CN116157411A - SARS-CoV-2衍生氨基酸序列及其应用 - Google Patents

SARS-CoV-2衍生氨基酸序列及其应用 Download PDF

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Abstract

通过本发明公开的技术，提供一种可用于生产针对新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)衍生蛋白的抗体的氨基酸序列信息。具有本发明中公开的该氨基酸序列信息的合成肽被至少一种哺乳动物识别为抗原，包含以下的氨基酸序列中的任意序列：(1)MKFLVFLGIITTVAA(序列号1)、(2)MFVFLVLLPLVSSQC(序列号2)、(3)MKIILFLALITLATC(序列号3)，所述合成肽的总氨基酸残基数为20以下。

Description

SARS-CoV-2衍生氨基酸序列及其应用
技术领域
本发明涉及能够有助于防止及治疗新型冠状病毒(SARS-CoV-2，severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2)感染蔓延的SARS-CoV-2衍生蛋白的氨基酸序列信息及其应用。
需要说明的是，本申请主张基于2020年7月31日申请的日本专利申请2020-131022号的优先权，该申请的全部内容作为参考并入本说明书中。
背景技术
SARS-CoV-2是一种感染人类并引发COVID-19(Coronavirus disease 2019)的病毒，它是一种会快速引发严重的肺炎等症状，甚至引起感染者死亡的致病性病毒。从2019年12月至2020年初期发现由该病毒引起的感染症以来，该感染扩散至全世界，与目前已知的SARS及MERS等一样，成为对世界经济及人类的生命安全产生严重影响的病毒感染症。
非专利文献1中公开了SARS-CoV-2的基因组序列，能够在NCBI(National Centerfor Biotechnology Information)所公开的数据库中看到该序列。根据该数据库，预测SARS-CoV-2的基因组上存在至少10个基因，病毒学、基因学、生化学、药学等多个领域的研究者正在加快进行研究。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Wu,F.,et al.,Nature,Vol.579,No.7798(2020),pp.265-269
发明内容
发明所要解决的问题
然而，目前，尚未开发出针对SARS-CoV-2的有效的疫苗或抗病毒剂。因此，对感染者的治疗仅限于对症治疗，急需开发针对SARS-CoV-2的疫苗及抗病毒剂。另外，即使SARS-CoV-2的感染蔓延得到抑制，也可能通过如流感病毒一样产生变异而引发进一步感染蔓延，因此期待多种疫苗及抗病毒剂。
为此，本发明就是鉴于上述现状而完成的，其主要目的在于提供一种用于生产针对SARS-CoV-2衍生蛋白的抗体的氨基酸序列信息。具体而言，在于提供一种具有该氨基酸序列信息的合成肽以及具备该合成肽的组合物。相关的其它目的在于提供一种生产使用上述合成肽或组合物的抗SARS-CoV-2抗体的方法。
用于解决问题的技术方案
本发明的本发明人使用可在网上利用的信号肽预测软件SignalP-5.0对SARS-CoV-2的基因组序列中存在的基因序列编码的氨基酸序列进行了分析，结果发现了三种预测具有信号肽的蛋白质。并且，本发明的本发明人推测，对于病毒而言，信号肽是自我增殖所必须的区域，因此进行自我增殖(即，引起感染蔓延)的SARS-CoV-2的信号肽的序列被保存的可能性很大。因此，考虑是否能够通过将具有这些预测信号肽的氨基酸序列的抗原投予哺乳动物等生物而产生以SARS-CoV-2不易产生突变的位点为表位的抗SARS-CoV-2衍生信号肽抗体，并进行了潜心研究。结果成功获得了针对以下的三个氨基酸序列具有高抗体滴度的抗体，从而完成了本发明。
(1)MKFLVFLGIITTVAA(序列号1)、
(2)MFVFLVLLPLVSSQC(序列号2)、
(3)MKIILFLALITLATC(序列号3)。
即，本发明所公开的合成肽是被至少一种哺乳动物识别为抗原的合成肽，其包含上述序列号1～3中任意序列的氨基酸序列，该合成肽的总氨基酸残基数为20以下。
根据该构成，由于上述氨基酸序列被哺乳动识别为外源性异物(抗原)，因此向哺乳动物投予该合成肽后，产生以该合成肽为抗原的抗体。
