CN107653254A - 一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组orf5基因及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因及其制备方法，重组ORF5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，本发明利用DNA shuffling技术，对不同遗传分支的PRRSV ORF5基因进行重组，获得重组的ORF5基因，再将重组ORF5基因连接原核表达载体进行原核蛋白表达，重组后的ORF5基因表达蛋白对大部分甚至所有亲本PRRSV均有免疫反应的中和抗体。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5基因的构建重组方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合症（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由Porcine reproductive and respiratory syndrome virus( PRRSV）引起的一种高度传染性疾病。研究表明，不同基因型的毒株在抗原性方面有很大的差异，现有的疫苗尚不能完全有效地控制所有或大部分PRRSV流行毒株，这与病毒的高变异性等多方面因素有关。PRRSV基因的变异性高，又以ORF5基因的变异性最大，GP5是由ORF5基因编码的囊膜糖蛋白，因此GP5也成了变异性最大的结构蛋白。ORF5基因全长约为600 bp，编码的GP5蛋白分子质量约为25 KDa，是PRRSV主要的保护性中和抗原，是PRRSV的主要结构蛋白之一。其诱导产生中和抗体，能够中和病毒，使PRRSV失去对宿主的感染性。因此，GP5蛋白在PRRSV的致病性、预防与控制等方面具有重要意义，GP5蛋白能替代PRRSV诱导机体产生中和抗体和细胞免疫反应，有很好的免疫原性，针对其研究可为防治PRRS提供重要的理论基础。
DNA shuffling技术是由Stemmer WP于1994年首先提出的。它是指将由2个或者2个以上的具有同源性的基因DNA为模板基因，以DNaseⅠ酶对该模板基因进行消化，经切割、变性形成一系列随机的小DNA片段；在无引物的情况下，进行PCR循环，所有的小片段DNA互为引物和模板进行DNA链的延长，随着循环数的增加，逐渐组成全长基因，再用基因两侧的引物扩增全长基因，构建成突变基因库；从中筛选并克隆有意义的突变体。它是一项全新的体外人工进化模式，通过基因在分子水平上的重组，再以定向筛选具有预期形状的突变体，获得同时具有多个亲本基因特征的突变基因。
本发明利用DNA shuffling技术，对不同遗传分支的PRRSV ORF5基因进行重组，获得重组的ORF5基因，再将重组ORF5基因连接原核表达载体进行原核蛋白表达，以期利用重组ORF5蛋白制备对大部分甚至所有亲本PRRSV均有免疫反应的中和抗体，为后续研究重组PRRSV疫苗奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因，重组后的ORF5基因表达蛋白对大部分甚至所有亲本PRRSV均有免疫反应的中和抗体。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因，其特征在于，所述重组ORF5基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的另一目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因的制备方法，包括以下步骤：
1）根据PRRSV标准序列，设计两对特异性引物ORF5和△ORF5，分别扩增PRRSV ORF5基因全长和去除信号肽区域的ORF5基因，扩增ORF5基因的引物序列为：P1：CACTTCATGACACCTGAGAC， P2：AAGGCATATATCATTATTGGCGT；扩增△ORF5的引物序列为：P3：ATAGGATCCGGGAACAGCAGCTC，P4：ATGCTCGAGAGGGGTAGCCGCGG；
2）ORF5引物用于扩增所选取处于不同进化分支上的8株PRRSV ORF5目的基因，8株PRRSV毒株氨基酸序列分别为FJ01~FJ08；
3）DNA Shuffling
3.1）以选取的各组ORF5基因质粒为模板进行常规PCR扩增，1 %凝胶电泳分析PCR产物，用DNA纯化回收试剂盒回收和纯化目的条带片段的PCR产物；
3.2）将回收纯化后的不同遗传分支的DNA分别用DNaseⅠ酶消化；
3.3）凝胶电泳分析酶切产物，在凝胶成像系统的紫外灯下观察酶切后目的条带，切割目的条带，用DNA纯化回收试剂盒进行回收；
3.4）无引物扩增片段化基因：混合后的段化DNA为模板和引物进行PCR扩增，凝胶电泳分析PCR产物，在凝胶成像系统的紫外灯下切割目的条带，用DNA纯化回收试剂盒进行回收；
3.5）有引物扩增：以无引物扩增片段的回收产物为模板，用特异性引物△ORF5进行PCR扩增，配制1 %的琼脂糖凝胶分析PCR产物，用DNA纯化回收试剂盒进行回收；
4)、重组ORF5基因的筛选
将回收纯化后的PCR产物连接到pMD19-T载体上进行转化，涂布到LB平板上，置于37 ℃恒温箱中培养过夜，在1.5 mL EP管中加入1 ml LB培养基，挑取单菌落于管中37℃过夜培养，对重组菌液进行PCR鉴定，并通过测序筛选出几个重组ORF5基因片段进行原核表达；
5）、重组ORF5基因的连接转化鉴定
将筛选后的重组DNA用T4 DNA连接酶与PET-32a载体连接，全量的连接产物转化至BL21感受态细胞中，后将其涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上，置于恒温箱中培养过夜，第二天挑取单菌落，在 EP管中加入含氨苄青霉素的LB培养基，每个EP管中挑取一个单菌落，震荡培养；培养后用质粒小提试剂盒对培养的菌液进行质粒抽提，用BamHⅠ内切酶和Hind Ⅲ内切酶对抽提的质粒双酶切鉴定，重组质粒核苷酸序列SEQ ID NO 1。
