靶细胞自发Te’＝Te-B

③靶细胞最大Tm’＝Tm-V

④效应细胞自发Ee’＝Ee-B

⑤

获得每一实验孔的ADCC杀伤比例后，使用SoftMax Pro V6.3软件对同一系列倍比稀释样品的ADCC杀伤比例进行四参数曲线拟合，得到ADCC杀伤拟合曲线，曲线C值即为该曲线对应样品的EC50值；拟合曲线的平台期下限趋近值为最小杀伤比例，平台期上限趋近值为最大杀伤比例。

实施例4.不同参数对GX-SF假病毒ADCC检测法的影响

在本实施例中，GX-SF假病毒的制备方法参照实施例2进行，GX-SF假病毒ADCC检测法参照实施例3进行。

4.1病毒量的影响

在对病毒使用量(感染复数，MOI)进行分析时，其他参数采用了病毒孵育时间4小时，效靶比50∶1，杀伤时间6小时。通过流式细胞术测量了不同MOI感染剂量下A32抗体(一株已知针对HIV-1具有高ADCC活性的抗体，起始浓度为100μg/mL)结合靶细胞的情况，其中二抗使用了山羊抗人FITC荧光标记的二抗，并通过LDH检测法测量了不同MOI感染剂量下A32抗体的ADCC最大杀伤比例。

结果如图3所示，其中图3A是A32抗体对GX-SF感染后的靶细胞结合情况的流式结果，图3B是抗体识别比值(A32抗体结合病毒感染后的靶细胞的平均荧光强度与未感染病毒的正常靶细胞本底平均荧光强度的比值)与ADCC最大杀伤比例之间的比较。图3B左纵轴为流式抗体识别比值，可以体现出抗HIV抗体(A32)结合被GX-SF假病毒感染的靶细胞的灵敏度。当MOI达到1.0时，识别比值接近8倍，灵敏度较高。继续增加MOI，识别比值并没有显著增加。MOI＝2.0时，识别比值率也仅仅比MOI为1.0时稍高。图3B右纵轴为ADCC最大杀伤比例。MOI达到1.0时，最大杀伤超过80％。MOI＝2.0时，最大杀伤达到90.6％，比1.0时增加比例有限。继续增加MOI至8.0，识别比值与最大杀伤比例增加均不明显。说明当MOI大于1.0时病毒量相比该浓度下的具有高ADCC活性的单抗趋于饱和，可以覆盖绝大多数具有高ADCC活性的单抗或血清样本的检测范围。当MOI降低至1.0以下时，同样抗体浓度下，被标记的靶细胞数量降低，ADCC杀伤比例降低。说明此时病毒量不足以测出全部抗体的ADCC效果，灵敏度降低。

4.2病毒感染孵育时间的影响

假病毒为非复制单论感染病毒，感染后无法表达更多Env蛋白(即，包膜蛋白)。因此，病毒孵育时间对表面残留Env的量具有影响。在对此参数进行分析时，其他3个参数分别为MOI＝1.0，效靶比为50∶1，杀伤时间6小时。其余条件同实施例4.1。

结果如图4所示，其中图4A是A32抗体对GX-SF感染后的靶细胞结合情况的流式结果，图4B是抗体识别比值(流式结果中，A32抗体结合病毒感染后的靶细胞的平均荧光强度与未感染病毒的正常靶细胞本底平均荧光强度的比值)与ADCC最大杀伤比例之间的比较。感染GX-SF假病毒24小时后，A32抗体的识别比值比2小时培养时间下降了一半以上。ADCC最大杀伤比例也由90％降低到20％左右，灵敏度下降。根据图4B的结果，病毒孵育时间为2-4小时的情况下，靶细胞表面的假病毒颗粒有更充分的时间与靶细胞融合，从而保证较高的抗体识别比值，以介导ADCC反应。

4.3效靶比(ETR)的影响

在MOI＝1.0，病毒孵育时间4小时，杀伤时间6小时的条件下，考察不同ETR(1∶1-100∶1)对GX-SF假病毒ADCC检测法的影响。实验采集数据包括ADCC杀伤拟合曲线、最大杀伤比例和EC50值，具体操作同实施例3。

结果如图5所示，其中图5是ETR为1.0、5.0、10.0、50.0或100.0时的ADCC杀伤拟合曲线，横坐标为抗体浓度的Log值，纵坐标为杀伤比例。从图中可以看出，当ETR<10时，随着效应细胞比例增加，低浓度和高浓度抗体下的靶细胞杀伤比例均增加，高抗体浓度下杀伤比例增加明显。当ETR>10时，效应细胞比例增加，杀伤比例没有显著提升。这表明ETR>10时，效应细胞饱和，所有敏感靶细胞全部死亡，继续增加并不能明显提升杀伤效果。表2显示了根据ADCC杀伤拟合曲线计算出的EC50值与最大杀伤比例。可以看出，ETR＝10时，GX-SF假病毒ADCC检测法所检出的EC50较低而最大杀伤比例较高，灵敏度高；ETR<10时，EC50值随效应细胞比例增加而降低，抗体ADCC效果更强，表明检测灵敏度更高，而最大杀伤比例明显增加；ETR>10时，抗体EC50变化不明显，最大杀伤比例增加幅度有限。

表2.

