CN106170296A

CN106170296A - 具有能被广谱中和抗体识别的抗原表位的hiv‑1包膜蛋白及其片段

Info

Publication number: CN106170296A
Application number: CN201380057199.5A
Authority: CN
Inventors: P·W·伯曼; G·辰乃; 俞彬; J·莫拉莱斯; K·梅萨
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2013-09-11
Publication date: 2016-11-30
Also published as: US20180036401A1; EP2928492A2; IN2015DN03026A; WO2014043220A3; CA2929937A1; US9731002B2; WO2014043220A2; AU2013315631A1; US20150246111A1; EP2928492A4; CA2929937C; US10507239B2; AU2013315631B2

Abstract

具有天然发生的和新的工程化表位的HIV‑1包膜蛋白和片段，能够用来诱导广泛地中和抗体(并被识别)。

Description

具有能被广谱中和抗体识别的抗原表位的HIV-1包膜蛋白及其片段

发明人：

P·W·伯曼(圣克鲁兹,CA)

辰野葛文(Gwen Tatsuno)(圣克鲁兹,CA)

俞斌(Bin Yu)(圣克鲁兹,CA)

J·莫拉莱斯(圣克鲁兹,CA)

K·梅萨(圣克鲁兹,CA)

发明人地址：加利福尼亚(CA)圣克鲁兹圣克鲁兹大街1156号加利福尼亚大学(U.C.)95064USA

受让人/申请人：加利福尼亚大学董事会技术转移办公室

加利福尼亚奥克兰富兰克林大街1111号5楼94607USA

本申请代理人：BELL&ASSOCIATES旧金山西部门户大道#121 58号(58West PortalAvenue#121)加利福尼亚94127.Info@bell-iplaw.com,PTO客户No.039843

优先权申请相关性

本国际申请要求申请号为61/699,680、申请日为2012年9月11日、名称为“具有被广谱中和抗体识别的多糖依赖抗原表位的HIV-1包膜蛋白和片段”的美国临时申请的优先权，通过引用的方式，整体包含在本文中。

政府支持的声明

本申请受到[尚无政府支持]

技术领域

具有抗HIV感染免疫保护效应的疫苗。

背景技术

HIV-1疫苗开发的一个重要目标在于发现能诱导广谱中和抗体(bNAbs)的免疫原。经过25年以上的努力，目前还没有开发出能够诱导该类型抗体的疫苗。在过去的十年中，未能够诱导bNAbs的原因归结为我们没有成功地精确复制在病毒表面构成病毒刺突的三聚包膜蛋白(gp120和gp41)。

在过去的几年中，已有数据表明广谱中和抗体识别HIV-1包膜蛋白中的聚糖依赖表位，而gp120不是只由氨基酸组成的表位。最近，已经解开了数个结合于HIV-1包膜蛋白的广谱中和抗体3D结构。这表明，多达77％的经所选广谱中和单克隆抗体(bN-Mabs)识别的结合表面由糖类构成的。

此外，这些研究表明，通过原型PG9MAb(16)识别的表位定位于gp120的V1/V2结构域并依赖甘露糖-5而结合。类似地，通过原型MAb PGT128(15)识别的另一个表位定位于V3loop的干部(stem，茎部)并依赖甘露糖-9来结合。

即使bN-Mabs与单体gp120有结合，它们也是很少的，但它们却展示出与细胞或病毒表面三聚物包膜的有力结合，所以，这些抗体被认为识别于糖类和包膜三聚物四级结构依赖的表位(8,15)。对个体发生的PG9-样抗体的研究(3)证实PG9种系前体(germlineprecursor)和PG9-样抗体均不能与大多数单体gp120蛋白结合。

然而，一个显著的例外是来自HIV-1A244株的gp120。我们实验室早在1990年代初对该病毒序列进行了测定(7)，并对该蛋白进行了多年的研究。该蛋白确实是AIDSVAX B/E疫苗的一个主要元件，该疫苗由基因泰克(Genentech)开发然后许可给VaxGen(1,2)。该疫苗在泰国(1998-2003)实施的3期临床(VAX003)试验中没能提供保护作用(11)。然而，在涉及16000多名志愿者、结束于2009年的RV144试验中(12)，当该疫苗与另一个疫苗vCP1521联合使用时，则达到了适度的但是有效的保护(31.4％有效性)作用。

发明概述

本发明人已经发现，几乎所有的单体gp120都会与PG9结合，只要它在156和160位具有糖基化位点，且未被糖基化或仅部分糖基化，以及约在166-173位氨基酸区域具有适宜的氨基酸。本发明人具有来自数个分离的和新合成的构建物数据表明了该情况属实。HIV科学家们目前的共识是，由于四级(结构)相互作用，gp120与三聚体结合地更好。本发明人表明这是不正确的——如果在GNT1(-)细胞中产生，几乎任何gp120都将结合。我们的数据表明，PG9与三聚体结合地更好，因为细胞内形成的三聚体屏蔽了156和160位与糖处理酶(glycoprocessing enzymes)的相互作用，导致在156和160位的不完全糖基化。大多数单体蛋白不会被屏蔽于这些酶，并因此获得完全成熟的不被PG9识别的复合类糖类。因此，PG9与三聚体的优先结合归结于由三聚反应导致的不完全的糖基化，而不是基于四级相互作用的表位的存在。

