CN101885760A

CN101885760A - 密码子优化的HIV-1gp120基因共有序列及gp120核酸疫苗

Info

Publication number: CN101885760A
Application number: CN 201010126144
Authority: CN
Inventors: 王世霞; 张明顺; 黄祖瑚; 卢山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-03-16
Filing date: 2010-03-16
Publication date: 2010-11-17
Anticipated expiration: 2030-03-16
Also published as: CN101885760B

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及密码子优化的HIV-1gp120基因共有序列及gp120核酸疫苗。本发明应用多序列比对分析，获得中国HIV-1流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重组亚型和ThB亚型)包膜蛋白gp120共有氨基酸序列；应用人工合成的方法制备编码共有氨基酸序列的gp120基因片段，该基因经密码子优化，兼顾了哺乳动物细胞和大肠杆菌密码子使用偏好；在此基础上，构建了由gp120基因和真核表达载体pJW4303组成的HIV-1gp120核酸疫苗。该核酸疫苗可以应用于动物和人体免疫，也可以应用于gp120蛋白的表达和生产。

Description

密码子优化的HIV-1gp120基因共有序列及gp120核酸疫苗

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及密码子优化的HIV-1gp120基因共有序列及gp120核酸疫苗。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是包膜(envelop，Env)病毒，每个病毒包膜的表面镶嵌由糖蛋白gp120和gp41形成的三聚体刺突。根据Env不同，HIV-1分为M，N和O三群。M群在全世界流行最广，根据全基因组被继续分9种亚型(A、B、C、D、F、G、H、J、K)，并呈现出地理上的区域分布特征。其中B亚型是最主要的流行亚型(主要发现于北美和欧洲)，A、D亚型主要流行于非洲，C亚型则分布于非洲和亚洲，这些亚型形成了代表HIV-1M群的系统进化树上的不同分化枝。我国的优势亚型(95％以上)为ThB亚型、B/C重组亚型和A/E重组亚型。ThB亚型主要流行区是河南和河北，A/E和B/C重组体主要流行区是广西和云南及新疆，B/C重组体也流行于四川省。在同一亚型/重组体内，不同的病毒株的Env，尤其是gp120，仍然呈现高度变异性。Gp120的高度变异以及由此导致的中和抗体免疫逃逸是HIV疫苗研制的重大挑战。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供中国HIV-1流行病毒株包膜蛋白gp120共有氨基酸序列。

本发明的另一目的是提供经密码子优化的的编码中国HIV-1流行病毒株包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列。

本发明的又一目的是提供一种包含上述密码子优化的gp120基因序列的核酸疫苗。

我们从Genebank上收集了中国的HIV-1包膜蛋白gp120的氨基酸序列。应用ThB亚型、B/C重组亚型或者A/E重组亚型中不同病毒株的gp120进行多序列比对，获得针对每一个亚型的共有氨基酸序列。

本发明的技术方案是：

中国HIV-1流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重组亚型和ThB亚型)包膜蛋白gp120共有氨基酸序列，序列为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。其中SEQ ID NO.1为HIV-1病毒株A/E重组亚型包膜蛋白gp120共有氨基酸序列，SEQ ID NO.2为HIV-1病毒株B/C重组亚型包膜蛋白gp120共有氨基酸序列，SEQ ID NO.3为HIV-1病毒株ThB亚型包膜蛋白gp120共有氨基酸序列。

经密码子优化的编码中国HIV-1流行病毒株包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列，序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6。其中SEQ ID NO.4为经密码子优化的编码中国HIV-1病毒株A/E重组亚型包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列，SEQ ID NO.5为经密码子优化的编码中国HIV-1病毒株B/C重组亚型包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列，SEQ ID NO.6为经密码子优化的编码中国HIV-1病毒株ThB亚型包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列。

HIV-1gp120核酸疫苗，该疫苗含有经密码子优化的编码中国HIV-1流行病毒株包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列和真核表达载体。

所述的经密码子优化的编码中国HIV-1流行病毒株包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列为在SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的5’端和3’端分别插入限制性内切酶NheI和BamHI粘性末端的基因序列。

所述的真核表达载体为经内切酶NheI和BamHI切割pJW4303得到的载体片段。

本发明提供的基于中国HIV-1流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重组亚型和ThB亚型)包膜蛋白gp120共有氨基酸序列核酸疫苗的构建包括如下步骤：

(1)中国HIV-1流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重组亚型和ThB亚型)包膜蛋白gp120共有氨基酸序列分析与获得：

(2)密码子优化的编码中国HIV-1流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重组亚型和ThB亚型)包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列的设计和合成：

应用基因软件MacVector 7.2分析中国HIV-1流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重组亚型和ThB亚型)包膜蛋白gp120共有氨基酸序列，推导相应的编码基因序列。由于野生型gp120共有氨基酸编码序列不符合哺乳动物和大肠杆菌密码子使用偏好，发明人通过筛选，设计出密码子优化的gp120共有氨基酸序列的基因序列，并经过基因公司的化学合成得到了密码子优化的gp120共有氨基酸序列的基因序列。密码子优化后gp120基因中哺乳动物细胞偏爱的密码子频率及大肠杆菌细胞偏爱的密码子频率高于野生型gp120基因(见图2)。此密码子优化的序列所编码的蛋白质氨基酸序列与原始的氨基酸序列保持一致。

(3)疫苗构建：

将步骤(2)得到的基因片段克隆到真核表达载体pJW4303中，得到重组质粒pJW4303/gp120.AE.cons、pJW4303/gp120.BC.cons和pJW4303/gp120.ThB.cons。经对重组质粒的纯化、酶切和测序鉴定后，确定得到了编码共有氨基酸序列的gp120核酸疫苗。

本发明的有益效果：

1、中国HIV-1流行病毒株包膜蛋白gp120共有氨基酸序列，与原始序列比较，降低了gp120的变异。用抗原的共识序列可减少其与野生型基因免疫原之间的遗传距离，并能诱导机体产生较广谱的中和抗体和细胞免疫反应。