4.4杀伤时间的选择

在MOI为1.0，感染后培养时间4小时，ETR固定为10的条件下，考察不同杀伤时间对GX-SF假病毒ADCG检测法的影响。通常而言，杀伤时间的长短取决于效靶细胞接触情况和抗体浓度。我们设置了一组时间从0.5小时至8小时的系列实验，考察杀伤时间对检测结果的影响。

结果如图6所示，其中图6是杀伤时间为0.5、1、2、4或8小时的ADCC杀伤拟合曲线，横坐标为抗体浓度，纵坐标为杀伤比例。当杀伤时间小于4小时，随着杀伤时间增加，细胞死亡比例逐渐增加，最大杀伤比例明显增加，说明杀伤时间没有达到抗体与靶细胞的饱和点。当杀伤时间达到8小时，死亡细胞比例在高抗体浓度下增加不多，但在低抗体浓度下有明显增加，说明低抗体浓度下的杀伤效果已经饱和，趋于非特异性杀伤。表3显示了根据ADCC杀伤拟合曲线计算出的EC50值与最大杀伤比例。可以看出，杀伤时间为4小时左右时，GX-SF假病毒ADCC检测法所检出的最大杀伤比例较高、最小杀伤比例较低且EC50也较低，灵敏度高；在0.5-4小时之间，随杀伤时间增加，最大杀伤比例增加，EC50值变化不明显；超过4个小时后，虽然最大杀伤比例依然有所升高，但是最小杀伤比例非常显著的提升，EC50值也明显升高，表明此时检测灵敏度不高。因此，超过4小时的杀伤时间可以使得最大杀伤比例更高，但抗体低浓度时对应的最小杀伤比例也更强，对判断抗体的ADCC活性不利。

表3.

实施例5.GX-SF假病毒ADCC检测法的检测特异性评价

在本实施例中，GX-SF假病毒的制备方法参照实施例2进行；GX-SF假病毒ADCC检测法参照实施例3进行，其中MOI为1.0，病毒感染孵育时间为4小时，ETR为10，杀伤时间为4小时。基于假病毒ADCC方法目的是为了大规模筛查临床样本的被试血清。因此在这里选取了40份HIV-1阴性血清样品(含乙肝阳性、梅毒阳性等)，并随机分为7个组，每组5-6个样品。将组内所有样品平均混合作为一份样品，标记为N1～N7；从HIV-1抗体国家参考品阳性样本库中选取了4份HIV-1抗体阳性血清作为对照(编号分别为147、118、108和182)；对上述各个样品进行ADCC活性评价，并计算每份样品的最大杀伤比例；A32单抗作为阳性对照(原始浓度为2.5mg/mL，起始浓度为50μg/mL)。各个血清样品或A32单抗阳性对照均从50倍稀释开始，3倍倍比稀释，到4050倍稀释。

结果如图7A-7B所示，其中cut off表示样品稀释度为100时，本实施例检测方法的cut off值，获得cut off值是本领域已知的，在本实施例中，采用以下示例性方法确定所述检测方法的cut off值：首先获得HIV-1阴性血清样品的最大杀伤比例的平均值，将所得到的平均值+3倍SD值作为阳性判断值；同时，本实施例中，将原始浓度为2.5mg/mL的A32抗体稀释50倍后作为起始浓度，即50μg/mL，因此50μg/mL是标准曲线计算上限。低滴度样本的曲线拟合程度差，EC50浮动范围会超出标准曲线上限。但是，对于EC50超过2倍上限的样品(即，超过100μg/mL)，即使试验存在误差，样本99％可能性不存在可以计算的ADCC效果，因此EC50超过100μg/mL判定为阴性。综上所述，本实施例中的cut off表示为样品稀释度为100时，最大杀伤比例≥14.8％且EC50≤100μg/mL时，认为待测样品具有ADCC活性。在阴性血清样品中，N1～N7组各组最大杀伤比例均很低，也即未显示明显的ADCC活性，表明其不含有具有明显ADCC活性的抗HIV抗体，与理论结果相符；其中个别样本在稀释度小于100倍时，被检测出具有ADCC活性，造成的原因可能是由于稀释度较小，导致血清浓度较高，易造成非特异性结合导致的杀伤(结果未显示)；当血清稀释倍数超过100倍后，7组阴性血清均无ADCC活性。表4显示了HIV阳性血清样品所测定的EC50值，可以看出在HIV阳性血清样品中，四份样本(147、118、108和182)均显示出一定的ADCC活性。以上结果表明GX-SF假病毒ADCC检测法具有良好的检测特异性。

表4.