本发明基于的理论是，对PG9-样表位免疫反应的最佳改进方式是开发小而合适的糖基化糖蛋白片段，或具有本发明人发现的PG9结合所需的糖类结构的“支架”(scaffolds)，及其与其它Env蛋白或其它支架的组合来制备多价鸡尾酒疫苗。

本发明包括HIV gp120V1/V2抗原(支架)的小型糖基化片段，其具有PG9结合所需的糖类结构。本发明还包括将此类支架和其它Env蛋白或其它支架联合来制备多价鸡尾酒疫苗。

本发明包含一疫苗，其包含V1/V2糖蛋白片段支架，其在一细胞系中制备，例如HIV-1的A244株，或在其它的实施方式中，两个或多个HIV株，其中糖基化限定于甘露糖-5的糖基化，并且其中所述的支架在V1/V2结构域具有被PG9MAb(单克隆抗体)识别的表位。

所述V1/V2支架可以在细胞系中产生的任何HIV-1毒株中表达，其中糖基化限定于甘露糖-5的糖基化，并且其中所述的支架在V1/V2结构域具有被PG9MAb识别的表位。

所述疫苗可以包括源自产生于细胞系中的两个或多个HIV-1株的V1/V2支架，其中糖基化限定于甘露糖-5，并且其中所述的支架在V1/V2结构域具有被PG9MAb识别的表位。

在不同的实施方式中，所述支架可以偶联于免疫原性载体蛋白。

在另一实施方式中，疫苗可以包括gp120和V1/V2支架的混合物，其中两个组分均产生于甘露糖-5被包含在V1/V2结构域中的条件下，并且两个组分均能够结合至PG9MAb。

此外，一个或两个组分来源于HIV-1的A244株。

其中，使用两个或多个免疫原性组分，例如gp120和所述V1/V2支架的混合物，各组分可以同时施用于对象并且两个组分可以包含在同一制剂中并在同一时间进行免疫。

可选地，各组分可以分别制成制剂，可以在不同的时间进行免疫(基础/强化方案)。

另一个实施方式中，包含源自经突变的MN-rgp120的包膜基因，所述MN-rgp120突变成在289、301、332位和任选的334位含有N-连接的糖基化位点，当表达于标准(normal)293细胞中时，具有能够被PG9和PGT128MAb识别的表位。(MN-rgp120是一重组gp120，其为在RV144试验中的AIDSVAX B/E疫苗的一个主要的成分)。

在另一实施方式中，所述疫苗制剂是基于重组gp120的，其来自于源于经突变的MN-rgp120的包膜基因，所述经突变的MN-rgp120在289、301、332和/或334位含有N-连接的糖基化位点，当表达于标准293细胞中时具有能够被PG9和PGT128MAb识别的表位。

相关的实施方式中，进一步包括V1/V2支架，所述支架的产生条件中V1/V2结构域含有甘露糖-5，并且两个组分均能够结合至PG9MAb。

在可选的实施方式中，所述疫苗包括一混合物，该混合物包括gp120和V1/V2支架，gp120来自源于经突变的MN-rgp120的包膜基因，所述经突变的MN-rgp120在289、301、332和/或334位含有N-连接的糖基化位点，当表达于标准293细胞中时，具有能够被PG9和PGT128MAb识别的表位；源自HIV-1A244株的V1/V2支架能够结合于PG9Mabs，其产生的条件中V1/V2结构域含有甘露糖-5，并且两个组分均能够结合至PG9MAb并且同时、或可选地、序贯地，以基础/加强(Prime/boost)方案施用。

在另一优选例中，将具有PG9和PGT128表位的单体gp120(例如MNgp120糖基化突变体UCSC468)免疫一对象，然后采用结合PG9的V1/V2片段以及结合PGT128的V3片段进行加强。

某实施例中包括一组合物，所述组合物含有在156和160位具有糖基化位点的单体gp120.在多个实施例中，gp120产自GNT1(-)细胞。

附图说明

图1 PH9结合至包膜蛋白的ELISA

图2 结合至gp120片段的PG9

图3 A244和V1/V2支架的PAGE和圆二色谱分析

图4 PG9和PGT128变体与MN-rgp 120的结合

图5在含和不含几夫碱(Kifunensine)的条件下，GP120在293F细胞中的表达

图6 V3支架

图7 GP120片段图

图8 PG9结合至V1/V2支架-间接ELISA形式

图9 PG9结合至V1/V2支架-分化支(Clade)B和对照

图10 PG9结合至V1/V2支架-分化支C

图11 能够较好地结合PG9MAb的两个A244V1/V2支架序列

图12a-e显示了与PG9结合的V1/V2支架的多核苷酸序列(以FASTA形式)

图13a-f显示了V1/V2支架蛋白的初级氨基酸序列。这包括具体的新合成序列(其中一些包括连接到信号序列的V1/V2结构域)，其表现为稳定性提高、结合能力提高，且两个多糖结合的要求有所降低。

图14a-f中的图表显示了PG9结合至V1/V2支架(产生于293Freestyle^TM细胞和293-GnT1-细胞)的ELISA数据。该数据与图12a-e和13a-f中具体的新合成序列相关。