本发明的有益效果是：本发明利用DNA shuffling技术，对不同遗传分支的PRRSVORF5基因进行重组，获得重组的ORF5基因，重组后的ORF5基因表达蛋白对大部分甚至所有亲本PRRSV均有免疫反应的中和抗体。
附图说明
图1：PRRSV ORF5基因片段的PCR扩增产物；
图2：ORF5基因DNase Ⅰ酶切；
图3：有引物PCR扩增产物；
图4：重组质料的双酶切鉴定结果；
图5：重蛋白SDS-PAGE分析结果。
具体实施方式
下面结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述：
一、基因重组方法
1、PCR引物
根据Gene Bank登陆的PRRSV标准序列，设计两对特异性引物ORF5和△ORF5，分别扩增PRRSV ORF5基因全长和去除信号肽区域的ORF5基因，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增ORF5基因的引物序列：P1：CACTTCATGACACCTGAGAC， P2：AAGGCATATATCATTATTGGCGT；扩增△ORF5的引物序列：P3：ATAGGATCCGGGAACAGCAGCTC，P4：ATGCTCGAGAGGGGTAGCCGCGG。
2、 PCR扩增目的基因
ORF5引物用于扩增所选取处于不同进化分支上的8株PRRSV ORF5目的基因，8株PRRSV毒株氨基酸序列分别为FJ01~FJ08。
3、DNA Shuffling
（1）以选取的各组ORF5基因质粒为模板进行常规PCR扩增，1 %凝胶电泳分析PCR产物，用DNA纯化回收试剂盒回收和纯化目的条带片段的PCR产物，其方法根据试剂盒具体步骤操作;
（2）将回收纯化后的不同遗传分支的DNA分别用DNaseⅠ酶消化成大小约为50-150 bp左右的片段;
（3）凝胶电泳分析酶切产物：配置2 %琼脂糖凝胶，加入5 μL 10×Loading Buffer混匀后加入样孔中，电泳20~40min，在凝胶成像系统的紫外灯下观察酶切后目的条带。切割目的条带，用DNA纯化回收试剂盒进行回收;
（4）无引物扩增片段化基因：混合后的段化DNA为模板和引物进行PCR扩增。凝胶电泳分析PCR产物，在凝胶成像系统的紫外灯下切割目的条带。用DNA纯化回收试剂盒进行回收;
（5）有引物扩增：以无引物扩增片段的回收产物为模板，用特异性引物△ORF5进行PCR扩增。配制1 %的琼脂糖凝胶分析PCR产物，用DNA纯化回收试剂盒进行回收。
4、重组ORF5基因的筛选
将回收纯化后的PCR产物连接到pMD19-T载体上进行转化，涂布到LB平板上，置于37 ℃恒温箱中培养过夜。在1.5 mL EP管中加入1 ml LB培养基，挑取单菌落于管中37℃过夜培养，对重组菌液进行PCR鉴定。并通过测序筛选出几个重组ORF5基因片段进行原核表达。
5、重组ORF5基因的连接转化鉴定
将筛选后的重组DNA用T4 DNA连接酶与PET-32a载体连接，全量的连接产物转化至BL21感受态细胞中，后将其涂布到含有氨苄青霉素（100 mg/mL）的LB平板上，置于37℃恒温箱中培养过夜。第二天观察菌落生长情况，挑取单菌落，在1.5 mL EP管中加入1ml含氨苄青霉素（100 mg/mL）的LB培养基，每个EP管中挑取一个单菌落，在37 ℃摇床中，以200 rmp/min震荡培养12～15 h；培养后用质粒小提试剂盒对培养的菌液进行质粒抽提，用BamHⅠ内切酶和Hind Ⅲ内切酶对抽提的质粒双酶切鉴定，重组质粒核苷酸序列SEQ ID NO 1：
Aacagcagctcaaatttacagttgatttataacttgacgctatgtgagctgaatggcacagattggctggcacaaaattttgactgggcagtggagacttttgtcatcttccccgttttgactcacaatgtttcctatggggcactcaccaccagccatttccttgacacagttggtctggctactgtgtccaccgccggatattatcacgggcggtatgtcttgagtagcatttacgcagtctgtgccctggctgcgttggcttgcttcgccattaggttggtgaaaaattgtatatcctggcgctactcatgcactagatacactaattttcttctggatactaagggcaaactctaccgttggcggtcacccgtcatcatagagaaggggggtaaggttgacgttgagggtcatttaattgacctcaagagagttgtgcttgatggttccgcggctacccct。
6、重组ORF5基因的原核表达与蛋白检测
将重组质粒鉴定为阳性的菌液按照1:50比例接种到10 mL LB培养基中，分光光度计测量菌液至吸光光度值到达0.4~0.8时，加入1 mmol/L IPTG进行诱导蛋白表达。收集菌体，加100 μL上样缓冲液，煮沸10分钟后进行SDS-PAGE电泳，观察蛋白的表达情况。
7、小鼠免疫
将纯化的蛋白与弗氏佐剂按等体积混合进行乳化，按照50μg/只的剂量进行皮下多点免疫SPF BALB/c小鼠，间隔两周后加强免疫一次。免疫后第0、2、4、6、7、9和11周，对各组的小鼠进行尾部采血，血液于4℃冰箱放置，析出血清后于-20℃保存。
8、中和试验
将DMEM培养基10倍梯度稀释的8个PRRSV（10-1~10-8）接种至已长成单层MARC-145细胞的96孔细胞培养板，每孔100 μL，每个梯度做4个重复，37 °C吸附1 h，弃去病毒液，每孔加入100 μL维持液，置于37 °C 、5% CO2继续培养4~6 d，每日观察细胞病变。根据Reed-Muench方法计算待测血清的中和效价。以 1：6 的血清滴度能中和100 TCID 50 的 PRRSV为阳性。