2、经密码子优化的编码中国HIV-1流行病毒株包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列选用了哺乳动物细胞和大肠杆菌密码子使用偏好的密码子，可以高效的在真核(哺乳动物细胞)和原核(大肠杆菌)表达。

虽然由基因的核苷酸序列可以准确的推断出其编码的氨基酸序列，但根据蛋白质的氨基酸序列而推断的核苷酸序列并不唯一，正是由于绝大多数密码子的兼并性(绝大多数氨基酸均对应于二个以上的密码子，例如与亮氨酸、丝氨酸对应的密码子分别有6个)，因此编码某一小肽的核苷酸序列可以有成千上万种。越来越多的研究结果表明，特定的蛋白多肽在细胞内的表达水平通常不是取决于其氨基酸序列，而是取决于相对应的核酸编码序列在宿主细胞内的复制、转录、翻译效率及其在宿主细胞内的稳定性等因素。因此，不同的核酸编码序列(虽然它们编码的氨基酸序列相同)在各种宿主细胞中的表达效率往往存在显著差异。

通过对野生型gp120的基因序列分析，发明人认为由于自然界生物体存在密码子的偏好性，从病原体来源的gp120基因克隆在异源宿主体内难以高效表达，因此就不能有效的刺激宿主的免疫系统，使之产生较好的免疫保护作用。为了提高异源基因在哺乳动物和大肠杆菌中的表达效率，往往需要对核苷酸编码序列进行优化。由于目前对核苷酸序列的优化尚没有统一的标准或原则，因此针对氨基酸序列，不同的研究人员完全会设计出不同的核苷酸序列用于目标多肽的表达和制造，相应地表达效率也可能存在差异。根据我们优化的核苷酸编码序列，克服了上述缺陷，提高了gp120蛋白表达水平，以及由该基因构建的核酸疫苗的免疫原性。

3、应用真核表达载体pJW4303制备的经密码子优化的中国HIV-1gp120共有序列核酸疫苗能显著有效的刺激宿主的免疫系统，使之产生良好的免疫应答。

附图说明

图1对基因库中已知的中国HIV-1AE、BC和ThB亚型的gp120氨基酸序列进行分析。

A：HIV-1A/E重组亚型gp120共识序列与从HIV-1感染者分离的HIV-1A/E重组亚型的氨基酸序列进化树的分析。圈中所示为本研究设计的HIV-1A/E重组亚型gp120共识序列；

B：HIV-1B/C重组亚型gp120共识序列与从HIV-1感染者分离的HIV-1B/C重组亚型的氨基酸序列进化树的分析。圈中所示为本研究设计的HIV-1B/C重组亚型gp120共识序列。

C：HIV-1ThB亚型gp120共识序列与从HIV-1感染者分离的HIV-1ThB亚型的氨基酸序列进化树的分析。圈中所示为本研究设计的HIV-1ThB亚型gp120共识序列。

图2野生型与密码子优化的gp120基因中哺乳动物细胞偏爱密码子频率的比较：指数＞1为哺乳动物细胞所偏好，纵坐标表示偏好指数，横坐标表示核苷酸序列位置。左图为野生型gp120基因，右图为密码子优化的gp120基因。

图3密码子优化的核酸疫苗的鉴定：应用BamHI和NheI酶切质粒；1：AE.gp120；2：AE.gp120经BamHI+NheI双酶切；3：BC.gp120；4：BC.gp120经BamHI+NheI双酶切；5：ThB.gp120；6：ThB.gp120经BamHI+NheI双酶切。

图4转染293T细胞内gp120蛋白表达的Western blot分析结果。

图5应用ELISA检测新西兰白兔血清gp120抗体应答时间曲线，箭头表示免疫时间点，各点所用的兔血清稀释度为1∶1000。

图6应用Western-blot检测新西兰白兔血清gp120抗体应答。

图7检测假型病毒SF162的TCID50，TCID50/ml是28000，说明假型病毒制备成功。

图8应用兔免疫血清中和来自B亚型的假型病毒株SF162的中和试验结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1.中国HIV-1AE、BC和ThB亚型的gp120氨基酸序列分析

对基因库中已知的中国HIV-1AE、BC和ThB亚型的gp120氨基酸序列进行分析。根据序列排列的结果和遗传进化树的分析结果(图1)，设计了中国HIV-1AE、BC和ThB亚型的gp120氨基酸共识序列。

实施例2.编码共有氨基酸序列的密码子的设计和合成

首先用基因软件MacVector 7.2分析编码中国HIV-1流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重组亚型和ThB亚型)包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列，找出其密码子使用偏好以及原始序列中密码子使用偏好与哺乳动物密码子使用偏好和与大肠杆菌密码子使用偏好不同的密码子位点。对于其中哺乳动物和大肠杆菌密码子使用偏好相同的氨基酸，用哺乳动物和大肠杆菌都偏好的密码子替代原始序列中编码该氨基酸的密码子，分别设计了密码子优化的编码AE、BC及ThB亚型gp120蛋白的基因序列，序列分别为SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5及SEQ ID NO.6。密码子优化后gp120基因DNA序列有所变化，但gp120蛋白氨基酸序列不变。密码子优化后gp120基因由人工化学合成(Geneart公司，德国)，构建成重组质粒pGA4/AE.gp120、pGA4/BC.gp120和pGA4/ThB.gp120。经测序证实合成的序列正确。

实施例3.gp120DNA疫苗构建

将质粒pJW4303和pGA4/AE.gp120(或者pGA4/BC.gp120，或者pGA4/ThB.gp120)用Nhe I和BamH I分别进行双酶切。酶切反应体系为：10×Buffer TangoTM 4μL，10×BSA4μL，质粒20μL，NheI 1μL，BamHI 1μL，补水至40μL。酶切产物经7g/L的琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒(Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0，大连宝生物公司)分别回收纯化约1400bp的目的片段和线性化的pJW4303。