图15a显示了在293F株中表达的片段

图15b显示了在Gnt1(-)株中表达的片段

发明概要

交叉引用：US临时申请No.61/699,680，申请日2012年9月11，通过引用的方式全文合并于此，就像在临时申请和本公开中涉及的所有文件那样。

术语“互补”和“互补性”指多核苷酸通过碱基配对的天然结合。例如，序列“5'A-G-T 3'”结合到互补序列“3'T-C-A 5'”。两个单股分子间的互补性可以是“部分的”，例如只有一些核酸结合，或者可以是“完全的”，导致在单股分子之间存在整体互补性。核酸链间的互补性程度显著影响核酸链间的杂交效率和强度。

术语“反义的”是指包含一核酸序列的任何成分，其与特定的核酸序列的“正义链”是互补的。反义的分子可以通过任何方法制备，包括合成或转录。一旦导入到细胞中，所述互补的核苷酸与所述细胞产生的天然序列结合形成双链并阻止其转录或翻译。标识“负”或“减号”能够指反义链，标识“正”或“加号”能够指正义链。

“保守氨基酸替换”是那些当发生后，与原始蛋白的特性很少冲突的替换，例如，蛋白的结构尤其是功能是保守的，且经过此类替换并没有显著的改变。下表显示了能够替代蛋白中原始氨基酸的氨基酸，这些被视为保守性的氨基酸替代。

术语“衍生物”指多肽序列或多核苷酸序列的化学修饰。多核苷酸序列的化学修饰包括，例如，通过烷基、酰基、羟基、或氨基基团替换氢。衍生的多聚核苷酸编码的多肽保留了天然分子的至少一种生物学或免疫学上的功能。衍生的多肽是通过糖基化、聚乙二醇化、或任何相似过程修饰的、保留了衍生它的多肽的至少一种生物学或免疫学上的功能。

“片段”是母序列独特的一部分，其在序列上与母序列一致，但是长度上更短。片段可以包括至多所定义序列的完整长度减去一个核苷酸/氨基酸残基。例如，片段可以具有至少5,10,15,20,25,30,40,50,60,75,100,150,250或至少500个连续的核苷酸或氨基酸残基的长度。片段可以优先的选自一个分子的特定区域。例如，一多肽片段可以包括一特定长度的连续氨基酸，其选自所示特定具体序列的初始250或500个氨基酸(或初始的25％或50％的多肽)。显而易见地，这些长度是示例性的，本说明书支持任何长度，包括序列表、表格和附图，可以包含在本实施方式中。

应用于多核苷酸序列的短语“同一性百分比”和“％同一性”，是指使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配的百分比。在一个标准化的和可再现的方式中，这样的算法可以在比对序列中插入缺口，以便优化两个序列间的匹配，并且因此实现两个序列的更有意义的比较。核苷酸序列之间的同一性百分比可以通过将Clustal V算法的默认参数并入MEGALIGN版本3.12e序列对比程序来确定。这个程序是LASERGENE软件包的一部分，一套分子生物学分析程序(DNASTAR，威斯康星州麦迪逊-Madison WI)。CLUSTAL V描述于Higgins,D.G.和P.M.Sharp(1989)CABIOS 5:151-153和Higgins,D.G.等.(1992)CABIOS 8:189-191。对于多核苷酸的双序列比对，默认的参数设置如下：Ktuple＝2,gappenalty＝5,window＝4,和“diagonals saved”＝4。“weighted”残基重量表选为默认。通过CLUSTAL V，以匹配的多核苷酸序列对之间的“百分比相似度”报告百分比同一性。可选地，一组常用的和免费提供的序列比较算法是美国国家生物技术信息中心(NCBI)的基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul,S.F.等.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。“BLAST 2序列”工具可同时用于blastn和blastp(下面讨论)。BLAST程序通常将间隙和其它参数设置为默认设置。例如，为了比较两个核苷酸序列，可以使用具有“BLAST 2序列”工具2.0.9版(5-07-1999)的BLASTN，设定为默认参数。此类默认参数可以是，例如，Matrix:BLOSUM62；Reward for match:1；Penalty for mismatch:-2；Open Gap:5and Extension Gap:2penalties；Gap x drop-off:50；Expect:10；Word Size:11；.Filter:on。

同一性百分比可以在整个具体序列的长度下进行测量，例如，由特定SEQ ID编号所定义的，或者可以在更短的长度进行测定，例如，从更长的具体序列所取的一个片段长度，例如，至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少70个、至少100个、或至少200个连续的核苷酸的片段。这样的长度只是示例性的，并且应该理解，本文中，表格、附图或序列表中所示序列支持的任何片段长度，都可以用于描述测量该百分比同一性的长度。

短语“同一性百分比”和“％同一性”，应用于多肽序列时，是指使用标准化算法比对的至少两个多肽序列之间的残基匹配的百分比。多肽序列比对的方法是公知的。一些比对方法考虑到保守的氨基酸取代。这类保守取代，上文作了更详细地解释，通常在替代的部位保留了疏水性和酸度，从而保留所述多肽的结构(以及功能)。