另外，本发明所公开的组合物是包含被至少一种哺乳动物识别为抗原的部分的组合物，其包含上述序列号1～3中任意序列的氨基酸序列，且具备总氨基酸残基数为20以下的合成肽和载体蛋白。
根据该构成，载体蛋白由于体积大且复杂性高，因此能够提高上述合成肽的免疫原性。
另外，本发明所公开的组合物的一个优选的实施方式中，上述载体蛋白经由规定的交联剂结合在上述序列号1～3中任意序列所示的氨基酸序列的C端侧或N端侧。
根据该构成，合成肽成为远离载体蛋白表面的状态，可以提高产生以合成肽为表位的抗体的几率。
另外，根据该启示，提供一种抗SARS-CoV-2抗体的生产方法。即，本发明所公开的抗SARS-CoV-2抗体的生产方法利用上述序列号1～3中的任意序列的氨基酸信息作为用于生产该抗体的抗原。由此，能够生产针对SARS-CoV-2衍生蛋白的预测信号肽序列的抗体。
另外，本发明所公开的抗体生产方法的一个优选的实施方式中，利用上述序列号1所示的氨基酸序列信息。由此，特别是能够生产抗体滴度高的针对SARS-CoV衍生蛋白的预测信号肽序列的抗体。
附图说明
图1是对在将具备由序列号4的氨基酸序列构成的合成肽和钥孔血蓝蛋白(KLH)的组合物多次投予第一兔子的过程中得到的免疫前血清、第一次及第二次评价用血清的抗体滴度进行评价的图表，其中，所述抗体滴度针对由序列号4的氨基酸序列构成的合成肽。
图2是对在将具备由序列号4的氨基酸序列构成的合成肽和钥孔血蓝蛋白(KLH)的组合物多次投予第一兔子得到的第二次评价用血清、第三次评价用血清及采集全血制备的血清(采集全血时血清)的抗体滴度进行评价的图表，其中，所述抗体滴度针对由序列号4的氨基酸序列构成的合成肽。
图3是对在将具备由序列号4的氨基酸序列构成的合成肽和钥孔血蓝蛋白(KLH)的组合物多次投予第二兔子的过程中得到的免疫前血清、第一次及第二次评价用血清的抗体滴度进行评价的图表，其中，所述抗体滴度针对由序列号4的氨基酸序列构成的合成肽。
图4是对将具备由序列号4的氨基酸序列构成的合成肽和钥孔血蓝蛋白(KLH)的组合物多次投予第二兔子得到的第二次评价用血清、第三次评价用血清及采集全血制备的血清(采集全血时血清)的抗体滴度进行评价的图表，其中，所述抗体滴度针对由序列号4的氨基酸序列构成的合成肽。
图5是对将具备由序列号2的氨基酸序列构成的合成肽和钥孔血蓝蛋白(KLH)的组合物多次投予第三兔子的过程中得到的免疫前血清、第一次及第二次评价用血清的抗体滴度进行评价的图表，其中，所述抗体滴度针对由序列号2的氨基酸序列构成的合成肽。
图6是对将具备由序列号2的氨基酸序列构成的合成肽和钥孔血蓝蛋白(KLH)的组合物多次投予第三兔子得到的第二次评价用血清、第三次评价用血清及采集全血制备的血清(采集全血时血清)的抗体滴度进行评价的图表，其中，所述抗体滴度针对由序列号2的氨基酸序列构成的合成肽。
图7是对将具备由序列号2的氨基酸序列构成的合成肽和钥孔血蓝蛋白(KLH)的组合物多次投予第四兔子的过程中得到的免疫前血清、第一次及第二次评价用血清的抗体滴度进行评价的图表，其中，所述抗体滴度针对由序列号2的氨基酸序列构成的合成肽。
图8是对将具备由序列号2的氨基酸序列构成的合成肽和钥孔血蓝蛋白(KLH)的组合物多次投予第四兔子得到的第二次评价用血清、第三次评价用血清及采集全血制备的血清(采集全血时血清)的抗体滴度进行评价的图表，其中，其中抗体滴度针对由序列号2的氨基酸序列构成的合成肽。
图9是对将具备由序列号3的氨基酸序列构成的合成肽和钥孔血蓝蛋白(KLH)的组合物多次投予第五兔子的过程得到的免疫前血清、第一次及第二次评价用血清的抗体滴度进行评价的图表，其中，所述抗体滴度针对由序列号3的氨基酸序列构成的合成肽。
图10是对将具备序列号3的氨基酸序列构成的合成肽和钥孔血蓝蛋白(KLH)的组合物多次投予第五兔子得到的第二次评价用血清、第三次评价用血清及采集全血制备的血清(采集全血时血清)的抗体滴度进行评价的图表，其中，所述抗体滴度针对由序列号3的氨基酸序列构成的合成肽。
图11是对将具备由序列号3的氨基酸序列构成的合成肽和钥孔血蓝蛋白(KLH)的组合物多次投予第六兔子的过程中得到的免疫前血清、第一次及第二次评价用血清的抗体滴度进行评价的图表，其中，所述抗体滴度针对由序列号3的氨基酸序列构成的合成肽。
图12是对将具备由序列号3的氨基酸序列构成的合成肽和钥孔血蓝蛋白(KLH)的组合物多次投予第六兔子得到的第二次评价用血清、第三次评价用血清及采集全血制备的血清(采集全血时血清)的抗体滴度进行评价的图表，其中，所述抗体滴度针对由序列号3的氨基酸序列构成的合成肽。