实施例6.GX-SF假病毒ADCC检测法与其他ADCC检测法的比较

本实施例中，GX-SF假病毒制备方法参照实施例2进行，GX-SF假病毒ADCC检测法参照实施例3进行，其中MOI＝1.0，病毒感染孵育时间为4小时，ETR＝10∶1，杀伤时间为6小时。目前应用比较多的基于非病毒感染的ADCC检测方法，是瞬时转染方法。这一方法需要先瞬时转染HIV包膜蛋白质粒，2天后待包膜蛋白表达，在上清中加入可溶性CD4蛋白。可溶性CD4蛋白可以与细胞表面包膜蛋白结合，形成特定的结构，类似被病毒感染的CD4+T细胞表面的CD4分子。这一结构可以被HIV抗体识别，并发挥ADCC作用。为此，我们构建了一系列瞬时转染不同剂量GX-SF假病毒包膜蛋白的靶细胞，分别转染了500、1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000个拷贝/5E5个细胞。然后按照文献方法(Broliden，K.等人，Clin DiagnVirol，1996.6(2-3)：p.115-26，其通过引用并入本文)，在CEM-NKr细胞中加入可溶性CD4，制成靶细胞，从而进行ADCC检测(靶细胞经转染后的步骤，参见实施例3)。采用流式细胞术检测抗HIV抗体(A32)对靶细胞的识别比值(流式结果中，A32抗体结合GX-SF感染靶细胞或瞬时转染靶细胞的平均荧光强度与靶细胞的本底平均荧光强度的比值)；结果如图8A所示，最高转染剂量组的靶细胞(Transfected Cells)，被A32单抗识别的比值与假病毒感染组(Infected Cells)相比没有显著性差异。图8B显示了瞬时转染方法中，抗体识别比值随转染拷贝数的变化情况，其中PsV Binding Level表示GX-SF假病毒感染组的抗体识别比值(MOI＝1，病毒感染孵育时间为4小时)，当其抗体识别比值接近GX-SF假病毒感染组的抗体识别比值时，瞬时转染组的拷贝数大约相当于3000-5000拷贝。为了进一步验证方法，我们比较了GX-SF假病毒感染法(Infected)与最大转染拷贝的瞬时转染方法(Transfected)对A32抗体的ADCC活性检测结果的差异，结果如图8C和表5所示，两种方法所测得的A32抗体的ADCC拟合曲线，以及根据拟合曲线得到的EC50和最大杀伤比例在统计学上均无显著性差异，GX-SF假病毒感染法测得值分别为7.3±0.8ng/mL和88.0％，瞬时转染方法测得值分别为为6.0±1.1ng/mL和95.4％。上述结果表明，GX-SF假病毒ADCC检测法和瞬时转染方法在检测抗HIV抗体的ADCC活性方面均具有良好的效果，但瞬时转染方法需要表达纯化可溶性CD4蛋白，成本高，且转染时间长达2天，周期长，难以控制每批次抗原表达量相同，重复性差，因而更加凸显出GX-SF假病毒ADCC检测法的优势。

表5.

除了上述瞬时转染方法外，目前常用的ADCC检测方法还包括铬51(Cr⁵¹)释放试验、基于活病毒感染的乳酸脱氢酶(Lactic Dehydrogenase，LDH)释放试验、基于碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)和羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluoresceinsuccinimidyl amino ester，CFSE)双色荧光的流式检测方法等。相比于以上这些ADCC检测方法，GX-SF假病毒ADCC检测法具有灵敏度高、操作简单、周期短等显著优势(参见表6)。

表6.