通过将Clustal V算法的默认参数并入MEGALIGN版本3.12e的序列对比程序(描述和引用如上)，可以确定多肽序列之间同一性百分比。对于使用CLUSTAL V的多肽序列的双序列比对，默认的参数设置如下:Ktuple＝1,gap penalty＝3,window＝5,and“diagonalssaved”＝5。同一性百分比可以在整个具体多肽序列的长度下进行测量，例如，由特定SEQID编号所定义的，或者可以在更短的长度下进行测定，例如，从更长的具体多肽序列所取的一个片段长度，例如，至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少70个、至少150个连续的残基。这样的长度只是示例性的，并且应该理解，本文中，表格、附图或序列表中所示序列支持的任何片段长度，可以用于描述测量该百分比同一性的长度。

短语“核酸”和“核酸序列”指一核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、或其任何片段。这些短语也指基因组或合成来源的DNA或RNA，可以是单链或双链的，可以代表正义或反义链，也指肽核酸(PNA)、或任何DNA样或RNA样材料。

“可操作地连接”是指这样的情况：第一核酸序列被置于与第二核酸序列的功能性关系中。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子是可操作地连接于编码序列的。通常，可操作连接的DNA序列可以是邻近的或相连的，当需要连接两个蛋白编码区时，在同一个阅读框架内。

特定核酸序列的“变体”被定义为这样一种核酸序列：通过BLASTN的“BLAST2序列”工具版本2.0.9(05-07-1999)设置为默认参数测定时，其在核酸序列之一的一定长度内，与特定核酸序列具有至少40％的序列同一性。这样的一对核酸可以显示为，例如，在一特定具体长度内，具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％或以上的序列同一性。变体可被描述为，例如，一个“等位基因”(如上所定义)、“剪接”、“物种”或“多态”变体。剪接变体可与基准分子具有显著的同一性，但是由于mRNA加工过程中外显子的选择性剪接，其通常具有更多或更少数量的多核苷酸。相应的多肽可以具有额外的功能结构域或缺少在参照分子中存在的结构域。物种变体是物种与物种之间不同的多核苷酸序列。所得的多肽一般相对各自具有显著的氨基酸同一性。多态变体是在给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。多态变体也可包括“单核苷酸多态性”(SNP)，其中所述多核苷酸序列由于1个核苷酸碱基而不同。SNP的存在可以指示，例如，特定的群体，疾病状态或疾病易感性。

特定多肽序列的“变体”被定义为这样一种核酸序列：通过BLASTN的“BLAST2序列”工具版本2.0.9(05-07-1999)设置为默认参数测定时，其在多肽序列之一的一定长度内，具有至少40％的序列同一性的多肽序列。这样一对的多肽可显示为，例如，具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少98％或更高的序列同一性。

发明详述

HIV疫苗研究的一个主要目标是鉴别能够诱导产生有效抵抗HIV原代分离株的广谱中和抗体(bNAbs)的抗原。申请人研究了HIV-1包膜糖蛋白，gp160、gp120和gp41的分子特征，特别是位于V1/V2结构域的被PG9MAb识别的表位，其赋予病毒对中和反应的灵敏度和抗性。

实验结果。基于A244-rgp120能够结合到PG9的报道，本发明人分析了来自AIDSVAXB/E疫苗的A244和MN-rgp120的档案样本，看看它们是否是因为缺乏结合PG9和PGT128MAb的表位和糖类而没能提供保护。本发明人发现了A244-rgp120为弱结合和MN-rgp120为未结合。本发明人还发现，这两种蛋白在糖基化方面是高度异质的，其大多数糖类为复合的含唾液酸形式，并不结合任何MAb(17)。为了发现本发明人是否能够提高gp120单体的结合，本发明在缺乏N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(GnTI)(其使所有预测的(predicted,潜在的)N-连接糖基化位点(PNGS)都含有甘露糖-5聚糖)细胞系中，自3株病毒(MN,TRO11和A244)制备了单体gp120。当在标准的293细胞中生长时，MN-rgp120和TRO11-rgp120均不能结合至PG9，并且A244-rgp120表现出与PG9的弱结合(图1A和B)。然而，当这些蛋白表达于GnTI细胞中时，所有的三种蛋白均能高亲和度地结合至PG9。这些结果无疑证明了只要存在适合的糖基化， gp120单体能够结合至PG9，并且对该抗体的结合不需要三聚化的包膜蛋白。该想法出版于我们的2012年PloS One出版物(17)。

关于V1/V2结构域的糖基化的异质性和本质存在很大的争论。我们的产自GNTI-细胞的蛋白展示了3个主要的结合，并且均归因于在糖基化位点占位的不同。因此，当使用可去除所有N-连接糖类的PNGase处理或使用可去除所有高甘露糖糖类(包括甘露糖-5聚糖)的Endo H处理进行去糖基化后，所有的3条带解离成单条带。本发明人通过质谱研究发现，3条带归因于糖基化位点占位的不同。这些研究表明所有的3条带在156和160位具有为PG9结合所需的糖类。在我们实验室进行的这些研究使用了LC-MS/MS。本发明人还进行了在GNTI-细胞中表达的A244V1/V2片段的二硫化物绘图研究。本发明人发现，存在显著的二硫化异质性，在一些制备物中高达50％。本发明推测这将会影响PG9结合，但是还没有研究。