具体实施方式
以下，对本发明所公开的技术的优选实施方式进行说明。本说明书中特别提及的事项(例如本发明所公开的合成肽的一级结构及链长)以外的、实施本发明所公开的技术所必须的事项(例如有关肽的化学合成方法、组合物的制备之类的普通事项)可以理解为本领域技术人员基于细胞工程、生理学、医学、药学、有机化学、生化学、基因工程、蛋白质工程、分子生物学、遗传学等领域中的现有技术的设计事项。本发明所公开的技术能够基于本说明书中公开的内容和该领域中的技术常识来实施。需要说明的是，在以下的说明中，氨基酸有时采用依据IUPAC-IUB指南中所示的与氨基酸相关的命名法的单字符表示法(其中，序列表中为三字符表示法)来表示。
另外，本说明书中引用的全部文献的全部内容作为参考并入本说明书中。
在本说明书中，“合成肽”是指其肽链并非仅独立地稳定存在于自然界中，而是能够通过人为化学合成或者生物合成(即基于基因工程生产)制造并能够稳定存在于规定体系(例如包含佐剂的组合物)中的肽片段。
其中，“肽”是表示具有多个肽键的氨基酸聚合物的术语，不受肽链中所含的氨基酸残基数量限定，但典型而言是指总氨基酸残基数大致为100以下(优选为80以下，更优选为70以下，例如60以下)的分子量较小的物质。
另外，在本说明书中，只要没有特别说明，则“氨基酸残基”是包括肽链的N端氨基酸及C端氨基酸的术语。
另外，在本说明书中，“偶联物”是指在上述合成肽上通过共价键连接有载体蛋白及其它成分(交联剂、Cys残基)的生成物(构建物)，包括在本发明所公开的组合物之中。
需要说明的是，本说明书中所述的氨基酸序列始终左侧为N端侧，右侧为C端侧。
本发明所公开的合成肽包含NCBI中所公开的SARS-CoV-2的基因组所编码的蛋白质的预测信号肽序列。即，合成肽包含以下氨基酸序列中的任意序列：
(1)MKFLVFLGIITTVAA(序列号1)、
(2)MFVFLVLLPLVSSQC(序列号2)、
(3)MKIILFLALITLATC(序列号3)。
序列号1的氨基酸序列与SARS-CoV-2的蛋白质ORF8 protein所衍生的由共15个氨基酸残基构成的预测信号肽对应。
序列号2的氨基酸序列与SARS-CoV-2的蛋白质surface glycoprotein所衍生的由共15个氨基酸残基构成的预测信号肽对应。
序列号3的氨基酸序列与SARS-CoV-2的蛋白质ORF7a protein所衍生的由共15个氨基酸残基构成的预测信号肽对应。
这些氨基酸序列是SARS-CoV-2特有的序列，因此，对于以哺乳动物为主的生物而言，容易将其识别为外源性的异物(抗原)，通过对以哺乳动物为主的生物投予上述合成肽，能够促进产生针对以上氨基酸序列的抗体。
另外，只要是被至少一种哺乳动物识别为抗原的包含序列号1～3中任意氨基酸序列的合成肽，则该合成肽可以包含除序列号1～3中任意氨基酸序列以外的序列。例如，可以在序列号1的氨基酸序列的C端侧包含与上述ORF8 protein的预测信号肽的C端侧相邻而连续编码的氨基酸序列，另外，也可以在序列号2的氨基酸序列的C端侧包含与上述的surfaceglycoprotein的预测信号肽的C端侧相邻而连续编码的氨基酸序列，但没有特别限定。同样，还可以在序列号3的氨基酸序列的C端侧包含与上述的ORF7a protein的预测信号肽的C端侧相邻而连续编码的氨基酸序列。另外，例如可举出如序列号4、5的氨基酸序列那样在序列号1的氨基酸序列的N端侧或C端侧添加有Cys残基的序列等。
序列号4的氨基酸序列是在SARS-CoV-2的蛋白质ORF8 protein所衍生的由共15个氨基酸残基构成的预测信号肽(序列号1)的C端侧添加有Cys残基的序列。
序列号5的氨基酸序列是在SARS-CoV-2的蛋白质ORF8 protein所衍生的由共15个氨基酸残基构成的预测信号肽(序列号1)的N端侧添加有Cys残基的序列。
通过如序列号4、5那样在序列号1的氨基酸序列的N端侧或C端侧添加Cys残基，能够使Cys残基的侧链上包含的硫醇基(SH基)与交联剂中可包含的马来酰亚胺进行反应，容易使合成肽与交联剂结合。
本发明所公开的合成肽的总氨基酸残基数为20以下较为合适。在多于20的情况下，在投予哺乳动物等生物时，可能产生以序列号1～3中任意氨基酸序列以外的序列为表位的抗体。另外，从限定作为表位的位点的观点出发，总氨基酸残基数可以为19以下、18以下、17以下、16以下，也可以仅由序列号1～3中的任意氨基酸序列构成。