将电泳后琼脂糖凝胶置于紫外检测仪下，切下含目的DNA的凝胶，分析天平称胶块的质量，按1mg＝1μL计算胶块的体积。加入3倍体积的DR-I Buffer，置于75℃水浴中加热融化胶块，每隔2min混匀一次，直至胶块完全融化，加入DR-I Buffer 1/2体积的DR-II Buffer，充分混匀溶液。将离心吸附柱安置在收集管上，转移混合溶液至吸附柱中，静置2min，3600rpm，离心1min。弃滤液，加入500μL Rinse A液，3600rpm，离心30s。弃滤液，加入700μL Rinse B液，3600rpm，离心30s，重复洗涤一次。空柱12000rpm，离心1min，将吸附柱安置在Ep管上，让乙醇完全挥发干净。在吸附膜的中央，加入25μL洗脱缓冲液，静置60s。12000rpm，离心1min，此时Ep管中的洗脱液即为目的DNA溶液。测定DNA溶液的浓度，用10g/L琼脂糖凝胶电泳分析割胶纯化效果，洗脱液保存在-20℃冰箱中备用。

用T4DNA连接酶将约1400bp的目的片段和线性化的pJW4303连接，构建pJW4303/gp120重组表达质粒。即为本文结果中提及的gp120DNA疫苗：AE.gp120、BC.gp120和ThB.gp120。连接反应体系为：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，线性化的pJW43031μL，纯化目的片段7μL，T4DNALigase 1μL，混匀，16℃放置16h。连接物转化HB101感受态细胞。

实施例4编码共有氨基酸序列的核酸疫苗的鉴定

4.1 gp120DNA疫苗AE.gp120、BC.gp120和ThB.gp120转化HB101感受态细胞

1)将10μL连接物加入到装有100μL HB101感受态细胞的Ep管中，轻轻拍动管壁数次，充分混匀，冰浴30min。

2)将Ep管置于42℃水浴中90s，立即转至冰浴，静置2min。

3)向Ep管中缓慢加入LB培养基0.5mL，37℃，80rpm振摇，培养45min。

4)将菌液涂布在含氨苄霉素(0.1g/L)的LB平板上，37℃，培养过夜。

4.2筛选阳性克隆

随机挑取5个单菌落，分别接种于5只培养试管(含0.1g/L氨苄霉素的LB培养基)中，37℃，250rpm振摇，培养过夜。

4.3小量提取gp120的重组DNA疫苗质粒(质粒小量提取试剂盒：QIAGEN Plasmid Mini Kit(50)，Qiagen公司)

1)将4.2中摇过夜的细菌在无菌超净台中缓慢吸到1.5ml离心管中，培养试管中剩下少量均液保存于4℃。

2)离心管中菌液，常温下6000g，离心10min，弃上清，收集细菌。

3)加入250μl重悬缓冲液于细菌沉淀，反复振摇，直至看不到细菌团块，细菌全部重悬于溶液中。

4)加入250μl裂解缓冲液到上述菌体重悬液体中，温和颠倒5-6次，溶液呈均匀蓝色，静置5min。

5)加入350μl平衡缓冲液于(4)中得到的液体中，温和颠倒5-6次，蓝色溶液消失，溶液分层，上层为结实的乳白色团块，下层为清亮液体，室温静置2min。

6)12000g，离心10min，吸取上清，转移至另一离心管。该条件下离心10min。

7)将上清液加入到离心吸附柱中，12000g，离心1min，弃滤液。

8)吸附柱再12000g，离心1min，弃去滤过液体。

9)向离心吸附柱中加入洗涤缓冲液25μl，12000g，离心1min，收集滤液。

10)再将步骤9重复操作1次。

11)两次收集的液体中即含有质粒。

4.4小量提取gp120的重组DNA疫苗质粒进行酶切鉴定

质粒用Nhe I和BamH I进行双酶切，双酶切总反应体系(10μL)：10×Buffer Tango^TM1μL，10×BSA 1μL，质粒(0.22mg/mL)2μL，Nhe I 0.25μL，BamH I 0.25μL，补水至10μL。37℃孵育1h，加入1μL 10×Loading buffer终止酶切反应，10g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果(图3)，酶切正确细菌划三次平板，保存两个单克隆细菌。

实施例5.核酸疫苗的大量制备(质粒大提试剂盒为QIAGEN Plasmid Mega Kit(5)，Qiagen公司)

1)吸取鉴定正确的细菌保存液5μL接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，200rpm，过夜生长。

2)按1∶500将1)中培养菌液接种于1000ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，200rpm，过夜生长。