从V1/V2结构域开发与聚糖-依赖bN-MAbs结合的支架.当在GnTI-细胞中表达gp120能够极大地提高与PG9样抗体的结合，该生产方法导致了生物物理学和药代动力学模式上的重大变化，其危及到RV144临床试验中所获得的保护性免疫。理想地，本发明人希望加强现存的AIDSVAX B/E的效率而不是从头开始开发新的疫苗。见图1。

本发明人完成该项研究的一个方式是使用产自GnTI-细胞中的其它Env蛋白补充AIDSVAX疫苗。然而，抗体与gp120的反应非常复杂，并且与GnTI-细胞产生的任何Env蛋白反应的所有抗体中只有一小百分比，指向PG9表位。此外，在GnTI-细胞中，Env的产生将破坏其它重要的用于结合的中和表位，比如取决于甘露糖-9糖基化的被PGT128和2G12识别的那些(10,15)。因此，本发明人推论改善PG9样表位免疫反应的最好的方式将会是开发小而适当的具有PG9结合所需糖类结构的糖基化片段、或支架其，并将其与其它Env蛋白或其它支架联合来制备多价鸡尾酒疫苗。

为了测定本发明人是否能够鉴定可结合PG9样抗体的支架，本发明人首先测试了自MN-rgp120的一系列gp120片段用于绘制小鼠MAb，至MN-rgp120的V2结构域的图谱(9)。这些片段以融合蛋白的形式表达，其具有信号序列和HSV糖蛋白(gD)的氨基-末端标志表位。当本发明人测试在标准293细胞中产生的片段时，PG9未能与任何片段结合。然而当用GnTI-细胞生产这些片段时，本发明人发现了三个与PG9结合的片段(7-15、4-27、和1-3)(图2A)。最小的结合片段，1-3长度为265个氨基酸并含有V1-C3结构域。因而，尽管GnTI-细胞中的生产改善了gp120片段与MN-rgp120的结合，该最小的片段仍然远大于理想的免疫原性支架。为了尝试找到一个更小的片段，本发明人测试了来自A244-rgp120的一系列可比片段。本发明人发现A244-rgp120的一个106个氨基酸片段(图2C)包含了完整的V1/V2结构域，当其在标准293细胞中表达时展现出弱PG9结合性(数据未示出)，当在GnTI-293细胞中表达时则展现出高亲和度结合(图2B)。为了进一步研究包含9PNGS的该片段特性，本发明人测定了其与三个PG9样抗体的结合：CH01、CH03、和PG16(3,8,15)。本发明人发现当在GnTI-细胞而非在293细胞中表达时，CH01和CH03与A244-V1/V2支架依然结合地很好。然而，PG16则无论细胞类型如何均不与所述支架结合，证实了该抗体识别包括V2结构域之外序列的表位(8,16)。A244-V1/V2支架的发现是一个重要进展，因为它提供了一个具有诱导PG9样抗体潜力的免疫原。

受到这些成功研究的鼓舞，本发明人试图从其它类似蛋白生产V1/V2支架。接下来本发明人尝试的是从CF01_AE TH023Env(包含于RV144临床试验中的vCP1521痘病毒载体)中所制备的支架。有趣的是，本发明人发现该支架在GnTI-细胞中表达时，表现出与PG9MAb的良好结合，但是极少或不与CH01、CH03、或PGT145MAb结合(数据未显示)。该结果证实的报告提示PG9、CH01和CH03MAb结合于不同的重叠表位(8)。我们目前的工作包含从其它分化支识别支架，本发明人可用其进行下文所述的后续免疫研究。本发明人首先筛选出标准293细胞产生的与PG9结合的包膜蛋白，如用A244-rgp120观察到的那样，然后使用它们中最好的来制备本发明人于GnTI-293细胞中表达的V1/V2支架。本发明人从我们实验室生产的一组C分化支病毒(13)中筛选的Env蛋白的研究结果显示于图1(C)。基于这些结果，来自于ZA97010分离柱的所述Env基因表现出了产生V1/V2支架的潜力。本发明人同样筛选了许多B分化支Env，并鉴别了数个能够与PG9结合的。

V1/V2支架的结构特征。本发明人接下来意欲表征A244-V1/V2支架的结构。本发明人首先通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测了产自标准和GnTI-293细胞的支架的大小。这些研究的结果如图3A所示。如预期的那样，在标准293细胞中产生的所述V1/V2支架跑出了弥散模糊的38-55kDa的条带。为了进一步研究，本发明人使用PNGase处理了A244-V1/V2支架以去除所有N连接的糖类，或使用糖类内切酶H(Endo-H)特异性针对高甘露糖糖类。使用PNGase处理产生了14kDa的单一条带，使用Endo-H处理产生了约17kDa的单一条带。这些结果证明，所述支架是高度糖基化的，以及在GnTI-细胞中产生的支架中可见到3个不同条带是因为附着糖基化数量的差异。鉴于在A244-rgp120的83个氨基酸V1/V2片段中具有9个PNGS(预测的N连接糖基化位点)，使用Endo H处理之前和之后的糖蛋白支架大小存在显著的不同是可以理解的。我们的结果表明，本发明人观察到的变化很有可能归因于使用的特定PNGS的差异。这时候，本发明人不知道PG9是否与3个条带同样地结合，但是使用免疫沉淀反应研究可计划解决该问题。另外，计划使用质谱研究来检测是否所有的PNGS位点都被利用。