另外，本发明所公开的合成肽的N端的氨基可以被N-乙酰化。通过将N端的氨基酸残基进行N-乙酰化，能够提高合成肽的溶解性。
本发明所公开的合成肽能够基于普通化学合成法容易地制造。例如，可以采用现有公知的固相合成法或液相合成法中的任意合成法。使用Boc(t-butyloxycarbonyl：叔丁氧羰基)或者Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl：9-芴基甲氧基羰基)作为氨基的保护基的固相合成法比较合适。
或者，还可以基于基因工程方法来合成合成肽。即，合成用于编码所需合成肽的氨基酸序列的核苷酸序列(包含ATG起始密码子)的多核苷酸(典型地为DNA)。再根据宿主细胞构建具有表达用基因构建物的重组载体，其中，所述表达用基因组构建物由合成的多核苷酸(DNA)和用于使该氨基酸序列在宿主细胞内表达的各种调节元件(包括启动子、核糖体结合位点、终止子、增强子、调控表达水平的各种顺式元件)组成。
通过普通方法将该重组载体转导至规定的宿主细胞(例如酵母、昆虫细胞、植物细胞)，在规定的条件下培养该宿主细胞或包含该细胞的组织或个体。由此，能够在细胞内表达及生产目标肽。然后，从宿主细胞中(分泌的情况下则是从培养基中)分离肽，并根据需要进行重折叠和精制等，由此能够得到目标抗病毒性肽。
需要说明的是，重组载体的构建方法及将所构建的重组载体向宿主细胞转导的方法等直接采用目前该领域中进行的方法即可，这些方法自身不特别用于表征本发明中所公开的技术，故不予赘述。
或者，能够构建无细胞蛋白质合成系统用的模板DNA(即包含编码合成肽的氨基酸序列的核苷酸序列的合成基因片段)，使用肽合成所需的各种化合物(ATP、RNA聚合酶、氨基酸类等)，采用所谓的无细胞蛋白质合成系统体外合成目标多肽。关于无细胞蛋白质合成系统，参见例如Shimizu等人的论文(Shimizu et al.,Nature Biotechnology,19,751-755(2001))、Madin等人的论文(Madin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97(2),559-564(2000))。基于这些论文中记载的技术，在本申请的申请时已经有很多企业进行了多肽的委托生产，另外，无细胞蛋白质合成用试剂盒(例如，可以由日本的(株)CellFree Sciences公司获得)也在市场上销售。
包含编码本发明所公开的合成肽的核苷酸序列和/或与该序列互补的核苷酸序列的单链或双链的多核苷酸能够通过现有公知方法容易地制造(合成)。即，通过选择与构成所设计的氨基酸序列的各氨基酸残基相对应的密码子，容易地确定并提供与合成肽的氨基酸序列对应的核苷酸序列。并且，一旦确定了核苷酸序列，则能够利用DNA合成机等容易地获得与所需的核苷酸序列对应的多核苷酸(单链)。并且还可以将得到的单链DNA用作模板，采用各种酶合成手段(典型地为PCR)来获得所需的双链DNA。另外，多核苷酸可以为DNA的形式，也可以为RNA(mRNA等)的形式。DNA可以按照双链或单链提供。在按照单链提供的情况下，其可以为编码链(正义链)，也可以为与其互补的序列的非编码链(反义链)。
如上所述，这样得到的多核苷酸可以在各种宿主细胞中或在无细胞蛋白质合成系统中作为用于构建重组基因组(表达盒)的材料使用，其中，所述重组基因组(表达盒)用于生产合成肽。
本发明所公开的合成肽被至少一种哺乳动物识别为抗原，可以促进识别该合成肽的抗体(IgM、IgG等)的产生。需要说明的是，合成肽只要被至少一种哺乳动物识别为抗原，则也可以为盐的形式。例如，能够使用可以按照常规方法添加常用的无机酸或有机酸并使其反应而得到的该肽的酸加成盐。或者，只要被至少一种哺乳动物识别为抗原，则也可以为其它盐(例如金属盐)。本说明书及权利要求书中记载的“肽”包括该盐形式的物质。
本发明所公开的合成肽也可以作为具备载体蛋白的组合物的一部分而提供。即，本发明所公开的组合物是包含被至少一种哺乳动物识别为抗原的部分的组合物，其具备包含以下的氨基酸序列中的任意序列且总氨基酸残基数为20以下的合成肽和载体蛋白：
(1)MKFLVFLGIITTVAA(序列号1)、
(2)MFVFLVLLPLVSSQC(序列号2)、
(3)MKIILFLALITLATC(序列号3)。
载体蛋白的种类没有特别限定，例如，具有抗原性刺激的KLH(Keyhole limpethemocyanin：钥孔血蓝蛋白)或OVA(ovalbumin：卵白蛋白)或者BSA(Bovine SerumAlbumin：牛血清白蛋白)等均能够适当地使用。