3)第二天将细菌移到250ml离心瓶中，4℃、6000g离心15min，弃上清，收集细菌。

4)50ml缓冲液P1重悬细菌沉淀，反复振摇，直至看不到细菌团块，细菌全部重悬于溶液中。

5)50ml缓冲液P2加入重悬液体于离心瓶，温和颠倒5-6次，溶液呈均匀蓝色，静置5min。

6)50ml缓冲液P3加入上述混合液体中，温和颠倒5-6次，蓝色溶液消失，溶液分层，上层为结实的乳白色团块，下层为清亮液体，冰上放置30min。

7)4℃，20000g，离心30min，保留上清，转移至另一离心瓶。该条件下再将上清液离心10min。

8)平衡缓冲液QBT35ml湿润平衡提取柱。

9)将(7)中得到的上清加入提取柱，自然过柱，弃去滤过液体。

10)加入洗涤缓冲液QC200ml，自然过柱，弃去滤过液体。

11)加入洗脱缓冲液QF35ml，自然过柱，收集滤过液体。

12)向收集液体中加入24.5ml异丙醇，4℃，15000g，离心30min，弃上清。

13)用7ml 70％乙醇重悬离心管中沉淀，常温15000g离心10min，弃去上清。

14)将有沉淀的离心管于超净台自然晾干，1ml生理盐水溶解。

15)紫外分光光度法(波长260nm～280nm)定量质粒含量。

16)加入洗脱缓冲液QF35ml，再将柱子洗脱1次。

17)为提高吸附柱的利用率，第二天用自配的溶液按1-15的步骤再进行1次质粒大量提取。

18)将两次提取的质粒混合，进行限制性内切酶酶切鉴定。

实施例6.细胞转染

293T细胞用含10％胎牛血清的含双抗DMEM高糖培养基37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱内培养至对数生长期，用2.5g/L胰酶消化后，以1.0×10⁶个细胞(6mL)接种于60mm培养皿中，待生长至80％融合时开始转染。依据PEI转染方法进行细胞转染，取PEI 50μL，加入到930μL含双抗DMEM高糖培养基中，另取8.0μg重组质粒加入到上述培养液中，轻轻混匀，室温，孵育15min，然后将1ml PEI/DNA复合物加到培养瓶中并轻轻摇动使混合均匀，同时以pJW4303空质粒转染细胞作为阴性对照，10h后可更换不含血清含双抗的DMEM培养液。继续培养72h后进行Western blot分析。分析结果如图4所示。图中显示gp120的重组DNA疫苗质粒转染293T细胞后可在上清和裂解产物中检出特异性蛋白的表达，其分子量约为120kDa，阴性对照空载体pJW4303转染293T细胞的上清和裂解产物中没有特异性蛋白存在。

转染细胞收获：吸取细胞上清液，2500rpm，室温，离心10min，吸取上清-20℃冻存。用PBS(浓度10mM，pH7.2)将细胞从培养皿中洗脱，收集细胞悬液，2500rpm，室温，离心10min，弃上清，加入裂解液(50mM Tris-HCl Ph7.6，150mM NaCl，1％Triton，用前加入2％100mM PMSF(苯甲基磺酰氟))，冰上孵育20min，12000rpm，4℃，离心60min，收集上清液，-20℃冻存。

实施例7.gp120核酸疫苗的免疫原性的研究方法

在编码共有氨基酸序列的核酸疫苗构建和表达成功后，通过对试验动物家兔进行核酸疫苗免疫，检测核酸疫苗的免疫原性。用ELISA和Western blot等方法，检测gp120抗原特异的抗体免疫应答。通过病毒中和试验，测定该核酸疫苗诱导产生的抗体对HIV感染的保护作用。

由于免疫家兔可以产生大量的免疫血清，可以足够进行抗体检测的研究。因此，在本发明涉及免疫保护的研究中，将用家兔免疫作为动物模型。

新西兰兔免疫，实验设计见表1：

表1 gp120疫苗和空载体免疫家兔和分组

组别	数量(只)	DNA疫苗	剂量
组别	数量(只)	DNA疫苗	剂量	A	1	AE.Gp120	200μg
B	1	BC.Gp120	200μg	A	1	AE.Gp120	200μg
B	1	BC.Gp120	200μg	C	1	ThB.Gp120	200μg
D	1	空载体对照	200μg	C	1	ThB.Gp120	200μg

肌肉注射、活体基因导入方式免疫，保证针头插入深度2mm，注射后立即于注射部位用WJ-2002活体基因导入仪进行体内电转染(技术参数：电压100V，脉冲次数正反各6次，波宽60ms，频率60Hz)，以兔子腿部肌肉发生抖动视为电转染有效。于每次免疫前和末次免疫后两周采血及收集血清。用ELISA方法和Western-blot法检测血清中gp120特异的抗体反应，评价gp120核酸疫苗在家兔动物模型中诱导产生体液免疫的能力。

实施例8.免疫应答检测

8.1ELISA检测血清中gp120特异性抗体：

ConA(50μg/ml)100μl包被ELISA板，室温孵育1h，PBST(磷酸盐缓冲液加.05％Tween-20)洗5遍；用转染DNA的293T细胞上清液100μl(1∶10，～1ug/ml)包被ELISA板，室温孵育1h，PBST洗5遍；5％脱脂奶粉4度封闭过夜，PBST洗5遍；加适当稀释的免疫兔血清100μl 37℃孵育1h，PBST洗5遍；生物素标记的羊抗兔IgG(1∶2000)，37℃孵育1h，PBST洗5遍；HRP标记链亲和素(1∶8000)，37℃孵育1h，TMB显色3.5min；2mol/LH₂SO₄ 50ul终止显色。450nm处读取吸光度(A)值。

应用ELISA检测新西兰白兔血清gp120抗体应答时间曲线如图5所示。图5中显示gp120核酸疫苗和空载体pJW4303分别免疫3只新西兰兔，于0，2，4，8周免疫，免疫前和免疫后2周收集血清。箭头表示免疫时间点。由图可知，gp120疫苗在第2次免疫后两周即可检测到gp120特异性抗体，第4次免疫后两周gp120特异性抗体水平达到最高，表明gp120重组质粒疫苗可以有效的诱导免疫应答，且随着多次免疫，免疫应答强度提高。

8.2Western blot检测血清中特异性gp120抗体：

1)gp120核酸疫苗转染293T细胞裂解及上清，pJW4303转染293T细胞裂解及上清20ul，加入5x上样缓冲液5μl，100℃，煮沸10min。

2)首先制备10％的分离胶(4ml蒸馏水，5ml 30％丙烯酰胺溶液，5.7ml 1MTris/ClpH8.8，150μl 10％SDS，150μl 10％过硫酸氨，6μl TEMED)，灌胶，液面顶端加入水，室温下聚合20～30min。

3)倒弃水，再制备5％的积层胶(4.1ml蒸馏水，1ml 30％丙烯酰胺溶液，750ul1MTris/Cl pH 6.8，60μl 10％SDS，60μl 10％过硫酸氨，6μl TEMED)，在积层胶上插入梳齿，待胶完全凝聚后，拔下梳齿。