	假病毒	Cr51传统	LDH传统	转染传统	流式双荧光
						生物安全等级	BSL-2	BSL-3	BSL-3	BSL-2	BSL-3
灵敏度	高	低	高	高	高
						可重复性	高	中	高	低	高
成本	低	中	中	中	高
						高通量	96孔	96孔	96孔	96孔	单孔
检测周期	12hrs	8days	8days	14days	8days
						操作复杂程度	+	+++	++	++	+++

实施例7.GX-SF假病毒与其他HIV假病毒在ADCC检测法中的比较

在本实施例中，假病毒的制备方法参照实施例2进行，假病毒ADCC检测法参照实施例3进行，其中MOI为1.0，病毒感染孵育时间为4小时，ETR为10，杀伤时间为4小时。分别使用GX-SF、GX88、SF162、11018、11022、11036、11058、102-14、Z20-11、161-5、YN192、GX68这12株假病毒感染靶细胞，从而建立基于各个假病毒的ADCC检测模型。然后使用基于上述假病毒所分别建立的ADCC检测模型，检测13个抗HIV单抗(美国NIH AIDS Reagent馈赠)(具有ADCC和/或中和活性)的ADCC活性(以EC50表示)，其中具有中和活性的单抗为2F5、4E10、CH01、CH31、A32、b12、VRC01、2G12、PG9和PGI6；具有ADCC活性的单抗为17b、50-69、CH31、A32、A32AAA、b12、VRC01、2G12、PG9、PG16。

结果如图9所示，GX-SF假病毒所检测出的具有ADCC活性的抗体最多，包括已有文献报道具有明确ADCC活性的抗体，例如17b、50-69、CH31、A32、A32AAA、b12、VRC01、2G12和PG16；对于同一抗体，相比于其他假病毒，GX-SF假病毒所得的抗体EC50最高；以上结果表明，基于GX-SF假病毒的ADCC检测法的检测灵敏度明显高于基于其他假病毒的ADCC检测法。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国食品药品检定研究院

<120> 检测抗HIV抗体的ADCC活性的方法

<130> IDC170002

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 848

<212> PRT

<213> 人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

<400> 1

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<211> 847

<212> PRT

<213> 人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）

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<210> 4

<211> 2586

<212> DNA

<213> 人工序列

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ctgagagcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1740

ctccaggcaa gagtcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctagggatt 1800

tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1860

aataaatctc tggatcagat ttggaataac atgacctgga tggagtggga gagagaaatt 1920

gacaattaca caaacttaat atacacctta attgaagaat cgcagaacca acaagaaaag 1980

aatgaacaag aattattaga attggataag tgggcaagtt tgtggaattg gtttgacata 2040

tcaaaatggc tgtggtatat aaaaatattc ataatgatag taggaggttt agtaggttta 2100

aggatagttt ttactgtgct ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ctcaccatta 2160

tcatttcaga cccgcttccc agccccaagg ggacccgaca ggcccgaagg aatcgaagaa 2220

gaaggtggag agagagacag agacagatcc agtccattag tgcatggatt attagcactc 2280

atctgggacg atctacggag cctgtgcctc ttcagctacc accgcttgag agacttaatc 2340

ttgattgcag cgaggattgt ggaacttctg ggacgcaggg ggtgggaagc cctcaagtat 2400

tgggggaatc tcctgcagta ttggattcag gaactaaaga atagtgctgt tagtttgttt 2460

gatgccatag ctatagcagt agctgagggg acagatagga ttatagaagt agcacaaaga 2520

attggtagag cttttctcca catacctaga agaataagac agggctttga aagggctttg 2580

ctataa 2586

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

gtggagatat gagggacaat 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

ttatagcaaa gccctttcaa agcc 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

atgagagtga gggagacaca 20

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

caatttctac tactttatat ttatac 26

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

taaagtagta gaaattggtg gagatatgag ggaca 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

tgtccctcat atctccacca atttctacta cttta 35

Claims

1.一种重组包膜蛋白，其包含AE型HIV病毒包膜蛋白的第1-476位氨基酸残基以及B亚型HIV病毒包膜蛋白的第463-847位氨基酸残基，其中所述AE型HIV病毒包膜蛋白的第1-476位氨基酸残基与所述B亚型HIV病毒包膜蛋白的第463-847位氨基酸残基的N端连接；