作为本发明所公开的组合物的一个优选实施方式，经由规定的交联剂在上述合成肽的C端侧或N端侧结合有载体蛋白。
作为上述交联剂，能够使用通常用于肽交联的具有同双官能团或杂双官能团的物质。作为上述交联剂的优选的反应性官能团，可举出各种含胺化合物(例如伯胺)、硫代基或其它含硫基团、羧基及羟基。作为反应性官能团的具体示例，可举出：N-羟基琥珀酰亚胺活化酯(NHS酯)、马来酰亚胺、叠氮化物及碘乙酰胺等。上述NHS酯能够在中性以上的pH下与胺高效反应，并形成非常稳定的酰胺键。另外，上述马来酰亚胺的反应是SH基选择性的，在中性时与SH基的反应性比胺优异。
作为具有同双官能团的合适的交联剂，可举出：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)、二(磺基琥珀酸亚酰胺)辛二酸酯(BS3)、二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)(DSP)、二硫双(磺基琥珀酰亚胺丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(磺基-EGS)、二琥珀酰亚胺酒石酸盐(DST)、二磺基琥珀酰亚胺酒石酸盐(磺基-DST)等。特别是能够优选使用二(磺基琥珀酸亚酰胺)辛二酸酯(BS3)。
另外，作为具有杂双官能团的合适的交联剂，能够优选使用：O-[N-(3-马来酰亚胺丙酰基)氨基乙基]-O’-[3-(N-琥珀酰亚胺氧基)-3-氧代丙基]二十七烷乙二醇等聚乙二醇(PEG)衍生物、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、琥珀酰亚胺4-[马来酰亚胺苯基]丁酸酯(SMPB)、琥珀酰亚胺4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)、间马来酰亚胺丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MPS)及N-琥珀酰亚胺(4-碘化乙酰)氨基苯甲酸酯(SIAB)等。特别是能够优选使用反应性官能团中具备NHS酯和马来酰亚胺的PEG。PEG除能提高对于水和人类体液的溶解性之外，还具有几乎不显示免疫原性的性质。并且，PEG难以在人体内的液体中分解。因此，具有包含PEG的交联剂的偶联物能够适当地被用作投予生物的抗原。
合成肽与交联剂结合的位置没有特别限定，优选N端侧或C端侧。由此，合成肽成为远离载体蛋白表面的状态，可以提高产生以合成肽为表位的抗体的几率。
在交联剂结合于合成肽的N端侧的情况下，如果合成肽序列上没有N端的氨基以外的氨基(即，如果没有Lys残基)，则能够使例如交联剂中所含的NHS酯与合成肽的N端的氨基高效反应，但没有特别限定。另外，当Cys残基仅存在于合成肽的N端或C端时，能够选择性使该Cys残基的硫醇基与交联剂中所含的马来酰亚胺进行反应，因此能够使交联剂所结合的位置为N端或C端。需要说明的是，如序列号1所示的氨基酸序列所示，在不包含Cys残基的情况下，可以向N端或C端添加Cys残基。由此，能够在N端或C端结合具有马来酰亚胺的交联剂。
包含本发明所公开的序列号1～3中任意序列所示的氨基酸序列的合成肽或组合物能够用于生产抗SARS-CoV-2抗体。其中，优选使用包含序列号1所示的氨基酸序列的合成肽或组合物。包含序列号1所示的氨基酸序列的合成肽或组合物对哺乳动物的抗原性特别高，因此能够用于产生具有更高抗体滴度的抗体。
作为本发明所公开的合成肽和组合物的典型使用方法的一个示例，可举出疫苗，能够用于针对SARS-CoV-2的予防接种及治疗药物等。另外，作为其它典型示例，可举出：将上述合成肽和组合物作为抗原投予哺乳动物等生物，从而生产用于识别该合成肽的抗体。
待免疫的哺乳动物使用豚鼠、大鼠、小鼠、兔子、山羊等实验动物，但为了获得单克隆抗体或者多克隆抗体，大鼠、小鼠、兔子比较合适。免疫方法可以使用例如皮下、腹腔内、静脉内、肌肉内、皮内等任意投予途径，主要优选皮下、皮内、腹腔内、静脉内注入。另外，免疫间隔、免疫量等也没有特别限制，可以使用各种方法，例如，广泛使用如下方法：按照2周间隔免疫约2～10次，最终免疫之后，优选约2～7天后从生物体内采集标本约1～5次。另外，免疫量并不限定一次投予的肽量，例如，优选每只兔子使用大约50～300μg。另外，第一次将具备合成肽和载体蛋白的偶联物与佐剂(例如，FCA(Freund'scomplete adjuvant：弗氏完全佐剂))充分混合后投予小鼠的腹腔内，使细胞增殖，按照2周间隔再次将该偶联物与佐剂(例如，FCA或FIA(Freund's incomplete adjuvant：弗氏完全佐剂))充分混合后投予腹腔内，并采集腹水，由此能够高效地获得对于上述合成肽的高抗体滴度的单克隆抗体或多克隆抗体，但没有特别限制。需要说明的是，目标单克隆抗体或多克隆抗体的精制能够通过亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤法、硫酸铵析法等公知的方法进行。