4)将上述处理好的样品加入15％胶中进行电泳，20mA，1h，40mA，2h。

5)胶上的蛋白转到PVDF膜上，100v，2h。

6)转好的膜用5％脱脂奶粉封闭，37℃，1h。

7)用1xPBST洗膜两次。

8)将膜浸在1∶500稀释的血清中，4℃，过夜。

9)弃掉血清，用1xPBST洗膜6次，每次10min。

10)弃掉洗液，加入1∶10000稀释HPR标记的羊抗兔IgG，37℃，1h。

11)弃掉二抗，用1xPBST洗膜6次，每次10min。

12)发光剂加到膜上，暗室显影。

应用Western-blot检测新西兰白兔血清gp120抗体应答，如图6所示。由图可知，gp120重组疫苗质粒AE.gp120或者BC.gp120或者ThB.gp120诱导的兔免疫血清可以交叉识别gp120重组疫苗质粒AE.gp120或者BC.gp120或者ThB.gp120的转染产物，表明虽然AE.gp120或者BC.gp120或者ThB.gp120虽然来自不同的进化分支，但是含有相同/相近的抗原决定基。

实施例9.病毒中和试验实验研究

9.1假型病毒的构建

1)第一天上午：293T细胞传代至细胞培养皿，3*10⁶个细胞，6ml培养基。

2)第二天上午：观察293T生长至50％～80％，进行转染。

3)取7ug SF162-Env和14ug pSG3-dEnv加到1.5mlEp管中，加入900ul的DMEM，加入105ul的转染试剂PEI，震荡混匀，室温静置20min；转移至细胞培养皿；轻轻晃匀；细胞培养箱培养4～6h后，弃去培养液，更换9ml新培养液，继续培养48h。

4)第四天上午：吸取细胞培养上清，加入1ml FBS，0.45um滤器过滤，4度保存；细胞培养皿中加入9ml新培养液，继续培养24h。

5)第五天上午：吸取细胞培养上清，加入1ml FBS，0.45um滤器过滤；与第4天的滤液混匀，分装，每Ep管1ml，冻存在-80度；TCID50待测。

9.2 TCID50检测

1)取7支1.5ml的Ep管，编号1～7，每管加入480ul的培养基。

2)在1号Ep管中加入120ul的假型病毒，振荡器充分混匀。

3)从1号Ep管中取120ul至2号Ep管，振荡器充分混匀。

4)依次至6号Ep管，振荡器充分混匀，吸弃120ul。

5)应用EDTA-胰酶消化溶解TZM-BL细胞，制备单细胞悬液，计数，调整细胞浓度至1×10⁵/ml。

6)在1～7号Ep管中，每管加入480ul的TZM-BL单细胞悬液，振荡器充分混匀。

7)从1号Ep管吸取200ul加至1A～1D；从2号Ep管吸取200ul加至2A～2D；从7号Ep管吸取200ul加至7A～7D。

8)将96孔细胞培养板置于细胞培养箱中。

9)培养48h后取出培养板，轻轻甩干，去掉培养基。

10)每孔加入90ul不含血清的DMEM。

11)每孔加入90ul Bright-Glo Luciferase。

12)2min后用排枪吸取96孔中的液体至白板中。

13)上机检测，获得包括cell control在内的每个样品孔的RLU(Relative Light Unit)。

14)以cell control对照的RLU的2.5倍作为cutoff，按照SPEARMAN-KARBER法计算TCID50。

如图7所示，表达SF162-Env的HIV-1假型病毒的TCID50/ml是28000，说明假型病毒制备成功。

9.2病毒中和试验

1)96孔细胞培养板，A3～A10中加入67.5ul培养基：含10％FBS和1％P/S(青霉素100U/ml，链霉素0.1mg/ml)的高糖DMEM(Hyclone)添加DEAE-dextran(40ug/ml)。

2)A3～A4中加入7.5ul来自AE.gp120免疫的灭活兔血清，混匀；A5～A6中加入7.5ul来自BC.gp120免疫的灭活兔血清，混匀；A7～A8中加入7.5ul来自ThB.gp120免疫的灭活兔血清，混匀；A9～A10中加入7.5ul来阳性对照血清(UMASSserum)，混匀。

3)在B3～B10、C3～C10、D3～D10、F3～F10、G3～G10、H3～H10中加入50ul的培养基。

4)从A3～A10中吸取25ul至B3～B10，混匀，更换tip头，依次至H3～H10，弃去25ul。

5)在第1纵孔(1A～1H)中加入100ul的培养基；在第2纵孔(2A～2H)中加入50ul的培养基。

6)稀释假型病毒至4000TCID50/ml，在第2纵孔(2A～2H)至第10纵孔(10A～10H)中加入50ul的假型病毒稀释液。

7)置于细胞培养箱中孵育60min。

8)制备TZM-BL单细胞悬液，调整至1×10⁵/ml。

9)孵育结束后，取出96孔细胞培养板，每孔加入100ul的TZM-BL单细胞悬液。

10)置于细胞培养箱中孵育48h。

11)孵育结束后，取出96孔细胞培养板，轻轻甩干，去掉培养基。

12)每孔加入90ul不含血清的DMEM。

13)每孔加入90ul Bright-Glo Luciferase。

14)2min后用排枪吸取96孔中的液体至白板中。

15)上机检测，获得包括cell control在内的每个样品孔的RLU。

16)计算每个稀释度的抑制效率＝1-(sample-Cell control)/(Virus control-Cellcontrol)。

如图8所示，阳性对照UMASS serum可以中和SF162假型病毒；与UMASS serum比较，BC.gp120和ThB.gp120免疫血清也可以中和SF162，但是AE.gp120免疫血清不能中和SF162。由于SF162是来自B亚型的病毒，因此上述血清中和能力的差异反应了Env蛋白的变异对中和作用的影响，也说明了AE.gp120、BC.gp120和ThB.gp120诱导的免疫应答的有效性(具有中和作用)和特异性(中和作用具有亚型上的差别)。