二、试验结果
1、PCR结果
不同遗传分支PRRSV ORF5基因经PCR扩增后，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，结果显示扩增后片段与目的片段大小一致，约为750 bp。图1：M: Marker DL2000；1：阴性对照；2-6：ORF5目的基因。
2、DNA Shuffling结果
将所有回收纯化的不同遗传分支的DNA经DNaseⅠ酶成功将ORF5基因消化成大小约为50-150 bp左右的片段，琼脂糖凝胶凝胶电泳（图2的M: Marker DL2000；1-3：DNase Ⅰ酶切产物）；将所有纯化回收后的所有小片段DNA混合作为模板，进行无引物PCR，以无引物PCR产物为模板进行一次有引物PCR，获得大小500 bp左右的重组ORF5基因片段（图3：M: MarkerDL2000；1-6：有引物 PCR产物；7：阴性对照）。
3、重组ORF5基因的双酶切鉴定
将回收纯化后的重组ORF5片段通过T4 DNA连接酶与PET32a载体连接，连接的产物转化BL21感受态细胞，经过涂板，挑取单菌落进行培养，并提取菌液质粒。用BamHⅠ和Hind Ⅲ酶对抽提的质粒双酶切鉴定 (图4：M: Marker DL5000；1-2：BamHⅠ＋Hind Ⅲ双酶切产物)。
4、重组质粒的原核表达结果
重组阳性菌液加入1 mmol/L IPTG进行诱导蛋白表达，收集菌体，加100 μL上样缓冲液，煮沸10分钟，进行SDS-PAGE电泳，由结果可知目的蛋白大小约为39 KDa，最佳诱导时间为5 h（图5：M:标准低分子量蛋白质Marker；1：pET32a空载体诱导前对照2-6：pET32a+ORF5重组质粒分别诱导1-5小时）。
5、中和试验
对免疫后各时间段断尾采集的小鼠血清样品测定中和抗体水平，结果显示，免疫后第6周开始产生对6个PRRSV（FJ01~FJ04、FJ06和FJ08）中和抗体（≥8），免疫后9周产生对8个PRRSV（FJ01~FJ08）的中和抗体（≥8），表明重组蛋白对亲本毒株具有一定的抗病毒活性。
序列表
<110> 龙岩学院
<120>一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因及其制备方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 200
<212> PRT
<213> (人工序列)
<220>
<223> FJ01
<400> 1
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Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu
165 170 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val
180 185 190
Ser Ala Glu Arg Trp Asn Leu
195
<210> 8
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> FJ10
<400> 8
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser
1 5 10 15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Tyr Leu Val Val Leu Ala Asn Ala Ser
20 25 30
Asn Asn Ser Asn Ser His Ile Gln Ser Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys
35 40 45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Lys Asn Phe Asn Arg Ala Val
50 55 60
Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val
85 90 95
Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Arg Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr
100 105 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala
115 120 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
130 135 140
Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu
165 170 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val
180 185 190
Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Leu
195 200
<210> 9
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> SEQ ID NO：1
<400> 9
aacagcagct caaatttaca gttgatttat aacttgacgc tatgtgagct gaatggcaca 60
gattggctgg cacaaaattt tgactgggca gtggagactt ttgtcatctt ccccgttttg 120
actcacaatg tttcctatgg ggcactcacc accagccatt tccttgacac agttggtctg 180