作为本发明所公开的合成肽和组合物，只要该合成肽被至少一种哺乳动物识别为抗原，则可以根据使用形式包含药学(医药)上可接受的各种载体。例如，能够使用在肽系药物中通常用作稀释剂、赋形剂等的载体。
上述载体根据包含上述载体的合成肽和组合物的用途及形式略有不同，典型地可举出：水、生理学缓冲液、各种有机溶剂。另外，可以为适当浓度的醇(乙醇等)水溶液、甘油、橄榄油之类的不干性油。或者也可以为脂质体。另外，作为可包含在上述组合物中的次要成分，可举出：各种填充剂、增量剂、偶合剂、增湿剂、表面活性剂、色素、香料、佐剂等。
作为包含上述载体的合成肽和组合物的典型形式，可举出：液剂、悬浮剂、乳剂、气溶胶、泡沫剂、颗粒剂、粉末剂、片剂、胶囊、软膏、水性凝胶剂等。另外，为了用于注射等，也能够制成用于在即将使用之前将其溶解在生理盐水或适当的缓冲液(例如PBS)等中以制备药液的冷冻干燥物、造粒物。
需要说明的是，将合成肽(主成分)及各种载体(副成分)作为材料制备各种形式的组合物(药剂)的工艺本身依据现有公知的方法即可，该制法本身并不表征本发明所公开的技术，故不予赘述。作为与处方相关的详细的信息源，可举出例如ComprehensiveMedicinal Chemistry,Corwin Hansch监制，Pergamon Press刊(1990)。该书籍的全部内容作为参考引用在本说明书中。
以下，对于本发明所公开的技术相关的多个试验例进行说明，但并非旨在将本发明所公开的技术显示为如该试验例所示。
[表1]
Figure BDA0004113589990000121
<肽的合成>
分别使用市售的肽合成机制造由表1所示的氨基酸序列构成的肽。具体如下所述。
样品1是序列号4所示的氨基酸序列的合成肽，该合成肽在序列号1的氨基酸序列的C端侧添加有Cys残基。
样品2是序列号2所示的氨基酸序列的合成肽。
样品3是序列号3所示的氨基酸序列的合成肽。
上述样品1～3的肽均使用市售的肽合成机按照手册实施固相合成法(Fmoc法)而合成。需要说明的是，肽合成机的使用方案本身并不表征本发明所公开的技术，故不予赘述。需要说明的是，样品1及2的N端氨基酸的氨基已经乙酰化。
<使用肽制作偶联物>
使用作为交联剂的一端具有马来酰亚胺且另一端具有NHS酯的聚乙二醇(PEG)，将样品1的合成肽和作为载体蛋白的钥孔血蓝蛋白(KLH)结合，从而制作偶联物。将其进行结合的反应自身并不表征本发明所公开的技术，故不予赘述，简单而言，通过使KLH所具有的氨基与上述交联剂的NHS酯进行反应，在KLH的表面上结合上述交联剂，然后，使上述交联剂的马来酰亚胺和上述合成肽的C端侧所存在的Cys残基的硫醇基进行反应并结合，从而制作各合成肽和KLH经由PEG结合而成的偶联物。另外，针对样品2及3的合成肽，也通过与样品1相同的方法制作偶联物。
<产生以偶联物为抗原的抗体>
将样品1的偶联物投予2只日本白色种的兔子(以下，在区分兔子个体时，也将这些兔子分别称为第一兔子和第二兔子)，从而制作针对样品1的合成肽的抗体。另外，为了评价后述的抗体滴度，适当对上述兔子进行采血。具体而言，在第一天(以下，记录以该天为标准的天数)投予样品1的偶联物前，进行5ml试采血，并制备免疫前血清。另外，同一天将样品1的偶联物0.15mg和等容量的FCA(Freund'scomplete adjuvant：弗氏完全佐剂)混合而成的组合物皮内投予上述兔子(第一次皮内投予)。第15天时，将样品1的偶联物0.3mg和等容量的FCA混合而成的组合物皮内投予上述兔子(第二次投予)。第29天时，将样品1的偶联物0.3mg和等容量的FCA混合而成的组合物投予上述兔子(第三次投予)。第36天时，从上述兔子中进行5ml试采血，从而制备第一次评价用血清。第43天时，将样品1的偶联物0.3mg和等容量的FCA混合而成的组合物皮内投予上述兔子(第四次投予)。第50天时，从上述兔子中进行5ml试采血，从而制备第二次评价用血清。第57天时，将样品1的偶联物0.3mg和等容量的FCA混合而成的组合物皮内投予上述兔子(第五次投予)。第64天，从上述兔子中进行5ml试采血，从而制备第三次评价用血清。第71天时，将样品1的偶联物0.3mg和等容量的FCA混合而成的组合物皮内投予上述兔子(第六次投予)。第78天，从上述兔子中采集全血，制备采集全血时血清。需要说明的是，制备时，向所制备的免疫前血清、第一次～第三次评价用血清及采集全血时血清中添加叠氮化钠使其达到0.09％后进行保存。