本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。

实施例中所涉及的试剂信息如下表：

Taq酶 Promega公司

T4DNA连接酶 Promega公司

DNA marker(DL 3000) 大连宝生物公司

限制性内切酶BamH I，Pst I和Sac I Fermentas公司

DNA凝胶回收试剂盒大连宝生物公司

DMEM高糖培养基 Hyclone公司

RPM1640细胞培养液 Hyclone公司

胎牛血清 Gibico公司

质粒小量提取试剂盒 Qiagen公司

粒大量提取试剂盒 Qiagen公司

PEI Invitrogen公司

HRP标记的链亲和素 SouthernBiotech公司

HRP标记的羊抗兔IgG SouthernBiotech公司

生物素标记的羊抗兔IgG SouthernBiotech公司

TMB片剂 Sigma公司

序列表

<110>王世霞、张明顺、黄祖瑚、卢山

<120>密码子优化的HIV-1gp120基因共有序列及gp120核酸疫苗

<160>6

<210>1

<211>466

<212>PRT

<213>HIV-1病毒株A/E重组亚型

<220>

<223>HIV-1病毒株A/E重组亚型包膜蛋白gp120共有氨基酸序列

<400>1

Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Arg Asp Ala

1 5 10 15

Asp Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala His Glu Thr

20 25 30

Glu Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp

35 40 45

Pro Asn Pro Gln Glu Ile His Leu Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe

50 55 60

Asn Met Trp Lys Asn Asn Met Val Glu Gln Met Gln Glu Asp Val

65 70 75

Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr

80 85 90

Pro Leu Cys Val Thr Leu Asn Cys Thr Asn Ala Asn Leu Thr Asn

95 100 105

Thr Asn Ser Thr Thr Asn Ser Ile Asn Ile Gly Asn Ile Thr Asp

110 115 120

Glu Val Lys Asn Cys Ser Phe Asn Met Thr Thr Glu Leu Arg Asp

125 130 135

Lys Lys Gln Lys Val Tyr Ala Leu Phe Tyr Lys Leu Asp Ile Val

140 145 150

Pro Ile Asp Asn Asn Asn Ser Glu Tyr Arg Leu Ile Asn Cys Asn

155 160 165

Thr Ser Val Ile Lys Gln Ala Cys Pro Lys Ile Ser Phe Asp Pro

170 175 180

Ile Pro Ile His Tyr Cys Thr Pro Ala Gly Tyr Ala Ile Leu Lys

185 190 195

Cys Asn Asp Lys Asn Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Lys Asn Val

200 205 210

Ser Ser Val Gln Cys Thr His Gly Ile Lys Pro Val Val Ser Thr

215 220 225

Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Ile Ile Ile

230 235 240

Arg Ser Glu Asn Leu Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val His

245 250 255

Leu Asn Lys Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Ser Asn Asn

260 265 270

Thr Arg Thr Ser Ile Thr Ile Gly Pro Gly Gln Val Phe Tyr Arg

275 280 285

Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Lys Ala Tyr Cys Glu Ile

290 295 300

Asn Gly Thr Lys Trp Asn Lys Thr Leu Glu Gln Val Thr Gly Lys

305 310 315

Leu Lys Glu His Phe Asn Lys Thr Ile Ile Phe Gln Pro Pro Ser

320 325 330

Gly Gly Asp Leu Glu Ile Thr Met His His Phe Asn Cys Arg Gly

335 340 345

Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Thr Lys Leu Phe Asn Asp Thr Cys

350 355 360

Ile Gly Asn Thr Ser Glu Thr Gly Cys Asn Gly Thr Ile Ile Leu

365 370 375

Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Gly Val Gly

380 385 390

Gln Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Arg Ile Asn Cys Val

395 400 405

Ser Asn Ile Thr Gly Ile Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Asn

410 415 420

Asn Asp Thr Asn Glu Thr Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asn Ile Lys

425 430 435

Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Gln Ile

440 445 450

Glu Pro Leu Gly Ile Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val

455 460 465

Glu

<210>2

<211>476

<212>PRT

<213>HIV-1病毒株B/C重组亚型

<220>

<223>HIV-1病毒株B/C重组亚型包膜蛋白gp120共有氨基酸序列

<400>2

Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala

1 5 10 15

Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Glu Thr

20 25 30

Glu Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp

35 40 45

Pro Asn Pro Gln Glu Ile Val Leu Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe

50 55 60

Asn Met Trp Lys Asn Glu Met Val Asn Gln Met His Glu Asp Val

65 70 75

Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr

80 85 90

Pro Leu Cys Val Thr Leu Glu Cys Arg Asn Val Ser Ser Asn Gly

95 100 105

Thr Ser Asn Gly Thr Tyr Asn Glu Thr Tyr Glu Ser Met Lys Glu

110 115 120

Met Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ala Thr Thr Val Leu Arg Asp Arg

125 130 135

Lys Gln Thr Val Tyr Ala Leu Phe Tyr Arg Leu Asp Ile Val Pro

140 145 150

Leu Thr Glu Lys Asn Ser Ser Glu Asn Ser Ser Glu Tyr Tyr Arg

155 160 165

Leu Ile Asn Cys Asn Thr Ser Ala Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys

170 175 180

Val Thr Phe Asp Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Thr Pro Ala Gly

185 190 195

Tyr Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asp Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly

200 205 210

Pro Cys His Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Lys

215 220 225

Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu

230 235 240

Gly Glu Ile Ile Ile Arg Ser Glu Asn Leu Thr Asn Asn Val Lys

245 250 255

Thr Ile Ile Val His Leu Asn Gln Ser Val Glu Ile Val Cys Thr

260 265 270

Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly

275 280 285

Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln

290 295 300

Ala His Cys Asn Ile Ser Glu Asp Lys Trp Asn Glu Thr Leu Gln

305 310 315

Arg Val Ser Lys Lys Leu Ala Glu His Phe Pro Asn Lys Thr Ile

320 325 330

Lys Phe Ala Ser Ser Ser Gly Gly Asp Leu Glu Ile Thr Thr His

335 340 345

Ser Phe Asn Cys Arg Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Ser Gly

350 355 360

Leu Phe Asn Gly Thr Tyr Met Phe Thr Tyr Met Pro Asn Gly Lys

365 370 375

Gly Asn Ser Asn Thr Ser Ser Ile Thr Ile Pro Cys Arg Ile Lys

380 385 390

Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Arg Ala Met Tyr Ala

395 400 405

Pro Pro Ile Glu Gly Asn Ile Thr Cys Lys Ser Asn Ile Thr Gly

410 415 420

Leu Leu Leu Val Arg Asp Gly Gly Arg Thr Glu Asn Asp Thr Glu

425 430 435

Thr Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser

440 445 450

Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Glu Ile Lys Pro Leu Gly Val

455 460 465

Ala Pro Thr Ala Ala Lys Arg Arg Val Val Glu

470 475

<210>3

<211>465

<212>PRT

<213>HIV-1病毒株ThB亚型

<220>

<223>HIV-1病毒株ThB亚型包膜蛋白gp120共有氨基酸序列

<400>3

Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala

1 5 10 15

Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr

20 25 30

Glu Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp

35 40 45

Pro Asn Pro Gln Glu Val Val Leu Gly Asn Val Thr Glu Asn Phe

50 55 60

Asn Met Trp Lys Asn Asp Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile

65 70 75

Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr

80 85 90

Pro Leu Cys Val Thr Leu Asn Cys Thr Asn Leu Asn Thr Asn Thr

95 100 105

Ser Ser Asn Thr Ser Ser Thr Thr Glu Gly Gly Glu Met Lys Asn

110 115 120

Cys Ser Phe Asn Ile Thr Thr Ser Ile Arg Thr Lys Val Lys Asp

125 130 135

Tyr Ala Leu Phe Tyr Lys Leu Asp Ile Val Pro Ile Asp Asn Asp

140 145 150

Asn Thr Ser Tyr Arg Leu Ile Asn Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr

155 160 165

Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr

170 175 180

Cys Thr Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr

185 190 195

Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys

200 205 210

Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn

215 220 225

Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile Arg Ser Ser Asn Phe

230 235 240

Thr Asn Asn Ala Lys Ile Ile Ile Val Gln Leu Asn Glu Ser Val

245 250 255

Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile

260 265 270

His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Trp Tyr Ala Thr Gly Gln Ile Ile

275 280 285

Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Arg Thr Lys Trp

290 295 300

Asn Lys Thr Leu Gln Gln Ile Thr Glu Lys Leu Arg Glu Gln Phe

305 310 315

Gly Asn Lys Thr Ile Ile Phe Asn Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro

320 325 330

Glu Ile Val Met His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr

335 340 345

Cys Asn Thr Ser Arg Leu Phe Asn Ser Thr Trp Asn Asn Asn Ser

350 355 360

Thr Trp Asn Asp Thr Thr Gly Asn Asp Thr Ile Thr Leu Pro Cys

365 370 375

Arg Ile Lys Gln Ile Val Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala

380 385 390

Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ala Gly Gln Ile Arg Cys Ser Ser Asn

395 400 405

Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Thr Asn Glu Ser

410 415 420

Asn Thr Thr Glu Thr Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp

425 430 435

Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu

440 445 450

Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln

455 460 465

<210>4

<211>1403

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>密码子优化的编码中国HIV-1病毒株A/E重组亚型包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列

<400>4

ctgtgggtga ccgtgtacta cggcgtgccc gtgtggaggg acgccgacac caccctgttc 60

tgcgccagcg acgccaaggc ccacgagacc gaggtgcaca acgtgtgggc cacccacgcc 120

tgcgtgccca ccgaccccaa cccccaggaa atccacctgg aaaacgtgac cgagaacttc 180

aacatgtgga agaacaacat ggtggagcag atgcaggaag atgtcatcag cctgtgggac 240

cagagcctga agccctgcgt gaagctgacc cccctgtgcg tgaccctgaa ctgcaccaac 300

gccaacctga ccaacaccaa cagcaccacc aactccatca acatcggcaa catcaccgac 360

gaggtgaaga actgcagctt caacatgacc accgagctgc gggacaagaa acagaaggtg 420

tacgccctgt tctacaagct ggacatcgtg cccatcgaca acaacaacag cgagtaccgg 480

ctgatcaact gcaacaccag cgtgatcaag caggcctgcc ccaagatcag cttcgacccc 540

atccccatcc actactgcac ccctgccggc tacgccatcc tgaagtgcaa cgacaagaac 600

ttcaatggca ccggcccctg caagaacgtg agcagcgtgc agtgcaccca cggcatcaag 660

cccgtggtgt ccacccagct gctgctgaac ggcagcctgg ccgaggaaga gatcatcatc 720

cggtccgaga acctgaccga caacgccaag accatcatcg tgcacctgaa caagagcgtg 780

gagatcaatt gcacccggcc cagcaacaac acccggacca gcatcaccat cggccctggc 840

caggtgttct accggaccgg cgacatcatc ggcgacatcc ggaaggccta ctgcgagatc 900

aacggcacca agtggaacaa gaccctggaa caggtgaccg gcaagctgaa agagcacttc 960

aacaagacaa tcatcttcca gccccccagc ggcggagacc tggaaatcac catgcaccac 1020

ttcaactgca gaggcgagtt cttctactgc aataccacca agctgttcaa cgacacctgc 1080

atcggcaata cctccgagac cggctgcaat ggcaccatca tcctgccctg ccggatcaag 1140

cagatcatca atatgtggca gggcgtgggc caggccatgt acgcccctcc catcagcggc 1200

cggatcaact gcgtgagcaa tatcaccggc atcctgctga cccgggacgg cggcaacaac 1260

aacgacacca acgagacctt ccggcctggc ggcggaaaca tcaaggacaa ctggcggagc 1320

gagctgtaca agtacaaggt ggtgcagatc gagcccctgg gcatcgctcc caccaaggcc 1380

aagcggcggg tggtggagtg agg 1403

<210>5

<211>1431

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>密码子优化的编码中国HIV-1病毒株B/C重组亚型包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列