因为V1/V2结构域是4-链反平行β折叠，当使用圆二色谱(CD)测定时该片段应具有独特的吸收光谱。此类研究的结果如图3B所示。本发明人在218nm处观察到了清晰的吸收谱表明β折叠结构的存在。当本发明人检测经过还原和羧甲基化破坏了三级结构后的相同蛋白的吸光度时，光谱改变为特有的无规则曲线(4)。因而，圆二色谱提供了一个证明A244-V1/V2片段中存在β折叠结构的简便方法。

在PG9表位含有甘露糖-5聚糖和在PGT128表位含有甘露糖-9聚糖的机制。在gp120中发现了聚糖-依赖的表位是有趣的，本发明人想研究其机制，通过该机制HIV-1能够在特异性的PG9和PGT128/2G12MAb识别的表位上，选择性地在N连接的糖基化途径中合并中间体(例如，甘露糖-5和甘露糖-9)。数个团队提示，在gp160定时形成的过程中，糖基化位点是被聚糖加工酶封闭的，，导致在所选位点的不完全糖基化(5,6)。然而，这不能解释当在标准293细胞中表达时，单体A244-rgp120表现出具有PG9结合所需的聚糖，而来自MN株的gp120则不能够结合PG9。为了解释该现象，本发明人比较了MN-rgp120和A244-rgp120的序列和结构特征。本发明人注意到，MN-rgp120与A244gp120结构不同在于V3干区的糖基化位点数目上，在，其中MN-rgp120具有2PNGS而A244-rgp120具有4PNGS(图4A)。

为了检测在V3干区存在的糖基化位点是否影响V1/V2结构域中PG9表位的糖基化类型，本发明人采用了定点诱变来体现存在于A244-rgp120的V3区的PNGS(预测的N连接的糖基化位点)至缺乏这些位点的MN-rgp120结构中(图4A)。令人惊讶的是，本发明人发现在第289、301、和332或334位添加两或三个PNGS位点后，使在标准293细胞中生产的蛋白(UCSC467,、468、和469)现在也能够结合到PG9(图4B-C)。另外，插入这些糖基化位点同样导致这些MN-gp120糖基化突变体有能力与在第301和332位需要甘露糖-9的PGT128MAb(图4D)结合。因而，当糖基化位点存在于V3干区(如在A244-rgp120或UCSC467、468、和469蛋白)，第156和160位受到空间保护并且难以被糖蛋白处理酶接近，导致聚糖结构限于甘露糖-5形式。

前期的研究表明，不完全的糖基化起因于由多肽链或N聚糖的密集群造成的(14)空间位阻。很可能的是这两种类型的相互作用导致PG9和PGT128MAb结合所需的糖基化途径中间体的掺入。这些结果表明，这些聚糖壳被认为在HIV-1进化中用于阻止中和抗体结合、同样阻止糖类处理酶的接近。因此，这些PNGS(预测的N连接的糖基化位点)有时相互干扰，导致中间结构的掺入(例如，甘露糖-5和甘露糖-9)。开发上述的单体MN-rgp120糖基化突变体，能够结合目前为止两个最强的中和MAb(PG9和PGT128)，代表了一个主要的进展，在开发改进的gp120亚基疫苗方面尤为有用。

最近进一步的数据显示，来自HIV-1 108060分离株的gp120片段，当在几夫碱(kefunensine)存在下制备该片段时，能够结合PGT128MAb(其在V2结构域的干区识别甘露糖-9依赖的聚糖表位)。PGT128是已发现的最有效的天然单克隆抗体。几夫碱是一种能够将N连接的糖基化限制到甘露糖-9形式的药物。

在一个实施方式中，使用具有PG9和PGT128表位的单体gp120(如本发明人描述的MN gp120糖基化突变体(UCSC468)一样)免疫一对象，和随后使用结合了PG9的V1/V2片段和结合了PGT128的V3片段进行增强。

V1/V2片段可以是产自GNTI-细胞的A244-V1/V2，V3片段可以是数个产自生长在经几夫碱处理的细胞中的108060包膜蛋白中的一个。这些数据表明了使用多重片段了提供中和单克隆抗体。见图5,6,和7。

额外的数据显示，当生长于GNTI-细胞中时，V1/V2支架可以从其它病毒株和其它分化支中制得。然而，PG9同这些支架的结合要弱于同A244-V1/V2片段的结合。因此，本发明人已经从总计7种不同的包膜蛋白(A244、TH023、BAL、CAP45、ZM109、ZM197、和ZM53)中制备了支架。见图8、9、和10，其显示了PG9与V1/V2支架的结合。

支架蛋白的序列。图11显示了能够良好结合至PG9MAb的两个A244V1/V2支架的实际序列。UCSC 588构建物具有gD信号序列(HSV糖蛋白D的氨基-末端标记表位)和融合于V1/V2结构域的标记表位。UCSC 596构建物缺乏gD标记，并在C-末端具有His标签。它也在gD信号序列末尾和V1/V2序列的开头插入有源自成熟gp120N-末端的、11个氨基酸的小序列，插入于。该序列代表了共有序列，来自HIV-1的CRF01_AE分枝的病毒N-末端，并被设计为能够在标准的信号肽酶裂解位点进行裂解。见图11。