针对样品2及3的偶联物，也按照与样品1的偶联物相同的方法分别投予2只兔子，从而制备免疫前血清、第一次～第三次评价用血清及采集全血时血清。需要说明的是，为了区分兔子个体，将投予样品2的偶联物的2只兔子分别作为第三兔子、第四兔子，将投予样品3的偶联物的2只兔子分别作为第五兔子、第六兔子。
<血清的抗体滴度评价>
通过ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay：酶联免疫吸附测定)法评价免疫前血清、第一次～第三次评价用血清及采集全血时血清的抗体滴度。
首先，将样品1的合成肽溶解于pH7.2的PBS(Phosphate-Buffered Saline：磷酸盐缓冲液)，使其达到5μg/ml，分别向免疫板的各孔中添加100μl，并在室温下孵育2小时。接着，除去各孔中的液体之后，用包含0.2％Tween-20(Polyoxyethylene(20)SorbitanMonolaurate：聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，富士胶片和光纯药株式会社制)的PBS(清洗液)清洗3次。然后，将该清洗液添加在各孔中，在4℃下孵育一晚。孵育后，使用包含0.05％Tween-20的PBS(稀释液)对样品1的免疫前血清、第一次～第三次评价用血清及采集全血时血清分别进行1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、16000倍、32000倍、64000倍、128000倍稀释，除去各孔的上述清洗液之后，将各稀释液100μl分别添加到另外的孔中，在37℃下孵育30分钟之后，再在室温下孵育15分钟。除去各孔的液体之后，用上述清洗液进行3次清洗，将goat f(ab)’2anti rabbit IgG’s HRP conjugate(HRP标记的山羊f(ab)’2抗兔IgG’s)(MP Biomedicals,LLC-Cappel Products公司制)用上述稀释液稀释5000倍之后，分别向各孔中添加100μl，在37℃下孵育30分钟，然后在室温下孵育15分钟。除去各孔的液体之后，用上述清洗液清洗3次，将OPD(O-phenylene diamin(邻苯二胺)，SIGMA公司制)10mg溶解在柠檬酸-磷酸缓冲液25ml中，向各孔中分别添加100μl已加入过氧化氢5μl的底物液。然后，在室温下显色20分钟，通过向各孔中分别加入100μl 1M硫酸停止显色，然后使用ImmnoReader测定各孔的490nm的吸光度。将其结果示于图1～4。图1及2示出从第一兔子得到的血清的ELISA法的结果，图3及4示出从第二兔子得到的血清的ELISA法的结果。
样品2及3的免疫前血清、第一次～第三次评价用血清及采集全血时血清的抗体滴度的评价也通过与样品1的血清的抗体滴度的评价相同的方法进行。其结果示于图5～12。图5及6示出从第三兔子得到的血清的ELISA法的结果，图7及8示出从第四兔子得到的血清的ELISA法的结果。另外，图9及10示出从第五兔子得到的血清的ELISA法的结果，图11及12示出从第六兔子得到的血清的ELISA法的结果。
需要说明的是，在本说明书中，若490nm的吸光度超过0.5，则评价为确保了抗体滴度(具有良好的抗体滴度)。另外，在上述吸光度超过Immno Reader的测定上限的情况下(在上述吸光度超过3.0的情况下)，表示为吸光度3.0。
如图1～2所示，第一兔子通过反复投予样品1的偶联物，针对样品1的合成肽的抗体滴度升高，远远超过吸光度0.5，因此确认得到了包含保证了充分抗体滴度的IgG抗体的血清。
如图3～4所示，第二兔子通过反复投予样品1的偶联物，针对样品1的合成肽的抗体滴度提升，远远超过吸光度0.5，因此确认得到了包含确保了充分抗体滴度的IgG抗体的血清。