gctactgtgt ccaccgccgg atattatcac gggcggtatg tcttgagtag catttacgca 240
gtctgtgccc tggctgcgtt ggcttgcttc gccattaggt tggtgaaaaa ttgtatatcc 300
tggcgctact catgcactag atacactaat tttcttctgg atactaaggg caaactctac 360
cgttggcggt cacccgtcat catagagaag gggggtaagg ttgacgttga gggtcattta 420
attgacctca agagagttgt gcttgatggt tccgcggcta cccct 465
Claims (2)
1.一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因，其特征在于，所述重组ORF5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）根据PRRSV标准序列，设计两对特异性引物ORF5和△ORF5，分别扩增PRRSV ORF5基因全长和去除信号肽区域的ORF5基因，扩增ORF5基因的引物序列为：P1：CACTTCATGACACCTGAGAC， P2：AAGGCATATATCATTATTGGCGT；扩增△ORF5的引物序列为：P3：ATAGGATCCGGGAACAGCAGCTC，P4：ATGCTCGAGAGGGGTAGCCGCGG；
2）ORF5引物用于扩增所选取处于不同进化分支上的8株PRRSV ORF5目的基因，8株PRRSV毒株氨基酸序列分别为FJ01~FJ08；
3）DNA Shuffling
3.1）以选取的各组ORF5基因质粒为模板进行常规PCR扩增，1 %凝胶电泳分析PCR产物，用DNA纯化回收试剂盒回收和纯化目的条带片段的PCR产物；
3.2）将回收纯化后的不同遗传分支的DNA分别用DNaseⅠ酶消化；
3.3）凝胶电泳分析酶切产物，在凝胶成像系统的紫外灯下观察酶切后目的条带，切割目的条带，用DNA纯化回收试剂盒进行回收；
3.4）无引物扩增片段化基因：混合后的段化DNA为模板和引物进行PCR扩增，凝胶电泳分析PCR产物，在凝胶成像系统的紫外灯下切割目的条带，用DNA纯化回收试剂盒进行回收；
3.5）有引物扩增：以无引物扩增片段的回收产物为模板，用特异性引物△ORF5进行PCR扩增，配制1 %的琼脂糖凝胶分析PCR产物，用DNA纯化回收试剂盒进行回收；
4)、重组ORF5基因的筛选
将回收纯化后的PCR产物连接到pMD19-T载体上进行转化，涂布到LB平板上，置于37 ℃恒温箱中培养过夜，在1.5 mL EP管中加入1 ml LB培养基，挑取单菌落于管中37℃过夜培养，对重组菌液进行PCR鉴定，并通过测序筛选出几个重组ORF5基因片段进行原核表达；
5）、重组ORF5基因的连接转化鉴定
将筛选后的重组DNA用T4 DNA连接酶与PET-32a载体连接，全量的连接产物转化至BL21感受态细胞中，后将其涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上，置于恒温箱中培养过夜，第二天挑取单菌落，在 EP管中加入含氨苄青霉素的LB培养基，每个EP管中挑取一个单菌落，震荡培养；培养后用质粒小提试剂盒对培养的菌液进行质粒抽提，用BamHⅠ内切酶和Hind Ⅲ内切酶对抽提的质粒双酶切鉴定，重组质粒核苷酸序列SEQ ID NO 1。
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|---|---|---|---|---|
| CN112725370A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-30 | 龙岩学院 | Prrsv orf5融合基因dna疫苗及制备方法 |
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| WO2011153351A3 (en) * | 2010-06-02 | 2012-06-28 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Novel modified live-attenuated vaccines (mlv) and subunit vaccines created by dna shuffling against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) |
| CN104974231A (zh) * | 2015-06-03 | 2015-10-14 | 青岛农业大学 | 一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株gp5重组蛋白及其制备方法及应用 |
-
2017
- 2017-09-22 CN CN201710862930.1A patent/CN107653254B/zh active Active
Patent Citations (3)
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| CN112725370A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-30 | 龙岩学院 | Prrsv orf5融合基因dna疫苗及制备方法 |
| CN112725370B (zh) * | 2020-12-30 | 2022-09-06 | 龙岩学院 | Prrsv orf5融合基因dna疫苗及制备方法 |
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