进一步合成工程化的支架蛋白

本发明人进一步工程化合成支架蛋白。这些V1/V2结构域支架均被表达为融合蛋白，具有信号序列和单纯性疱疹病毒糖蛋白D的27个氨基酸标记表位。除了标记表位之外，工程化的蛋白具有3个氨基酸的肽接头(LLE)。

在大多数情况下，V1/V2序列以VPL开始。实验数据显示，当生长于GnTI-细胞中，这些片段均能够结合PG9，但是当生长于293细胞中时很难结合PG9。然而，ZM233片段表现的比较独特，当在293细胞中生产该支架时，能够良好的结合至PG9。该特征提供了一个制备方面的巨大优势，由于该蛋白能够生产自一些人类药学生产可接受的标准细胞系中。

使用来自人组织纤溶酶原激活物和ICAM-1的信号序列，已经成功的表达了这些合成的片段。

制备合成工程化支架蛋白的方法

gp160

通过AIDS试剂计划(AIDS Reagent program)获得质粒DNA。ZM233(目录号#1131；登记号#DQ388517；)；ZM109(目录号#11314；AY424138；)；CAP45(目录号#11316；登记号#DQ435682)；Bal.01(目录号#11445；登记号#DQ318210)；ZM53(目录号#11313；登记号#AY423984)；ZM197(目录号#11309；登记号#DQ388515)

V1/V2片段的构建

使用包含Kpn1和Not1的限制性位点引物，从gp160PCR扩增V1/V2片段。使用相关的限制性内切酶消化所述片段，并构建表达载体(pRK)，该表达载体包含HSV信号序列、HSV gD“标签”(HSV糖基化蛋白D的氨基-末端标记表位)、和用来隔开V1/V2片段起始部分的“标签”的一短肽接头LLEVPL。所述片段自117位氨基酸开始(HXB2编号)并在207位氨基酸终止；在208位置放置了一个终止密码子。所有的片段包含3个二硫键。

表达

在293F^TM细胞(英杰公司-Invitrogen:#R790-07)或293-GnT1-细胞(ATCC:#CRL-3022)中表达所述V1/V2片段。使用聚乙烯亚胺(PEI)转染。简略地说，1x10⁸293F或GnT1-细胞在1200rpm下离心10min。去除培养基，将细胞重悬于5ml含有0.1％普朗尼克酸的培养基中；加入250ug质粒DNA和800ug PEI。37℃孵育3hr，将细胞液定容自终体积100ml。转染3天后，收集细胞上清液，离心，使用0.45um PES滤膜过滤。

ELISA数据

使用间接ELISA检测PG9与V1/V2片段的结合。简要地说，在PBS溶液中，使用2ug/ml抗-gD抗体(34.1)包被Maxisorp ELISA板(Nunc)，4℃过夜。第二天使用4×PBS+0.05％吐温(Tween)-20冲洗板。使用PBS+1％BSA室温封闭2hrs。加入细胞上清(100ul)1hr。加入10ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.1ug/ml、0.05ug/ml、0.01ug/ml、和0.001ug/ml的PG9。空白孔用来检测背景吸收度。第二抗体为过氧化物酶偶联的抗人Fc，用于检测PG9。加入底物(OPD)10min，使用3M H₂SO₄终止反应。所有的稀释(除了包被)均使用PBS+1％BSA。每步孵育后均要洗涤。

图12a-e和13a-f以FASTA形式，显示了结合PG9的野生型V1/V2支架，和合成支架蛋白。这些包括特异的新合成序列(其中一些包括连接有HSV信号序列的V1/V2结构域)，表现出了增强的稳定性，增强的结合力和降低的双聚糖结合需求。

图14a-f显示了图12a-e和13a-f的特异的新合成序列的数据。图14a-f的图表显示了PG9结合至V1/V2支架(产自293Freestyle^TM细胞和293-GnT1-细胞)的ELISA数据。

图15a显示了表达于293F株的片段和图15b显示了表达于Gnt1(-)株的片段。

图16是一个示意图，显示了检测PG9与V1/V2片段结合的ELISA方法。该图片也显示了V1/V2片段初级结构HSV信号序列连接到gD标签连接到肽接头。同时显示了抗体沿着多肽的不同位点与它们Fc区域的结合。

结论。本发明中的一个重要结论是，本发明人发现了只要在156和160位具有糖基化位点，和在约166-173位氨基酸区域具有适宜的氨基酸，几乎所有的gp120都将结合到PG9。本发明人来自数个其它分离株和新合成构建物的数据证明了该结论的真实性。目前HIV科学家一致认为，gp120三聚体结合的更好是因为四级相互作用。本发明人证明了这是错误的，只要其产生于GNT1(-)细胞中，几乎所有的gp120都将结合。

我们的数据表明，PG9与三聚体结合的更好，是因为细胞内三聚体的形成屏蔽了156和160位与糖基化酶的相互作用，导致这些位置的不完全的糖基化。大多数单体蛋白没有屏蔽于这些酶，并因此获得了不能被PG9识别的完全成熟的糖类复合类型。因此，三聚化导致的不完全糖基化而非存在依赖于四级相互作用的表位是PG9结合三聚体的优先原因。