如图5～6所示，第三兔子即使反复投予样品2的偶联物，也无法得到确保对于样品2的合成肽的抗体滴度的血清。然而，如图7～8所示，在第四兔子中，通过反复投予样品2的偶联物，能够得到超过吸光度0.5的血清。因此表明，通过投予样品2的偶联物，能够得到包含确保针对样品2的合成肽的抗体滴度的IgG抗体的血清。
如图9～10所示，第五兔子即使反复投予样品3的偶联物，也不能得到确保了对于样品3的合成肽的抗体滴度的血清。然而，如图11～12所示，在第六兔子中，通过反复投予样品3的偶联物，在采集全血时血清中，能够得到远远超过吸光度0.5的结果。因此表明，通过投予样品3的偶联物，能够得到包含确保了针对样品3的合成肽的抗体滴度的IgG抗体的血清。
比较这些结果可知，在样品1～3的氨基酸序列之中，通过将具有由样品1的氨基酸序列构成的合成肽的偶联物投予兔子，能够得到抗体滴度特别高的抗体。因此，通过利用序列号1的氨基酸序列，能够产生抗体滴度更高的抗体。
以上详细示出了本发明所公开的技术的具体示例，但这些仅是示例，并不用于限定权利要求。权利要求书中所述的技术也包括对以上示例的具体示例进行各种变形及变更后的技术。
产业上的可利用性
如上所述，通过将本发明所公开的合成肽和组合物(偶联物)投予哺乳动物，能够使哺乳动物产生识别该合成肽的抗体滴度高的抗体。因此，本启示所提供的合成肽和组合物能够用作针对SARS-CoV-2的疫苗。另外，所产生的抗体能够形成针对SARS-CoV-2的抗病毒剂，也能够用于SARS-CoV-2检测及标记等。
序列表自由文本
序列号4～5合成肽
序列表
<110> 东亚合成株式会社
国立大学法人京都大学
<120> SARS-CoV-2衍生氨基酸序列及其应用
<130> TG21-004PCT
<150> JP 2020-131022
<151> 2020-07-31
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 1
Met Lys Phe Leu Val Phe Leu Gly Ile Ile Thr Thr Val Ala Ala
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 2
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 3
Met Lys Ile Ile Leu Phe Leu Ala Leu Ile Thr Leu Ala Thr Cys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Met Lys Phe Leu Val Phe Leu Gly Ile Ile Thr Thr Val Ala Ala Cys
1 5 10 15
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Cys Met Lys Phe Leu Val Phe Leu Gly Ile Ile Thr Thr Val Ala Ala
1 5 10 15

Claims (5)

1.一种合成肽，其特征在于：
其被至少一种哺乳动物识别为抗原，并包含以下氨基酸序列中的任意序列，所述合成肽的总氨基酸残基数为20以下，
(1)MKFLVFLGIITTVAA(序列号1)、
(2)MFVFLVLLPLVSSQC(序列号2)、
(3)MKIILFLALITLATC(序列号3)。
2.一种组合物，其特征在于：
其包含被至少一种哺乳动物识别为抗原的部分，并具备总氨基酸残基数为20以下的合成肽和载体蛋白，
所述合成肽包含以下氨基酸序列中的任意序列：
(1)MKFLVFLGIITTVAA(序列号1)、
(2)MFVFLVLLPLVSSQC(序列号2)、
(3)MKIILFLALITLATC(序列号3)。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于：
经由规定的交联剂在所述序列号1～3中的任意序列所示的氨基酸序列的C端侧或N端侧结合有所述载体蛋白。
4.一种抗SARS-CoV-2抗体的生产方法，其特征在于：
作为用于生产该抗体的抗原，利用以下氨基酸序列中的任意序列的氨基酸信息：
(1)MKFLVFLGIITTVAA(序列号1)、
(2)MFVFLVLLPLVSSQC(序列号2)、
(3)MKIILFLALITLATC(序列号3)。
5.如权利要求4所述的抗体生产方法，其特征在于：
其利用所述序列号1的氨基酸信息。
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