<400>5

ctgtgggtga ccgtgtacta cggcgtgccc gtgtggaaag aggccaccac caccctgttc 60

tgcgccagcg acgccaaggc ctacgagacc gaggtgcaca acgtgtgggc cacccacgcc 120

tgcgtgccca ccgaccccaa cccccaggaa atcgtcctgg aaaacgtgac cgagaacttc 180

aacatgtgga agaacgagat ggtgaaccag atgcacgagg acgtgatcag cctgtgggac 240

cagagcctga agccctgcgt gaagctgacc cccctgtgcg tgaccctgga atgccggaac 300

gtgagcagca acggcaccag caatggcacc tacaacgaga cctacgagag catgaaagag 360

atgaagaact gcagcttcaa cgccaccacc gtgctgcggg accggaagca gaccgtgtac 420

gccctgttct accggctgga catcgtgccc ctgaccgaga agaacagcag cgagaacagc 480

tccgagtact accggctgat caactgcaac accagcgcca tcacccaggc ctgccccaag 540

gtgaccttcg accccatccc catccactac tgcacccctg ccggctacgc catcctgaag 600

tgcaacgaca agaccttcaa cggcaccggc ccctgccaca acgtgagcac cgtgcagtgc 660

acccacggca tcaagcccgt ggtgtccacc cagctgctgc tgaacggcag cctggccgag 720

ggcgagatca tcatcagaag cgagaacctg accaacaacg tgaaaaccat catcgtgcac 780

ctgaaccaga gcgtggagat cgtgtgcacc cggcccaaca acaacacccg gaagagcatc 840

cggatcggcc ctggccagac cttttacgcc accggcgaca tcatcggcga catccggcag 900

gcccactgca acatctccga ggacaagtgg aacgagaccc tgcagagagt gagcaagaag 960

ctggccgagc acttccccaa caagaccatc aagttcgcca gcagcagcgg cggagacctg 1020

gaaatcacca cccacagctt caactgcagg ggcgagttct tctactgcaa tacctccggc 1080

ctgtttaacg gcacctacat gttcacctac atgcccaacg gcaagggcaa cagcaacacc 1140

tccagcatca ccatcccttg ccggatcaag cagatcatca atatgtggca ggaagtgggc 1200

agggccatgt acgcccctcc catcgagggc aacatcacct gcaagtccaa catcaccggc 1260

ctgctgctgg tgcgggacgg cggcaggacc gagaacgaca ccgagacctt ccggcctggc 1320

ggcggagata tgcgggacaa ctggcggagc gagctgtaca agtacaaggt ggtggagatc 1380

aagcccctgg gcgtggctcc taccgccgcc aagcggcggg tggtggagtg a 1431

<210>6

<211>1398

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>密码子优化的编码中国HIV-1病毒株ThB亚型包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列

<400>6

ctgtgggtga ccgtgtacta cggcgtgccc gtgtggaaag aggccaccac caccctgttc 60

tgcgccagcg acgccaaggc ctacgacacc gaggtgcaca acgtgtgggc cacccacgcc 120

tgcgtgccca ccgaccccaa cccccaggaa gtggtcctgg gcaacgtgac cgagaacttc 180

aacatgtgga agaacgacat ggtggagcag atgcacgagg acatcatcag cctgtgggac 240

cagagcctga agccctgcgt gaagctgacc cccctgtgcg tgaccctgaa ctgcaccaac 300

ctgaacacca acaccagcag caacaccagc tccaccaccg agggcggcga gatgaagaac 360

tgcagcttca acatcaccac ctccatccgg accaaggtga aagactacgc cctgttctac 420

aagctggaca tcgtgcccat cgacaacgac aacacctcct accggctgat caactgcaac 480

acctccgtga tcacccaggc ctgccccaag gtgtccttcg agcccatccc catccactac 540

tgcacccctg ccggcttcgc catcctgaag tgcaacaaca agaccttcaa cggcaccggc 600

ccctgcacca acgtgtccac cgtgcagtgc acccacggca tccggcccgt ggtgtccacc 660

cagctgctgc tgaacggcag cctggccgag gaagaggtgg tgatcagaag cagcaacttc 720

accaacaacg ccaagatcat catcgtgcag ctgaacgaga gcgtggagat caattgcacc 780

cggcccaaca acaacacccg gaagagcatc cacatcggcc ctggccaggc ctggtacgcc 840

accggccaga tcatcggcga catccggcag gcccactgca acatcagccg gaccaagtgg 900

aacaagaccc tgcagcagat caccgagaag ctgcgggagc agttcggcaa caagaccatc 960

atcttcaacc agagcagcgg cggagacccc gagatcgtga tgcacagctt caactgtggc 1020

ggcgagttct tctactgcaa taccagccgg ctgttcaaca gcacctggaa caacaactcc 1080

acctggaacg acaccaccgg caacgatacc atcaccctgc cctgccggat caagcagatc 1140

gtgaacatgt ggcaggaagt gggcaaggcc atgtacgccc ctcccatcgc cggccagatt 1200

cggtgctcca gcaacatcac cggcctgctg ctgaccaggg acggcggcac caacgagagc 1260

aacaccaccg agaccttccg gcctggcggc ggagatatgc gggacaactg gcggagcgag 1320

ctgtacaagt acaaggtggt gaagatcgag cccctgggcg tggctcccac caaggccaag 1380

cggcgggtgg tgcagtga 1398

Claims

1.中国HIV-1流行病毒株包膜蛋白gp120共有氨基酸序列，序列为SEQ ID NO.1、SEQID NO.2或SEQ ID NO.3。

2.经密码子优化的编码中国HIV-1流行病毒株包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列，序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6。

3.HIV-1gp120核酸疫苗，其特征在于该疫苗含有权利要求2所述的经密码子优化的编码中国HIV-1流行病毒株包膜蛋白gp120共有氨基酸序列的基因序列和真核表达载体。

4.根据权利要求3所述的核酸疫苗，其特征在于所述的真核表达载体为经内切酶NheI和BamHI切割质粒pJW4303得到的载体大片段。