所述AE型HIV病毒包膜蛋白如SEQ ID NO:1所示；

所述B亚型HIV病毒包膜蛋白如SEQ ID NO:2所示；

所述重组包膜蛋白如SEQ ID NO:3所示。

2.一种分离的核酸，其编码权利要求1所述的重组包膜蛋白。

3.权利要求2所述的分离的核酸分子，其中，所述分离的核酸如SEQ ID NO:4所示。

4.一种载体，其包含权利要求2或3所述的分离的核酸。

5.权利要求4所述的载体，其中，所述载体为表达载体。

6.一种用于组装HIV假病毒的系统，其包含表达权利要求1所述的重组包膜蛋白的表达载体和包装载体。

7.权利要求6所述的系统，其中，所述包装载体能够表达gag、pol、tat和vpu蛋白。

8.权利要求6所述的系统，其中，所述包装载体为包含缺失了env基因的HIV基因组的载体。

9.权利要求6所述的系统，其中，所述包装载体为质粒。

10.一种宿主细胞，其包含权利要求2或3所述的分离的核酸、权利要求4或5所述的载体或权利要求6-9任一项所述的系统。

11.权利要求10所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞选自原核细胞或真核细胞。

12.权利要求11所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

13.权利要求11所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞为人类细胞。

14.权利要求11所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞选自HEK293、HEK293T或HEK293FT细胞。

15.一种HIV假病毒，其包含权利要求1所述的重组包膜蛋白。

16.制备权利要求15所述的HIV假病毒的方法，其包括在宿主细胞中表达权利要求1所述的重组包膜蛋白的步骤。

17.权利要求16所述的方法，其中，所述方法包括下述步骤：

(1)将表达权利要求1所述的重组包膜蛋白的表达载体和包装载体共转染宿主细胞；

(2)在宿主细胞中表达所述表达载体和包装载体所编码的蛋白，所述蛋白能够自发组装成HIV假病毒；和

(3)收集HIV假病毒。

18.权利要求17所述的方法，其中，所述包装载体能够表达gag、pol、tat和vpu蛋白。

19.权利要求17所述的方法，其中，所述包装载体为包含缺失了env基因的HIV基因组的载体。

20.权利要求17所述的方法，其中，所述宿主细胞为真核细胞。

21.权利要求20所述的方法，其中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

22.权利要求20所述的方法，其中，所述宿主细胞为人类细胞。

23.权利要求20所述的方法，其中，所述宿主细胞选自HEK293、HEK293T或HEK293FT细胞。

24.试剂盒，其包括权利要求1所述的重组包膜蛋白、权利要求2或3所述的分离的核酸、权利要求4或5所述的载体、权利要求6-9任一项所述的系统、权利要求10-14任一项所述的宿主细胞或权利要求15所述的HIV假病毒。

25.权利要求24所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括能够检测细胞存活率的试剂。

26.权利要求25所述的试剂盒，其中，所述能够检测细胞存活率的试剂通过测定LDH水平来测定细胞存活率。

27.权利要求26所述的试剂盒，其中，所述能够检测细胞存活率的试剂包括乳酸和四唑鎓化合物。

28.权利要求24所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含靶细胞和/或效应细胞。

29.权利要求28所述的试剂盒，其中，所述靶细胞为人类细胞。

30.权利要求28所述的试剂盒，其中，所述靶细胞为人CD4阳性T淋巴细胞。

31.权利要求28所述的试剂盒，其中，所述效应细胞选自PBMC。

32.权利要求28所述的试剂盒，其中，所述效应细胞选自NK细胞、单核细胞、细胞毒T细胞或中性粒细胞。

33.权利要求1所述的重组包膜蛋白、权利要求2或3所述的分离的核酸、权利要求4或5所述的载体、权利要求6-9任一项所述的系统、权利要求10-14任一项所述的宿主细胞或权利要求15所述的HIV假病毒用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测抗HIV抗体的ADCC活性。

34.权利要求33所述的用途，其中，所述试剂盒用于检测抗HIV-1抗体的ADCC活性。

35.检测包含抗HIV抗体的待测样品的ADCC活性的方法，其包括下述步骤：

(1)使用HIV假病毒感染靶细胞，所述HIV假病毒包含权利要求1所述的重组包膜蛋白；

(2)将步骤(1)中的靶细胞与效应细胞和待测样品接触；和

(3)检测靶细胞的细胞存活率，从而确定待测样品的ADCC活性。

36.权利要求35所述的方法，其中在步骤(1)中，所述HIV假病毒通过权利要求16-23任一项所述的方法制备得到。

37.权利要求35所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述靶细胞为人类细胞。

38.权利要求37所述的方法，其中，所述靶细胞为人CD4阳性T淋巴细胞。

39.权利要求35所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述效应细胞选自PBMC。

40.权利要求35所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述效应细胞选自NK细胞、单核细胞、细胞毒T细胞或中性粒细胞。

41.权利要求35所述的方法，其中，在步骤(3)中，通过测定LDH水平来测定细胞存活率。

42.权利要求35所述的方法，其中，所述抗HIV抗体为抗HIV-1抗体。

43.权利要求35所述的方法，其中，所述待测样品为来自受试者的抗血清。

44.权利要求43所述的方法，其中，所述受试者为人。