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Claims

1.一种制备疫苗的方法，包括在细胞系中表达包含V1/V2结构域的HIV-1包膜蛋白的片段，其中所述方法限定糖基化为甘露糖-5结构的糖基化，并且其中所生产的所述疫苗能够结合于PG9 MAb。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞系是GnT1(-)细胞系。

3.如权利要求1所述的方法，其中使用限制糖基化为甘露糖-5结构的糖基化途径抑制剂处理所述细胞系。

4.如权利要求1所述的方法，其中V1/V2结构域是来自于产自细胞系中的HIV-1 A244株，该细胞系中糖基化被限制为甘露糖-5，并且其中所述的疫苗在V1/V2结构域具有被PG9MAb识别的表位。

5.如权利要求1所述的方法，进一步包括：表达gp120并生产一混合物，所述混合物包括gp120和所述V1/V2片段的混合物，其中V1/V2结构域包含有甘露糖-5，并且其中gp120和所述V1/V2均具有结合PG9MAb的能力，并且其中两种组分均包含于同一制剂，并且被配制成同时对对象进行免疫。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述V1/V2片段被表达为融合蛋白，包括一信号序列、一单纯性疱疹病毒糖蛋白D的氨基酸标记表位，和一3个氨基酸的接头(LLE)。

7.如权利要求1所述的方法，其中HIV-1包膜蛋白片段被工程化成包含两个或多个预测的N-连接的糖基化位点(PNGS)，所述位点选自下组位置：298、301、322和334位，其中所述片段，当表达于标准293细胞中时，能够结合至PG9和PGT128 MAb。

8.如权利要求1所述的方法，其中HIV-1包膜蛋白片段被工程化为包括预测的N-连接的糖基化位点(PNGS)在298和301位，和任选的在332和/或334位置。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述V1/V2片段是ZM233M.PB6(SEQ ID No.16)。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述V1/V2片段选自：SEQ ID No.16、17、18、19、20和12。

11.一种疫苗制剂，包括，含有V1/V2结构域(V1/V2支架)的HIV-1包膜蛋白片段，其中糖基化被限定为甘露糖-5，并且其中V1/V2支架能够与PG9 MAb结合。

12.如权利要求11的所述疫苗制剂，包括V1/V2支架，所述V1/V2支架来自生产于两个或多个细胞系中的HIV-1株，其中，糖基化被限定为甘露糖-5。

13.如权利要求11的所述疫苗制剂，其中所述HIV-1包膜蛋白片段与HSV信号序列和肽接头相连接。

14.如权利要求13的所述疫苗制剂，其中所述肽接头是选自人组织纤溶酶原激活物和ICAM-1。

15.如权利要求11的所述疫苗制剂，其中所述HIV-1包膜蛋白片段被工程化为包括两个或多个的预测的N-连接的糖基化位点(PNGS)，所述位点选自下组位置：298、301、322和334位，其中当所述片段表达于标准293细胞中时，能够结合PG9和PGT128MAb。

16.如权利要求15的所述疫苗制剂，其中所述HIV-1包膜蛋白的所述片段是工程化为包括预测的N-连接的糖基化位点(PNGS)在298和301位、和任选的322和/或334位。

17.如权利要求11的所述疫苗制剂，包括：MN-rgp120经突变(gp120的重组形式)而在289、301、332位和任选的334位含有N-连接的糖基化位点，当MN-rgp120在标准293细胞中表达时具有能够被PG9和PGT128 MAb识别的表位。

18.如权利要求11的所述疫苗制剂，包括其中所述V1/V2片段是ZM233M.PB6(SEQ IDNo.16)。

19.如权利要求11的所述疫苗制剂，包括其中所述V1/V2片段是选自SEQ ID Nos.16、17、18、19、20和12。

20.如权利要求11的所述疫苗制剂，其中所述的HIV-1包膜蛋白片段与免疫原性载体蛋白相连接。

21.一种免疫方法，包括向一对象施用包括gp120和V1/V2片段的制剂，其中在V1/V2结构域包含甘露糖-5，并且两种成分均能够结合PG9 MAb。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，其中所述gp120和所述V1/V2片段包含在同一制剂中，并同时免疫至所述对象。

23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，其中gp120和所述V1/V2片段以基础/加强方案在不同的时间免疫所述对象。

24.如权利要求21所述的方法，其中所述V1/V2片段是ZM233M.PB6(SEQ ID No.16)。

25.如权利要求21所述的方法，其中所述V1/V2片段选自SEQ ID No.16、17、18、19、20和12。

26.如权利要求21所述的方法，其中所述HIV-1包膜蛋白的所述片段被工程化为包括两个或多个的预测的包含N-连接的糖基化位点(PNGS)，所述位点选自下组位置：289、301、332和334位，当所述片段在标准293细胞中表达时能够结合PG9和PGT128 MAb。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述HIV-1包膜蛋白的所述片段被工程化为包括预测的N-连接的糖基化位点(PNGS)，所述位点在298和301位、以及任选的332和/或334位。